雷潔瓊 田迎霞 李正果 王興東

(甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院腫瘤醫(yī)院 1介入治療科,甘肅 蘭州 730050;2特需科)

肝癌是成年人中最常見的原發(fā)性肝癌,其惡性度高且預(yù)后差。在肝癌的許多治療選擇中,完整的腫瘤切除術(shù)是最好的治療策略之一〔1〕。對于不能手術(shù)的肝癌患者,化學(xué)療法是用于治療肝癌的選擇之一,但藥物功效仍然有限〔2〕。因此,迫切需要開發(fā)化學(xué)療法或化學(xué)預(yù)防方法來管理肝癌。葡萄籽提取物原花青素是由兒茶素和(或)表兒茶素聚合而成的二聚體、三聚體、四聚體和低聚物/聚合物的混合物〔3〕。迄今為止,葡萄籽提取物原花青素被證明在肝癌〔4〕、食管癌〔5〕、胰腺癌〔6〕、肺癌〔7〕等癌癥中顯示出一定的抗腫瘤活性,然而,葡萄籽提取物原花青素在肝癌中發(fā)揮的分子機(jī)制卻鮮為人知。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是參與許多生物學(xué)功能過程的重要因素,包括惡性腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展,如肝癌〔8〕。LncRNA NBR2位于眾所周知的腫瘤抑制基因乳腺癌易感基因(BRCA)1附近,在不同器官中廣泛表達(dá)。研究表明,LncRNA NBR2通過激活單磷酸腺苷激活的蛋白激酶和使哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路失活,介導(dǎo)姜黃素抑制大腸癌增殖的功能〔9〕。LncRNA NBR2在肝癌細(xì)胞中低表達(dá),具有抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移的作用〔10〕。LncRNA NBR2在骨肉瘤組織中的表達(dá)下調(diào),LncRNA NBR2過表達(dá)可以通過抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程來抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移〔11〕。但是,沒有關(guān)于LncRNA NBR2是否介導(dǎo)葡萄籽提取物原花青素在肝癌惡性腫瘤中的作用和機(jī)制的信息。因此,本研究使用葡萄籽提取物原花青素處理肝癌細(xì)胞Hep3B,進(jìn)行體外測定,并分析涉及的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 葡萄籽提取物原花青素(原花青素含量>95%)購自天津尖峰,肝癌細(xì)胞Hep3B購自美國ATCC細(xì)胞庫,si-NC、si-LncRNA NBR2、anti-miR-NC、anti-miR-650、miR-NC、miR-650購自上海GenePharma,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8購自日本DojindoLaboratories,RNAiso Plus、PrimeScript RT、SYBR Master Mix試劑盒購自日本TaKaRa。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 整個實(shí)驗(yàn)過程肝癌細(xì)胞Hep3B使用RPMI1640培養(yǎng)基,在37 ℃的培養(yǎng)箱中,95%空氣和5% CO2的潮濕環(huán)境下,在RPMI1640培養(yǎng)基中添加了10%胎牛血清(FBS),100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。將肝癌細(xì)胞Hep3B分為NC組、低、中、高劑量組、si-NC組、si-LncRNA NBR2組、si-NC+高劑量組、si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組。NC組未使用任何處理,低、中、高劑量組分別使用含25、50、100 μg/ml葡萄籽提取物原花青素的培養(yǎng)基處理48 h。將肝癌細(xì)胞Hep3B以每孔2×105個細(xì)胞接種在12孔板中。密度達(dá)到80%時,根據(jù)Invitrogen制造商的操作手冊,使用Lipofectamine2000試劑盒進(jìn)行si-NC、si-LncRNA NBR2、anti-miR-NC、anti-miR-650瞬時轉(zhuǎn)染。6 h后根據(jù)分組,更換培養(yǎng)基為包含或不包含高劑量(100 μg/ml)葡萄籽提取物原花青素的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h備用。

