齊見(jiàn)旭 歐宗興 李英 王心曉

(海口市人民醫(yī)院 1呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,海南 ?？?570208;2重癥醫(yī)學(xué)科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見(jiàn)的進(jìn)行性發(fā)展呼吸系統(tǒng)非傳染性疾病,特點(diǎn)是呼吸氣流受限、肺部出現(xiàn)慢性炎癥,臨床表現(xiàn)有咳嗽、氣短、呼吸困難等〔1〕。至2020年,COPD居于我國(guó)死亡原因第3位,全球死亡原因第4位,且患病率仍在持續(xù)上升〔2〕。COPD的發(fā)病率、致殘率和死亡率都很高,且容易復(fù)發(fā)。COPD的病因尚不明確,目前已知的高危致病因素有吸煙、空氣污染、長(zhǎng)期暴露于可吸入顆粒物環(huán)境下、呼吸道感染、家族病史等〔3～6〕,這些也是常見(jiàn)的對(duì)肺功能造成負(fù)面影響的因素。研究〔7〕表明COPD患者患病初期氣道和肺組織就已出現(xiàn)炎癥。中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等與炎癥相關(guān)的細(xì)胞受到外界或內(nèi)部條件影響釋放出炎癥因子,激活多種細(xì)胞信號(hào)通路,損傷肺部細(xì)胞,破壞肺結(jié)構(gòu)〔8〕。臨床常用糖皮質(zhì)激素對(duì)COPD患者進(jìn)行治療,可有效減輕COPD患者的炎癥反應(yīng),能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝和免疫系統(tǒng),還能影響血液系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)〔9〕。因其藥理作用繁多,糖皮質(zhì)激素在機(jī)體內(nèi)的具體作用機(jī)制還未被研究透徹。核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信號(hào)通路具有保護(hù)線粒體、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用〔10〕,可能參與了糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)機(jī)體的作用過(guò)程。本研究通過(guò)檢測(cè)COPD模型大鼠機(jī)體內(nèi)Nrf2/HO-1通路相關(guān)指標(biāo)水平變化與表達(dá)情況探究糖皮質(zhì)激素對(duì)COPD氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只雄性SD大鼠,體質(zhì)量200～230 g,購(gòu)自陜西省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(陜)2018-0009。大鼠自由進(jìn)食飲水,在23～26 ℃、濕度30%～50%環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理指導(dǎo)守則進(jìn)行操作。

1.2試劑 香煙(中華牌,焦油量10 mg,尼古丁含量0.9 mg,一氧化碳含量10 mg),脂多糖(貨號(hào)SMB00704,美國(guó)Sigma公司),吸入用布地奈德混懸液(普米克令舒,國(guó)藥準(zhǔn)字H20140475,AstraZeneca Pty Ltd),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào)C0105S)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)P0012,上海碧云天生物技術(shù)有限公司),Masson三色法染色試劑盒(貨號(hào)M029,上海歌凡生物科技有限公司),大鼠C-反應(yīng)蛋白(CRP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)GV-E13446,上海極威生物科技有限公司),大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6(貨號(hào)ml064292)、IL-8(貨號(hào)ml002885)、大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α(貨號(hào)ml002859)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司),降鈣素原(PCT)ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)H151-1)、總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)A001-3-2)、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)A007-1-1)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)A003-1-2,南京建成生物工程研究所),兔Nrf2抗體(貨號(hào)12721)、兔HO-1抗體(貨號(hào)86806,美國(guó)Cell Signaling Technology公司),小鼠β-actin抗體、兔二抗抗體、小鼠二抗抗體、化學(xué)發(fā)光液(ECL,美國(guó)Thermo Fisher公司),其他試劑均為市售分析純。

1.3儀器 動(dòng)物煙熏箱、FM系統(tǒng)動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司),BRM-085Ⅱ型壓縮霧化吸入機(jī)(百瑞醫(yī)療科技有限公司),光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司),DNP-9272 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海甘易儀器設(shè)備有限公司),HBS-1096C 酶標(biāo)分析儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),AU480全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司),LF-Mini4型小型垂直電泳槽(北京龍方科技有限公司),eBlotTML1快速濕轉(zhuǎn)儀(南京金斯瑞生物科技有限公司),TS-2000型脫色搖床(江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司),接觸式無(wú)損定量成像儀(上海易孛特光電技術(shù)有限公司)。

