龍遠雄，韓蜜，2，朱鎮(zhèn)華，陳鎮(zhèn)，鄧桂明（.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 40007；2.湖南省腫瘤醫(yī)院，湖南 長沙 4003）

鼻咽癌是一種鱗狀上皮細胞癌，與其他腫瘤相比，具有明顯的地理分布特征，據(jù)統(tǒng)計全球約一半病例來自中國，其中以嶺南地區(qū)居多[1-2]。目前鼻咽癌的病因尚未完全明確，現(xiàn)代醫(yī)學認為其發(fā)生是多因素、多基因以及多步驟綜合作用的結(jié)果，與EB病毒感染、遺傳、環(huán)境因素密切相關(guān)。放療是治療鼻咽癌行之有效的方法，但放療存在敏感性低、毒副作用大（如口腔黏膜損傷、腹脹腹痛）等弊端，被患者排斥[3]。中醫(yī)藥與放療等西醫(yī)相結(jié)合治療鼻咽癌具有減毒增效作用。因此，本研究對中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)庫（Wanfang）、維普中文科技期刊（VIP）等數(shù)據(jù)庫中有關(guān)中醫(yī)藥治療鼻咽癌的臨床研究文獻進行挖掘，總結(jié)用藥規(guī)律，聚類形成新方，基于網(wǎng)絡藥理學探討新方可能的作用機制，以期為鼻咽癌的治療與新藥研發(fā)等提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與檢索策略以中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)源、維普中文科技期刊為數(shù)據(jù)來源。中國知網(wǎng)：選擇高級檢索，檢索格式：（主題=經(jīng)驗）OR（主題=驗方）OR（主題=醫(yī)案）AND（主題=鼻咽癌）；萬方數(shù)據(jù)庫：選擇專業(yè)檢索，檢索格式：主題：（“經(jīng)驗”O(jiān)R“驗方”O(jiān)R“醫(yī)案”）AND 主題：（鼻咽癌）；維普數(shù)據(jù)庫：選擇高級檢索，選擇題名或關(guān)鍵詞，檢索式：“醫(yī)案”O(jiān)R“驗方”O(jiān)R“經(jīng)驗”AND“鼻咽癌”。文獻發(fā)表時間從建庫至2023年2月15日。

1.2 納入標準①中醫(yī)藥治療鼻咽癌的臨床隨機對照試驗或者臨床觀察，觀察對象符合《腫瘤中醫(yī)診療指南（ZYYXH/T 136-156-2008）》[4]中鼻咽癌的診斷標準等（癥見鼻塞、鼻衄、流涕或涕中帶血、耳鳴及耳聾，頭痛等，CT、MRI、間接鼻咽鏡檢查、鼻咽纖維鏡檢查等觀察具體部位的異常及結(jié)構(gòu)改變；病理學診斷：結(jié)節(jié)型、菜花型、黏膜下浸潤型和潰瘍型腫塊等）。②結(jié)果報告臨床療效確切；③干預措施為中藥內(nèi)服方劑，涉及的中藥處方組方完整。

1.3 排除標準①診斷標準不明確的文獻；②單味中藥處方；③非臨床治療類文獻，如動物實驗等；④重復發(fā)表的文獻僅納入其中1篇。

1.4 數(shù)據(jù)預處理將藥物名稱按照《中國藥典》[5]或《中藥學》[6]進行標準化，保證一藥一名。如“麥門冬”標準化為“麥冬”。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析應用中醫(yī)傳承輔助平臺（V2.5）進行數(shù)據(jù)挖掘，統(tǒng)計高頻藥物、藥對，通過關(guān)聯(lián)規(guī)則與熵聚類方法分析形成新方，根據(jù)新方功效，結(jié)合中華中醫(yī)藥學會《腫瘤中醫(yī)診療指南》[7]中鼻咽癌4個主要證型（熱邪犯肺證、肝郁痰凝證、血瘀阻絡證和氣陰兩虛證），選擇最具研究意義的新方開展網(wǎng)絡藥理學研究[7]。

1.6 新方1 有效化合物及作用靶點查詢通過TCMSP平臺（http://lsp，nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索中藥成分，根據(jù)口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18 篩選有效化合物，通過其MOL ID 號檢索各成分作用靶點，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）檢索靶點基因名。對TCMSP數(shù)據(jù)庫未載入的中藥通過Herb數(shù)據(jù)庫（http://www.herb.org/）檢索有效成分，通過SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch）數(shù)據(jù)庫預測其有效靶點。

