張忠陽 凌家艷 周盾

(武漢市第一醫(yī)院中醫(yī)綜合科,湖北 武漢 430022)

腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟受累疾病發(fā)展至腎臟衰竭的關(guān)鍵事件,該病主要以腎組織微血管纖維化、腎小管間質(zhì)纖維化及腎小球硬化為主要病理改變。如果不能及時(shí)有效的控制腎組織的纖維化進(jìn)程,極易誘發(fā)臟器衰竭等惡性事件的發(fā)生。該病的分子機(jī)制尚未完全闡明,西醫(yī)藥技術(shù)只能緩解患者的臨床癥狀,不能準(zhǔn)確而及時(shí)的修復(fù)腎臟損傷〔1〕。因此深入揭示疾病進(jìn)展中的分子機(jī)制,積極尋找可靠的治療靶點(diǎn),是臨床醫(yī)師急需解決的關(guān)鍵問題。腎間質(zhì)纖維化在中醫(yī)上歸為“腎脈瘀阻”范疇,在我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥發(fā)展的進(jìn)程中,積累了一系列的中醫(yī)藥方法通過活血化瘀、溫補(bǔ)腎陽等手段改善患者的腎臟組織微循環(huán),阻滯腎臟纖維化進(jìn)程,改善患者的腎功能〔2〕。腎氣丸出自《金匱要略》,主要由肉桂、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉及山茱萸、附子、熟地黃等八味中藥組成?，F(xiàn)代藥理學(xué)的研究顯示〔3〕,腎氣丸具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌,抑制炎性進(jìn)展、增強(qiáng)免疫功能和保腎護(hù)肝等效用。趙峰等〔4〕研究顯示腎氣丸能明顯降低腎缺血再灌注損傷小鼠模型中腎組織細(xì)胞的凋亡率,改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎功能,發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。但是有關(guān)腎氣丸在腎間質(zhì)纖維化中的作用的報(bào)道較少。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/果蠅抗生物皮膚生長因子蛋白家族(Smad)3信號是細(xì)胞內(nèi)最重要的促纖維化轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,能被腎組織中血管緊張素(Ang)Ⅱ等蛋白的表達(dá)激活〔5〕,Smad3磷酸化后將纖維化信號傳遞入核,進(jìn)一步放大纖維化進(jìn)程。本研究以腺嘌呤誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠腎間質(zhì)纖維化模型,基于TGF-β/Smad3信號,探討腎氣丸對疾病進(jìn)展中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,希望為藥物的臨床應(yīng)用增加新的事實(shí)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 SPF級,6～8周齡,SD大鼠,雄性,40只,體質(zhì)量200～250 g,購自北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2020-0007,經(jīng)醫(yī)院專門人員在溫度20～25 ℃,濕度55%～60%,12 h明暗交替的條件下進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)后用于實(shí)驗(yàn)。本研究的實(shí)驗(yàn)操作和目的已經(jīng)獲得醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。腎氣丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠,國藥準(zhǔn)字:Z11020147);過表達(dá)TGF-β1(pcDNA3.1-TGF-β1)及陰性對照(pcDNA3.1-TGF-β1-NC)購自北京安波特基因工程技術(shù)有限公司。腺嘌呤(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、Masson染色試劑盒、Western印跡試劑盒(南京建成生物科技有限公司),兔抗大鼠AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3抗體及磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國abcam公司。X71光學(xué)顯微鏡、JEM-300F2透射電鏡(日本Olympus公司),凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司),組織包埋機(jī)、攤片機(jī)、超薄切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.2動(dòng)物模型的復(fù)制及分組處理 腎間質(zhì)纖維化大鼠模型的復(fù)制根據(jù)Contreras-Salinas等〔6〕介紹的方法:每日以250 mg/kg的腺嘌呤生理鹽水混懸液進(jìn)行灌胃處理,每日1次,連續(xù)12 d后,更換為每兩日1次,連續(xù)12 d,造模周期共24 d。動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)組和過表達(dá)組,正常組造模過程中以等劑量的生理鹽水進(jìn)行灌胃處理。大鼠造模周期結(jié)束后,實(shí)驗(yàn)組每日尾靜脈注射5×109pfu/ml的pcDNA3.1-TGF-β1-NC,并且以10 g/kg的腎氣丸進(jìn)行灌胃處理;過表達(dá)組每日尾靜脈注射5×109pfu/ml pcDNA3.1-TGF-β1,并且以10 g/kg的腎氣丸進(jìn)行灌胃處理;模型組和正常組每日尾靜脈注射5×109pfu/ml的pcDNA3.1-TGF-β1-NC并以生理鹽水進(jìn)行灌胃處理。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠單籠飼養(yǎng),自由飲食。