1.3Western印跡檢測蛋白表達(dá) Western印跡中使用的一抗包括抗細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-肌動蛋白(actin)。首先將肝癌細(xì)胞Hep3B在放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液中裂解。使用二喹啉甲酸(BCA)方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,然后將其加載到1×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上進(jìn)行分離。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯膜上,依次將其與一抗孵育(抗β-actin的稀釋度為1∶2 000,其他抗體的稀釋度為1∶1 000)。清洗膜后,使用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(山羊抗兔IgG,1∶5 000)在室溫下孵育2 h。之后,添加增強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光(ECL),并使用凝膠成像分析系統(tǒng)以β-actin作為內(nèi)部參考來檢測每個條帶的光密度值。

1.4CCK-8分析細(xì)胞增殖 肝癌細(xì)胞Hep3B經(jīng)1.2中處理后,接種到96孔板中,每孔5×104個細(xì)胞。將肝癌細(xì)胞Hep3B培養(yǎng)48 h,10 μl CCK-8試劑被添加至孔中并反應(yīng)2 h,用酶標(biāo)儀讀取每個孔450 nm處吸光度A值,表示肝癌細(xì)胞增殖能力。

1.5Transwell法分析細(xì)胞遷移與侵襲 使用基質(zhì)膠(侵襲)或不含基質(zhì)膠(遷移)的Transwell室檢測細(xì)胞侵襲與遷移能力。收集2.5×105個肝癌細(xì)胞Hep3B,重懸于200 μl無血清培養(yǎng)基中,并添加到Transwell上部隔室中。將500 μl含10% FBS的培養(yǎng)基添加到下部隔室中,24 h后取出小室,用棉簽擦拭小室上表面的細(xì)胞,固定和染色發(fā)生侵襲或遷移的肝癌細(xì)胞Hep3B,顯微鏡下統(tǒng)計(jì)侵襲或遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.6定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測LncRNA NBR2、miR-650的表達(dá) 通過RNAiso Plus試劑從肝癌細(xì)胞Hep3B中提取總RNA,并使用PrimeScript RT試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在Bio-Rad CFX96系統(tǒng)中使用SYBR Master Mix和特定引物進(jìn)行qRT-PCR。用2-ΔΔCt法分析LncRNA NBR2與β-actin的相對水平及miR-650與U6的相對水平。NBR2正向引物5′-GAGGTCTCCAGTTTCGGTAA-3′;反向5′-GAACCAAGGTGAAGGACCAA-3′。β-actin正向引物5′-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3′;反向5′-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3′。miR-650正向引物5′-AGAGGAGGCAGCGCTCT-3′;反向5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。U6正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;反向5′-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3′。

1.7雙熒光素酶活性檢測 在starbase軟件中預(yù)測LncRNA NBR2和miR-650的靶向結(jié)合區(qū)域。構(gòu)建含有miR-650結(jié)合位點(diǎn)的LncRNA NBR2-野生型(WT)及突變型(MUT)報告基因載體WT(LncRNA NBR2)及MUT(LncRNA NBR2),在肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-650和WT(LncRNA NBR2)或MUT(LncRNA NBR2),在雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后的熒光素酶活性檢測。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1葡萄籽提取物原花青素對肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用 見圖1、表1。低、中、高劑量組Hep3B細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)量、增殖能力、遷移和侵襲數(shù)量均顯著低于NC組(P<0.05)。

表1 葡萄籽提取物原花青素對肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

1～10:NC組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、si-NC組、si-LncRNA NBR2組、si-NC+高劑量組、si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組

2.2葡萄籽提取物原花青素處理后LncRNA NBR2上調(diào),miR-650下調(diào)表達(dá) 見表2,低、中、高劑量組葡萄籽提取物原花青素作用的肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞中LncRNA NBR2表達(dá)量分別約為NC組的1.35、1.79、2.37倍,miR-650表達(dá)量分別約為NC組的0.89、0.67、0.48倍,低、中、高劑量組與NC組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 LncRNA NBR2低表達(dá)減弱葡萄籽提取物原花青素對肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制影響