1.7 鼻咽癌靶點的預測在GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中輸入“Nasopharyngeal carcinoma”獲取鼻咽癌靶點。并與新方1 靶點取交集，得到治療鼻咽癌的相關(guān)靶點。

1.8 “化合物-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建將交集靶點導入Cytoscape 3.7.1 軟件，形成化合物-靶點網(wǎng)絡圖，并利用“NetworkAnalyzer”進行分析，篩選出作用于鼻咽癌的關(guān)鍵化合物。

1.9 蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建及核心靶點篩選將交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建交集靶點蛋白互作（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡。借助Cytoscape 3.7.1對網(wǎng)絡進行拓撲分析，選取連接度（Degree）、介數(shù)（Betweenness）、中心度（Closeness）均大于均值的靶點為核心靶點。

1.10 GO 功能及KEGG 通路富集分析將交集靶點導入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp），進行GO 功能富集和KEGG 通路分析，并用微生信平臺進行可視化處理。

1.11 分子對接將篩選的關(guān)鍵化合物（小分子）與核心靶蛋白進行對接。靶蛋白X射線晶體結(jié)構(gòu)來自PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫?；衔镄》肿咏Y(jié)構(gòu)來源于TCMSP 數(shù)據(jù)庫。使用Autodock Vina 1.2.0 進行分子對接。選取最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象分析相互作用，利用PyMOL 2.2.0生成對接可視化圖。若結(jié)合能小于-5 kcal·mol-1表示具有較好的結(jié)合活性，小于-7 kcal·mol-1表示具有強烈的結(jié)合活性[8]。

2 結(jié)果

共檢索到749篇文獻，按納入和排除標準進行篩選，最終得到102 篇文獻，從中提取有效治療處方115首，涉及中藥271味。

2.1 藥物頻次統(tǒng)計在271味藥物中，累計使用頻次1 457 次，使用頻次排前5 位的中藥依次為甘草、麥冬、玄參、生地黃、白花蛇舌草。治療鼻咽癌高頻中藥（頻次≥10次）共45味。見表1。

表1 治療鼻咽癌的高頻藥物統(tǒng)計（頻次≥10 次）Table 1 High frequency drug statistics for the treatment of nasopharyngeal carcinoma（frequency≥10）

2.2 中藥功效分類統(tǒng)計對271味按中藥功效進行分類[6]，可分為18 類。見表2。使用頻次排前5 位的依次為補虛藥、清熱藥、解表藥、化痰止咳平喘、活血化瘀藥，其使用頻率合計占比為79.34%。

表2 治療鼻咽癌的中藥功效類別頻數(shù)統(tǒng)計Table 2 Frequency statistics of traditional Chinese medicine categories for treating nasopharyngeal carcinoma

2.3 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析將支持度個數(shù)設為12，置信度設為0.6，得到常用核心藥對25 組（見表3），強關(guān)聯(lián)藥物組合14個（見表4），核心藥物關(guān)聯(lián)圖譜見圖1。

圖1 治療鼻咽癌的核心藥物關(guān)聯(lián)圖譜Figure 1 The association map of core drugs for the treatment of nasopharyngeal carcinoma

表3 治療鼻咽癌的核心藥對統(tǒng)計Table 3 Statistics of core drug pairs for the treatment of nasopharyngeal cancer

表4 治療鼻咽癌的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果表（置信度≥0.6）Table 4 Analysis results of association rules for the treatment of nasopharyngeal cancer（Confidence level ≥0.6）

2.4 基于熵聚類的核心組合及新方組合分析根據(jù)篩選出的治療鼻咽癌方劑數(shù)量、綜合臨床用藥經(jīng)驗進行判斷及不同參數(shù)提取數(shù)據(jù)的預讀[9]，選擇相關(guān)度為4，懲罰度為2，進行層次聚類分析，得到治療鼻咽癌方劑中271味中藥兩兩之間的關(guān)聯(lián)度，其中基于復雜系統(tǒng)熵聚類，演化出3 味藥的核心組合共計14 個。在以上核心組合的基礎上，進行無監(jiān)督熵層次聚類，有8 個核心組合參與聚類（見表5），得到4 個新處方（見表6），并利用中醫(yī)傳承輔助平臺（V2.5）的網(wǎng)絡展示功能進行展示，見圖2。

圖2 治療鼻咽癌新處方藥物網(wǎng)絡展示Figure 2 Network display of new prescriaption drugs for treating nasopharyngeal carcinoma

表5 治療鼻咽癌新方聚類的核心組合Table 5 Core combinations of new prescription clustering for the treatment of nasopharyngeal carcinoma