1.3各組腎功能檢測 在實(shí)驗(yàn)過程中觀察記錄各組大鼠日常行為的變化,持續(xù)給藥14 d后,將大鼠誘導(dǎo)麻醉,腹主動(dòng)脈采血5 ml,置于臺(tái)式高速微量離心機(jī)上10 min,留取上清液,酶標(biāo)儀檢測各組大鼠血清中血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的含量。

1.4各組腎臟組織病理學(xué)改變 采血完畢,處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,無菌操作臺(tái)上取出大鼠的腎臟組織,醫(yī)用生理鹽水清洗,肉眼觀察后,迅速轉(zhuǎn)移至低溫冰箱中保存待測。取大鼠的腎臟組織,經(jīng)固定,脫水,切片,依次HE染色、過典酸雪夫染色(PAS)、Masson染色,鏡檢。

1.5各組腎臟組織的超微結(jié)構(gòu)改變 取大鼠的腎臟組織,戊二醛固定1 h,PBS清洗,鋨酸再固定,梯度濃度的無水乙醇梯度脫水,包埋,切片,醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色JEM-300F2透射鏡下觀察。

1.6各組腎臟組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)和Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ)的表達(dá) 取大鼠的腎臟組織,經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)后,按照免疫組化試劑盒要求依次加入一抗(1∶300),二抗(1∶1 000),蘇木素復(fù)染,封片,鏡檢,以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為目標(biāo)蛋白陽性表達(dá),ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)分析蛋白的陽性表達(dá)率。

1.7各組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表達(dá)水平 取各組大鼠的腎組織,在4 ℃裂解液中放置30 min,離心,并將上清液稀釋,常規(guī)方法提取樣本中的總蛋白,以50 μg樣品進(jìn)行上樣,電泳后,轉(zhuǎn)模,封閉,加入一抗(1∶1 000),二抗(1∶5 000)稀釋后,室溫孵育后,顯色30 min,以GAPDH為參照,分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組一般狀態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)過程未出現(xiàn)大鼠死亡;正常組活動(dòng)正常,皮毛光亮,進(jìn)食與飲水正常,大鼠體質(zhì)量增加明顯;模型組活動(dòng)量較少,易怒,飲食與進(jìn)水意愿不強(qiáng)烈,皮毛暗淡雜亂,體質(zhì)量未見明顯增加;實(shí)驗(yàn)組臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn),體質(zhì)量增加量較模型組明顯升高;過表達(dá)組飲食量較實(shí)驗(yàn)組明顯減少,體質(zhì)量增加較實(shí)驗(yàn)組明顯降低(P<0.05),見表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量

2.2各組腎功能的變化 與正常組相比,模型組、實(shí)驗(yàn)組、過表達(dá)組血清Scr、BUN含量明顯升高(均P<0.05);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組、過表達(dá)組血清Scr、BUN含量明顯降低(均P<0.05);與實(shí)驗(yàn)組相比,過表達(dá)組血清Scr、BUN含量明顯升高(均P<0.05),見表2。

表2 各組腎參數(shù)、腎組織中α-SMA和ColⅣ陽性細(xì)胞的比例及AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的相對表達(dá)比較

2.3各組腎臟組織中α-SMA和ColⅣ表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組、實(shí)驗(yàn)組、過表達(dá)組腎組織中α-SMA和ColⅣ陽性細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組、過表達(dá)組腎組織中α-SMA和ColⅣ陽性細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05);與實(shí)驗(yàn)組相比,過表達(dá)組腎組織α-SMA和ColⅣ陽性細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05),見表2、圖1。

圖1 各組腎組織中ColⅣ、α-SMA表達(dá)(免疫組化染色,×400)