表3 miR-NC或miR-650與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

2.3LncRNA NBR2低表達(dá)減弱葡萄籽提取物原花青素對肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制影響 見圖1、表2。si-LncRNA NBR2組Hep3B細(xì)胞中LncRNA NBR2表達(dá)量約為si-NC組的0.46倍,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)量依次約為si-NC組的1.59、1.52、1.44倍,并且細(xì)胞增殖能力、遷移和侵襲數(shù)量均比si-NC組高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。si-LncRNA NBR2+高劑量組Hep3B細(xì)胞中LncRNA NBR2表達(dá)量約為si-NC+高劑量組的0.56倍,但CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)量和增殖能力、遷移和侵襲數(shù)量均高于si-NC+高劑量組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4LncRNA NBR2靶向調(diào)控miR-650的表達(dá) starbase對LncRNA NBR2和miR-650結(jié)合的預(yù)測結(jié)果見圖2。WT(LncRNA NBR2)熒光素酶活性在miR-NC組與miR-650組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),MUT(LncRNA NBR2)熒光素酶活性在miR-NC組與miR-650組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。si-NC組、si-LncRNA NBR2組、pcDNA-NC組、pcDNA-LncRNA NBR2組Hep3B細(xì)胞miR-650表達(dá)量依次為1.00±0.10、1.88±0.12、1.02±0.09、0.46±0.03,si-NC組與si-LncRNA NBR2組之間、pcDNA-NC組與pcDNA-LncRNA NBR2組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 通過starbase對LncRNA NBR2和miR-650結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意

2.5anti-miR-650可以逆轉(zhuǎn)LncRNA NBR2低表達(dá)影響葡萄籽提取物原花青素對肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 見圖1、表4。anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組Hep3B細(xì)胞CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白、LncRNA NBR2表達(dá)量及增殖能力、遷移和侵襲數(shù)量均低于anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 anti-miR-650可以逆轉(zhuǎn)LncRNA NBR2低表達(dá)影響葡萄籽提取物原花青素對肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

2.6EMT通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 見表5、圖3。高劑量組或anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞中E-Cadherin蛋白表達(dá)量高于NC組或anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組,N-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量低于NC組或anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組,高劑量組與NC組之間、anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組和anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而si-LncRNA NBR2+高劑量組E-Cadherin蛋白表達(dá)量低于si-NC+高劑量組,N-Cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量高于si-NC+高劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 Western印跡檢測E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)

1～6:NC組、高劑量組、si-NC+高劑量組、si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組

3 討 論

葡萄籽提取物原花青素?fù)碛锌寡趸?2〕、抗炎〔13〕、降血糖〔14〕、保護(hù)心肌〔15〕、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能〔16〕。最近,葡萄籽提取物原花青素已被證明可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、周期、凋亡等過程抑制各種癌癥的進(jìn)展〔4～7〕,如葡萄籽中的原花青素被發(fā)現(xiàn)以濃度和時間依賴方式抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖〔17〕。葡萄籽提取物原花青素F2能夠減慢膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和血管生成發(fā)揮抗腫瘤活性〔18〕。親脂性葡萄籽原花青素導(dǎo)致前列腺癌PC3細(xì)胞增殖受阻,這可以通過減少CyclinD1和CDK4的表達(dá)并增加腫瘤抑制因子p21和p27的表達(dá)來證實(shí)〔19〕。最新研究顯示,葡萄籽原花青素抑制肝癌細(xì)胞HepG2的生存能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G2/M期細(xì)胞周期停滯,并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白B1、MMP水平〔4〕。本研究中,葡萄籽提取物原花青素同樣表現(xiàn)出抗肝癌細(xì)胞Hep3B增殖的作用。此外,葡萄籽提取物原花青素還可抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。作為研究較多的MMP,MMP-2和MMP-9以其在癌細(xì)胞侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用而備受關(guān)注。MMP-2和MMP-9的下調(diào)證實(shí)了葡萄籽提取物原花青素的肝癌細(xì)胞Hep3B遷移、侵襲抑制活性?？傊?這些結(jié)果表明,葡萄籽提取物原花青素對肝癌具有抑制作用。