表6 基于無監(jiān)督熵層次聚類治療鼻咽癌的新處方Table 6 New prescription for nasopharyngeal carcinoma based on unsupervised entropy hierarchical clustering

2.5 新方1 的網(wǎng)絡藥理學研究

2.5.1新方1 有效化合物及靶點 新方1 中藥組成為麥冬、生地黃、玄參、黃芪、女貞子、枸杞子。獲得麥冬有效化合物4個，對應靶點156個；生地黃有效化合物23 個，對應靶點304 個；玄參有效化合物9 個，對應靶點36 個；黃芪有效化合物21 個，對應靶點214 個；女貞子有效化合物13 個，對應靶點182 個；枸杞有效化合物15 個，對應靶點64 個。去重后，新方1有效化合物79個，靶點數(shù)430個。

2.5.2新方1 治療鼻咽癌的疾病靶點預測 檢索獲得鼻咽癌相關(guān)靶點數(shù)2 161 個。將新方1 獲得的430 個靶點，與鼻咽癌2 161個靶點基因比對，獲取交集靶點165個，其可能是治療鼻咽癌的相關(guān)靶點，對應的活性化合物60個，可能為新方1治療鼻咽癌的有效成分。

2.5.3化合物-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建與分析結(jié)果 利用Cytoscape 3.7.1 軟件對60 個活性化合物和165 個靶點構(gòu)建化合物-鼻咽癌靶點網(wǎng)絡（見圖3），并利用Network Analyzer 功能對網(wǎng)絡進行分析，將連接度（Degree）＞10的化合物視為新方1治療鼻咽癌的關(guān)鍵化合物，共獲得10個化合物。見表7。

圖3 新方1 有效化合物-鼻咽癌靶點的網(wǎng)絡圖Figure 3 Network diagram of effective compounds of New Prescription 1-targets of nasopharyngeal cancer

表7 新方1 治療鼻咽癌的關(guān)鍵化合物（Degree＞10）Table 7 Key compounds of New Prescription 1 for the treatment of nasopharyngeal cancer（Degree＞10）

2.5.4蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選 在165 個交集靶點的PPI 網(wǎng)絡中，有161 個靶點間存在互作關(guān)系（見圖4），拓撲分析顯示網(wǎng)絡中Degree、Betweenness、Closeness 值均大于平均值（分別為44.23、0.566、0.005）的靶點共39 個（見表8），這些靶點可能是新方1的主要作用靶點。

圖4 治療鼻咽癌的交集靶點蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡圖Figure 4 PPI network diagram of intersection target protein for the treatment of nasopharyngeal cancer

表8 新方1 治療鼻咽癌的關(guān)鍵靶點Table 8 Key targets of New Prescription 1 for the treatment of nasopharyngeal cancer

2.5.5GO 功能與KEGG 通路富集分析結(jié)果 GO 功能分析富集得到518 個條目（P＜0.01），包括生物過程（BP）417 個、細胞組成（CC）37 個和分子功能（MF）64 個。KEGG 通路富集得到信號通路141 條（P＜0.01）。選擇富集顯著性（按P值升序）排前10 位的生物進程、分子功能、細胞組成，以及排前15 位的通路進行展示。結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 中醫(yī)藥治療鼻咽癌的GO 功能富集分析Figure 5 GO enrichment analysis results of TCM for the treatment of nasopharyngeal cancer

圖6 中醫(yī)藥治療鼻咽癌的KEGG 富集分析Figure 6 KEGG enrichment analysis results of TCM for the treatment of nasopharyngeal cancer

2.5.6分子對接 將新方1 中Degree 值最高的3 個核心活性成分和前3 個靶點蛋白進行分子對接。見表9。結(jié)果顯示，活性成分與靶點蛋白的結(jié)合能均小于-5 kcal·mol-1，其中配體槲皮素與受體TP53（SER-269）形成氫鍵，齊墩果酸與TP53（ASP-268）、AKT1（LYS-154）、TNF（LYS-65）形成氫鍵，結(jié)合能均小于-7 kcal·mol-1，表明其結(jié)合力較強，對接模型見圖7。

圖7 核心活性成分與靶點蛋白的對接模型Figure 7 Visualization of the docking between key compounds and core targets

表9 中醫(yī)藥治療鼻咽癌的核心活性成分與靶點蛋白對接結(jié)果Table 9 Molecular docking results of core active ingredients of TCM for the treatment of nasopharyngeal cancer and target proteins