1.4分組與造模 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、糖皮質(zhì)激素低劑量組和糖皮質(zhì)激素高劑量組,每組12只。采用煙熏聯(lián)合氣管滴注脂多糖的方法建立COPD模型。對(duì)照組正常呼吸潔凈空氣,建模大鼠除滴注脂多糖當(dāng)天不進(jìn)行煙熏,之后每日在煙熏箱內(nèi)接受內(nèi)置10支煙、為期30 min的煙熏,總共煙熏35 d。第1、14、28天麻醉全部大鼠,建模大鼠經(jīng)氣道滴注濃度為1 mg/ml的200 μl脂多糖,對(duì)照組經(jīng)氣道滴注200 μl的生理鹽水。36 d使用動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)各組大鼠1 s用力呼吸容積(FEV1)和用力肺活量(FVC)的值,并計(jì)算FEV1和FVC的比值,FEV1/FVC<0.7提示造模成功〔11〕。造模成功后開(kāi)始讓糖皮質(zhì)激素低、高劑量組每日吸入布地奈德氣霧劑,劑量分別為0.5 mg和2 mg,吸入時(shí)長(zhǎng)15 min,對(duì)照組與模型組每日吸入霧化的生理鹽水,吸入時(shí)長(zhǎng)與糖皮質(zhì)激素低、高劑量組相同,持續(xù)2 w。

1.5大鼠肺功能檢測(cè) 給藥結(jié)束后再次檢測(cè)各組FEV1和FVC的值,并計(jì)算FEV1和FVC的比值。

1.6HE染色觀察肺組織形態(tài) 處死大鼠后取出兩肺,取部分肺組織用生理鹽水沖洗干凈,放入4%多聚甲醛中固定,經(jīng)脫水后石蠟包埋,制成4 μm厚的石蠟切片。按照HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行HE染色,在光鏡下觀察各組大鼠肺組織形態(tài)。

1.7血清中炎性因子水平檢測(cè) 分離大鼠腹主動(dòng)脈,采集動(dòng)脈血并按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行樣本前處理與實(shí)驗(yàn)操作,檢測(cè)大鼠動(dòng)脈血血清中CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α水平。

1.8血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 按照生化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行樣本前處理與實(shí)驗(yàn)操作,檢測(cè)大鼠動(dòng)脈血血清中SOD、CAT、MDA水平。

1.9Masson法檢測(cè)大鼠肺組織纖維化程度 取石蠟切片,按照Masson三色法染色試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行Masson染色,在光鏡下觀察并拍攝各組肺組織纖維化結(jié)果,用ImageJ軟件計(jì)算Masson染色中藍(lán)色膠原纖維面積的百分比。

1.10Western印跡檢測(cè)肺組織中Nrf2、HO-1表達(dá) 取肺組織制成勻漿,加入適量的預(yù)冷蛋白裂解液,充分混合后置入冰盒內(nèi)低溫孵育2 h。裂解完成后將勻漿放入低溫離心機(jī)內(nèi),在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min,取上清液進(jìn)行BCA定量,制成總蛋白含量相同的Western印跡上樣。凝膠電泳分離樣品蛋白,轉(zhuǎn)膜,截取目的條帶,浸于5%脫脂奶粉制成的封閉液中,放到搖床上室溫封閉1 h。加入1∶500稀釋的一抗孵育液,充分搖勻后于4 ℃環(huán)境下過(guò)夜。平衡至室溫后洗膜,加入1∶5 000稀釋的對(duì)應(yīng)二抗孵育液,室溫孵育2 h,洗膜后加入ECL,避光反應(yīng)5 min,用定量成像儀收集結(jié)果。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組外觀變化與肺功能檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組大鼠外觀與實(shí)驗(yàn)前無(wú)明顯變化,呼吸正常,口鼻無(wú)明顯分泌物。模型組毛色泛黃無(wú)光澤,出現(xiàn)咳嗽的情況,口鼻有濃稠分泌物。糖皮質(zhì)激素低、高劑量組較模型組情況有所改善,毛色較為正常,咳嗽癥狀減輕,口鼻分泌物減少。肺功能檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組、糖皮質(zhì)激素低、高劑量組肺功能指標(biāo)均明顯下降(P<0.05);與模型組相比,糖皮質(zhì)激素低、高劑量組肺功能指標(biāo)均明顯上升(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組肺功能檢測(cè)結(jié)果

2.2各組肺組織HE染色結(jié)果 與對(duì)照組相比,模型組肺泡、肺泡管、肺泡囊出現(xiàn)膨脹融合現(xiàn)象,管腔內(nèi)存在黏液與炎性細(xì)胞;與模型組相比,糖皮質(zhì)激素低、高劑量組肺組織結(jié)構(gòu)更完整,管腔內(nèi)黏液與炎性細(xì)胞相對(duì)減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肺組織(HE染色,×400)