LncRNA NBR2已被證明是一種肝癌發(fā)生發(fā)展的抑制因子〔10〕。根據(jù)報道,LncRNA NBR2通過靶向下調(diào)miRNA-21抑制大腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲〔20〕。本研究中,LncRNA NBR2低表達(dá)使肝癌細(xì)胞Hep3B增殖、侵襲和遷移顯著增強(qiáng),與相關(guān)蛋白CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)的上調(diào)相一致,而這些蛋白水平進(jìn)一步證明了LncRNA NBR2低表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞Hep3B增殖和轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)表明,LncRNA NBR2在肝癌中用作抑癌基因,并抑制肝癌細(xì)胞Hep3B的增殖,侵襲和遷移,與前人研究〔10〕相符。此外,葡萄籽提取物原花青素可顯著增加肝癌細(xì)胞Hep3B中LncRNA NBR2的表達(dá)。當(dāng)LncRNA NBR2低表達(dá)時,葡萄籽提取物原花青素對肝癌細(xì)胞Hep3B的抑制作用被減弱。這些結(jié)果表明葡萄籽提取物原花青素通過調(diào)節(jié)LncRNA NBR2的水平來調(diào)節(jié)肝癌進(jìn)程。

本研究生物信息學(xué)分析后,miR-650被確定為LncRNA NBR2的靶標(biāo)。在先前的研究中,miR-650在肝癌中高度上調(diào)〔21〕,miR-650表達(dá)增加與肝癌患者的不良臨床特征密切相關(guān),并且miR-650起促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用〔22〕?？梢妋iR-650是肝癌的致癌因子,加速肝癌進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn),LncRNA NBR2低表達(dá)減弱葡萄籽提取物原花青素對肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用可被anti-miR-650所逆轉(zhuǎn)。結(jié)合雙熒光素酶活性檢測和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中LncRNA NBR2對miR-650的靶向負(fù)調(diào)控作用,證明葡萄籽提取物原花青素影響肝癌進(jìn)程與上調(diào)LncRNA NBR2靶向下調(diào)miR-650有關(guān)。

腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化的重要特征之一是細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型細(xì)胞的過程,其在癌癥轉(zhuǎn)移和多纖維化疾病中起著重要的作用〔23〕。在EMT期間,上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin被下調(diào),而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(例如N-cadherin和Vimentin)表達(dá)的增加,可能導(dǎo)致細(xì)胞侵襲和遷移特性的增強(qiáng)〔24〕。獲得間質(zhì)細(xì)胞樣特性后,腫瘤細(xì)胞可從原發(fā)組織擴(kuò)散開,這是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟〔25〕。因此本研究檢查了EMT過程標(biāo)志蛋白的水平,發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物原花青素通過上調(diào)E-cadherin、下調(diào)N-cadherin和Vimentin水平對肝癌細(xì)胞Hep3B的EMT進(jìn)程起抑制作用。我們進(jìn)一步研究了LncRNA NBR2/miR-650可能的下游信號通路。正如先前的研究表明,LncRNA NBR2的過表達(dá)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的N-cadherin和VimentinmRNA表達(dá),并增加了腫瘤組織中E-cadherin的mRNA表達(dá)〔11〕,此外,N-cadherin和Vimentin在LncRNA NBR2過表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中被下調(diào),E-cadherin被上調(diào)〔23〕,可見LncRNA NBR2可以抑制EMT進(jìn)展。另外,LncRNA NBR2低表達(dá)減弱了葡萄籽提取物原花青素抑制肝癌細(xì)胞Hep3B EMT的作用,而這些作用又被anti-miR-650所逆轉(zhuǎn),這些表明葡萄籽提取物原花青素可以通過LncRNA NBR2調(diào)節(jié)miR-650有效抑制EMT進(jìn)程,從而抑制肝癌的發(fā)展。

綜上,葡萄籽提取物原花青素通過LncRNA NBR2/miR-650途徑調(diào)節(jié)EMT發(fā)揮對肝癌進(jìn)展的抑制作用,這些數(shù)據(jù)為葡萄籽提取物原花青素抑制腫瘤提供了進(jìn)一步的證據(jù),并可能為肝癌治療提供新的見解。未來仍需要進(jìn)一步的研究來說明葡萄籽提取物原花青素在體內(nèi)腫瘤模型中的作用。