3 討論

鼻咽癌歸屬于中醫(yī)學“矢榮”“巖”“上石疽”等范疇[10]。中醫(yī)認為其產(chǎn)生多因正氣內(nèi)虛、外感邪毒、內(nèi)傷七情等致臟腑功能失常，而產(chǎn)生氣郁、血瘀、痰濁等病理產(chǎn)物，日久漸積而成，其病機以本虛標實為特點。現(xiàn)代醫(yī)家對中醫(yī)藥治療鼻咽癌的理論和臨床進行了大量探索，積累了豐富的辨治經(jīng)驗，由于中醫(yī)治療各有特色，其用藥規(guī)律需進一步歸納整理，因此，本研究運用中醫(yī)輔助傳承平臺挖掘中醫(yī)藥治療鼻咽癌的用藥規(guī)律。

本研究共獲得中醫(yī)藥治療鼻咽癌的有效處方115 首，涉及中藥271 味，累計使用頻次1 457 次，使用頻次排前5 位的中藥依次為甘草、麥冬、玄參、生地黃、白花蛇舌草。甘草具有補脾益氣，緩急止痛的功效，在處方配伍中能調(diào)和諸藥，常作為使藥。同時，甘草具有抗腫瘤的作用，所含的異甘草素能誘導腫瘤細胞凋亡和自噬，調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路以抑制腫瘤細胞生長[11]。麥冬為養(yǎng)陰生津之品。研究[12]發(fā)現(xiàn)麥冬可促進唾液分泌，改善放療后的陰虛癥狀。玄參滋陰降火，解毒散結(jié)，所含玄參多糖能抑制腫瘤細胞活性、增強機體免疫功能[13]。生地黃與玄參同屬于清熱涼血養(yǎng)陰之品，可用于熱毒熾盛鼻咽癌患者的治療。白花蛇舌草清熱解毒，所含多糖對鼻咽癌細胞增殖有顯著的抑制作用，且其水提物能提高鼻咽癌患者放療的臨床療效，具有增敏作用[14]。根據(jù)藥物功效的不同，治療鼻咽癌的中藥可分為18 類，其中補虛藥比例最高，占32.33%，體現(xiàn)治療鼻咽癌的關(guān)鍵在于扶正補虛，大量運用健脾補中益氣中藥，包括甘草、黃芪、白術(shù)等。清熱藥次之，占比為26.97%。鼻咽癌初期患者，易出現(xiàn)火毒郁結(jié)、毒熱內(nèi)阻，病性為實，可以使用玄參、生地黃、白花蛇舌草等清熱藥治療。其后依次為解表藥、化痰藥、活血化瘀藥等。鼻咽癌的高危人群以正虛為主，因正氣虧虛，外因六淫之邪可乘虛而入，故以解表藥以祛之。當疾病進一步惡化時，會伴有明顯的夾熱夾瘀、火毒郁結(jié)、痰濁結(jié)聚、氣血瘀阻等癥狀，此時，應予以活血化瘀、化痰散結(jié)之治法，故在鼻咽癌的治療中補虛藥、清熱藥、解表藥、化痰藥、活血化瘀藥最為常用。

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，麥冬、玄參、生地黃兩兩組合使用頻率較高，且3味藥之間形成的關(guān)聯(lián)規(guī)則也具有較高的置信度，如生地黃，玄參→麥冬的置信度最高，說明這3味藥組合使用最常見。該組合即為增液湯，凸顯清熱涼血養(yǎng)陰之功效，常用于鼻咽癌化療后陰虛證的治療。藥對麥冬-甘草、玄參-甘草、麥冬-太子參，以及關(guān)聯(lián)規(guī)則：玄參、甘草→麥冬，太子參→麥冬，體現(xiàn)了益氣健脾、養(yǎng)陰生津的治法；石斛-麥冬疏清虛熱、補益脾胃；黃芪-甘草健脾補氣；麥冬-南沙參養(yǎng)陰清熱、益胃生津；黃芪-白術(shù)、黨參-白術(shù)等益氣健脾，燥濕利水；連翹→金銀花清熱解毒?；跓o監(jiān)督熵層次聚類生成了4個新方，其中新方1由麥冬、生地黃、玄參、黃芪、女貞子、枸杞子組成，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津、益氣健脾利濕、補益肝腎等功效。新方2清熱解毒、養(yǎng)陰潤燥、生津止渴；新方3健脾化濕、溫中和胃；新方4清熱解毒、健脾滲濕、補益脾胃、破血行氣。綜合高頻藥物、功效歸類及藥物關(guān)聯(lián)特點，總結(jié)推斷中醫(yī)藥治療鼻咽癌以益氣養(yǎng)陰、清熱解毒為主，兼顧活血化瘀，強調(diào)脾胃、肝腎同調(diào)，重視健脾益胃、補益肝腎、滲濕利水等治法。