2.3血清中CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、CAT、MDA水平比較 與對(duì)照組相比,模型組、糖皮質(zhì)激素低、高劑量組CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、MDA水平均明顯上升,SOD、CAT水平明顯下降(P<0.05);與模型組相比,糖皮質(zhì)激素低、高劑量組CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、MDA水平均明顯下降,SOD、CAT水平明顯上升(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、CAT、MDA水平比較

2.4各組肺組織纖維化程度 與對(duì)照組相比,模型組、糖皮質(zhì)激素低、高劑量組肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化,纖維化程度明顯提高,膠原纖維面積明顯增大(P<0.05);與模型組相比,糖皮質(zhì)激素低、高劑量組肺組織結(jié)構(gòu)更完好,纖維化程度降低,膠原纖維面積明顯減小(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組肺組織(Masson染色,×200)

表3 各組肺組織膠原纖維面積、Nrf2、HO-1表達(dá)水平比較

2.5肺組織中Nrf2、HO-1表達(dá)情況 與對(duì)照組相比,模型組、糖皮質(zhì)激素低、高劑量組Nrf2、HO-1表達(dá)量均明顯上升(P<0.05);與模型組相比,糖皮質(zhì)激素低、高劑量組Nrf2、HO-1表達(dá)量均明顯上升(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)各組肺組織中Nrf2、HO-1表達(dá)

3 討 論

COPD的主要發(fā)病機(jī)制為肺部結(jié)構(gòu)的慢性炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激〔12〕?；颊唧w內(nèi)的中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞被外界刺激或內(nèi)部條件激活并聚集于肺部,令肺部細(xì)胞的蛋白降解,破壞肺部組織結(jié)構(gòu)。嗜酸性粒細(xì)胞會(huì)釋放出細(xì)胞毒性物質(zhì)溶解肺泡上皮細(xì)胞,進(jìn)一步加強(qiáng)炎癥反應(yīng),擴(kuò)大肺部組織損傷〔13〕。巨噬細(xì)胞釋放的TNF-α等細(xì)胞因子還會(huì)激活肺成纖維細(xì)胞,使其增殖,合成大量膠原并積聚細(xì)胞外基質(zhì),導(dǎo)致肺部組織纖維化〔14〕。肺部損傷令肺功能降低,FEV1/FVC<0.7是臨床上診斷COPD的指標(biāo)之一。本研究說(shuō)明,糖皮質(zhì)激素能夠在一定程度上抑制炎癥相關(guān)細(xì)胞的激活,減輕機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激。

CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,會(huì)對(duì)IL-6的水平變化作出反應(yīng),作為血液炎癥標(biāo)志物應(yīng)用于臨床診斷當(dāng)中〔15〕。PCT能夠反映機(jī)體全局炎癥反應(yīng)的活躍程度,預(yù)測(cè)COPD患者的死亡率〔16〕。IL-6與IL-8能夠激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞,TNF-α?xí)M(jìn)一步提高IL-8的水平〔17〕。本研究說(shuō)明,糖皮質(zhì)激素抑制了COPD大鼠機(jī)體內(nèi)炎性細(xì)胞因子的水平。

正常機(jī)體內(nèi)氧化物與抗氧化物處在動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)中〔18〕,若機(jī)體攝入外源性氧化物,如香煙的煙霧和可吸入顆粒物,就會(huì)消耗體內(nèi)的抗氧化物,影響原本的平衡狀態(tài)。進(jìn)入肺部的外源性氧化物可以直接傷害肺組織和氣道,還能夠通過(guò)多種途徑刺激肺部產(chǎn)生炎癥反應(yīng),釋放內(nèi)源性氧化物,加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)與氧化物-抗氧化物失衡〔19〕。SOD能夠消除代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基,CAT負(fù)責(zé)促進(jìn)具有氧化劑毒性的過(guò)氧化氫分解,二者都屬于抗氧化物〔20〕。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的一種,本研究結(jié)果說(shuō)明,糖皮質(zhì)激素能夠糾正COPD大鼠機(jī)體內(nèi)氧化物-抗氧化物的失衡狀態(tài)。

Nrf2/HO-1信號(hào)通路具有抵抗氧化應(yīng)激損傷,保護(hù)組織臟器的能力〔10〕。Nrf2通過(guò)位移至細(xì)胞核中與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,激活SOD、CAT及Ⅱ相解毒酶等靶基因,提高抗氧化物表達(dá)水平〔21〕。HO-1是Ⅱ相解毒酶的一種,由它引發(fā)的下級(jí)信號(hào)通路具有抗氧化作用〔10〕,HO-1的代謝產(chǎn)物還具有抗炎的作用〔22〕。本研究結(jié)果說(shuō)明,糖皮質(zhì)激素能起到激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路的作用。