鼻咽癌治法以益氣養(yǎng)陰、清熱解毒為主，結(jié)合新方1所體現(xiàn)的清熱益氣養(yǎng)陰的功效，故以新方1為例開展網(wǎng)絡藥理學研究。通過網(wǎng)絡藥理學分析，獲得新方1 治療鼻咽癌的有效化合物60 個，關(guān)鍵化合物10 個，作用于鼻咽癌靶點165 個，核心靶點39 個，排前3位的關(guān)鍵化合物為槲皮素、齊墩果酸、木樨草素，排前3 位的核心靶點為TP53、AKT1、TNF。槲皮素為黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化等作用，能通過調(diào)控抑癌基因的表達，影響腫瘤細胞生命周期[15]；齊墩果酸能抑制腫瘤微循環(huán)，預防腫瘤形成，能劑量依賴性抑制鼻咽癌細胞增殖[16]。同時能逆轉(zhuǎn)放化療耐藥性，調(diào)節(jié)免疫功能等。木樨草素能通過調(diào)節(jié)信號通路、阻滯細胞周期來抑制腫瘤細胞生長，還可以改變絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等活性抑制癌細胞浸潤[17]。TP53 抑瘤基因為各類腫瘤常見核心靶點之一，TP53 在應激條件下激活后，可以啟動腫瘤細胞凋亡程序，抑制細胞增殖與腫瘤血管生成，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[18]；AKT1 是一種抗凋亡蛋白激酶，能促進腫瘤細胞侵襲、加速腫瘤轉(zhuǎn)移，在其變異情況下可提高鼻咽癌患病風險[19]；TNF對鼻咽癌的作用表現(xiàn)為雙重調(diào)控機制，既有抗瘤活性，又能作為內(nèi)源性的腫瘤促進因子，可刺激腫瘤細胞生長、增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[20]。

GO 功能與KEGG 通路富集分析得到新方1 號治療鼻咽癌有顯著性影響的條目518 個、信號通路141 條，涉及到RNA聚合酶II啟動子的順向調(diào)控、細胞凋亡的負向調(diào)控等生物過程，還涉及到癌癥傳導、PI3K-AKt 信號傳導、AGE-RAGE 信號傳導、MAPK 信號傳導、EBV 感染等重要信號通路。其中PI3K-Akt 信號通路作為生長因子調(diào)控細胞增殖和存活的重要通路，可參與癌細胞增殖、分化、遷移、凋亡等過程，與鼻咽癌的發(fā)生及預后有密切聯(lián)系[8]。研究[21]發(fā)現(xiàn)癌細胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成能力與AGE-RAGE、PI3K-Akt 信號通路介導的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。MAPK信號轉(zhuǎn)導通路可將細胞外化學信號傳遞至細胞內(nèi)，引起細胞內(nèi)部一系列生物學反應，參與細胞分化、增殖、凋亡和血管生成等調(diào)節(jié)。MAPK 通路中的數(shù)個蛋白在人類癌癥中存在突變、擴增或缺失，促進癌細胞增殖、生存等[22]。EB病毒感染與鼻咽癌密切相關(guān)，它可與多條通路相互作用導致腫瘤細胞增殖分化，共同參與抑制免疫、病毒潛伏、整合基因、侵襲轉(zhuǎn)移、抑制凋亡等生物過程[23]。

分子對接實驗結(jié)果顯示，新方1的關(guān)鍵成分與核心靶點形成了多組相互作用力，如齊墩果酸分別與核心靶點TP53、AKT1、TNF 的結(jié)合位點ASP-268、LYS-154、LYS-65形成了氫鍵，在這些相互作用力的作用下，蛋白小分子復合物的結(jié)合能小于-7 kcal·mol-1，其結(jié)合能較強，表明它們在治療鼻咽癌方面可能發(fā)揮重要作用。

綜上，本研究了總結(jié)中醫(yī)藥治療鼻咽癌的用藥規(guī)律，通過網(wǎng)絡藥理學研究與分子對接驗證探討了數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果形成的新方在鼻咽癌治療中可能的作用機制。網(wǎng)絡藥理學研究結(jié)果表明新方1可能通過槲皮素、齊墩果酸、木樨草素等關(guān)鍵成分作用于鼻咽癌TP53等核心靶點，影響RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等生物學過程及癌癥通路、PI3K-Akt 通路等，發(fā)揮治療鼻咽癌的作用。本研究可為鼻咽癌的中醫(yī)藥治療與新藥研發(fā)提供一定的參考。