2.4各組腎臟解剖學(xué)、組織損傷病理、超微結(jié)構(gòu)變化 肉眼觀察結(jié)果顯示,正常組腎組織顏色較深,表面光滑,有彈性;模型組腎組織比正常組腎組織個(gè)體上偏大,顏色較淺,呈現(xiàn)淡白色,腎組織表面出現(xiàn)結(jié)晶沉淀和較多的腎結(jié)石,表面粗糙,失去彈性,質(zhì)地偏硬;實(shí)驗(yàn)組腎組織個(gè)體較模型組偏小,趨于正常,質(zhì)軟,表面光滑;過表達(dá)組腎組織個(gè)體較實(shí)驗(yàn)組腎組織偏大,質(zhì)地偏硬,表面偶有白色斑點(diǎn),見圖2。HE染色顯示,正常組腎組織腎小管及腎小球形態(tài)規(guī)則,未見炎性浸潤;模型組腎小管擴(kuò)張明顯,腎小球嚴(yán)重硬化和炎性細(xì)胞大量浸潤;實(shí)驗(yàn)組腎小管腫脹,明顯緩解,炎性浸潤緩和;過表達(dá)組組織損傷較實(shí)驗(yàn)組重,較模型組輕。PAS染色顯示,正常組腎組織腎小管及腎小球結(jié)構(gòu)正常,腎小管與間質(zhì)及腎小球與間質(zhì)形態(tài)未見明顯異常;模型組腎小球基底膜增厚明顯,系膜增生嚴(yán)重,系膜區(qū)明顯變寬;實(shí)驗(yàn)組較模型組明顯改善,但過表達(dá)組較實(shí)驗(yàn)組改善程度明顯減小。Masson染色顯示,正常組腎組織中未見膠原沉淀沉積,無腎間質(zhì)纖維化現(xiàn)象;模型組腎小球和腎小管中均可見成片的纖維性藍(lán)色沉淀,間質(zhì)纖維化嚴(yán)重;實(shí)驗(yàn)組腎組織藍(lán)色沉積明顯減少,間質(zhì)纖維化現(xiàn)象明顯改善;與實(shí)驗(yàn)組相比,過表達(dá)組腎間質(zhì)纖維化現(xiàn)象明顯加重。電鏡觀察結(jié)果顯示:正常組腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)完整,足突細(xì)胞排列整齊,未見異常;模型組腎小球系膜增厚明顯,細(xì)胞間質(zhì)增寬,胞質(zhì)中細(xì)胞器出現(xiàn)空泡樣變性,腎小管擴(kuò)張,可見較為明顯的纖維化區(qū)域,足突細(xì)胞融合嚴(yán)重;實(shí)驗(yàn)組腎組織的超微結(jié)構(gòu)損傷明顯緩解,腎小球系膜增生趨于緩解,腎小管稍見腫脹;與實(shí)驗(yàn)組相比,過表達(dá)組腎組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯加重,見圖3。

2.5各組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3表達(dá)水平 與正常組相比,模型組、實(shí)驗(yàn)組、過表達(dá)組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表達(dá)明顯升高(均P<0.05);與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組、過表達(dá)組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3表達(dá)明顯降低(均P<0.05);與實(shí)驗(yàn)組相比,過表達(dá)組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表達(dá)明顯升高(均P<0.05),見表2、圖4。

圖4 各組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)

3 討 論

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在漫長的歷史進(jìn)程中,積累了豐富的治療腎病及腎纖維化等腎臟疾病的經(jīng)驗(yàn),中醫(yī)認(rèn)為“腎”主元?dú)?“腎氣”足而精力充沛,在中醫(yī)“陰陽配伍”和腎臟陰陽調(diào)和的指導(dǎo)下,涌現(xiàn)了大量的相關(guān)治療名方,如養(yǎng)陰活血方、腎炎防衰液、腎消康、延腎膠囊、通絡(luò)方等。古方腎氣丸出自我國著名醫(yī)學(xué)家張仲景《傷寒雜病論》中的《金匱要略》,主要由肉桂、附子、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉及山茱萸、熟地黃等八味中藥,將溫陽與滋陰相結(jié)合,發(fā)揮補(bǔ)腎助陽、陰中求陽,鼓舞腎氣的目的。腎氣丸配伍嚴(yán)謹(jǐn)常用于頑固性失眠,虛勞腰痛等病癥的治療,并取得了良好的療效〔7,8〕。劉瑞萍等〔9〕將腎氣丸用于陰陽兩虛糖尿病腎病的臨床治療中,結(jié)果顯示該方的應(yīng)用能明顯降低患者的尿蛋白的排泄,降低炎性因子的釋放,緩解患者的臟器損傷,改善其腎功能。本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠的臨床癥狀,腎組織的病理損傷,纖維化程度、腎組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)損傷均明顯緩解,證實(shí)了藥物對疾病的干預(yù)作用。

TGF-β1是目前已知的具有最強(qiáng)致纖維化效用的細(xì)胞因子之一,在腎、心、肝、肺等臟器纖維化進(jìn)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用〔10〕。Geng等〔11〕研究顯示在單側(cè)輸尿管梗阻模型小鼠中抑制TGF-β1的表達(dá),抑制TGF-β1/Smad3信號的激活,能明顯降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎組織中間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá),下調(diào)ColⅣ導(dǎo)致臟器中的膠原沉淀比例。本研究以腺嘌呤作為誘導(dǎo)劑,該含氮雜環(huán)化合物在體內(nèi)特異性酶的作用下,生成2,8-二羥基腺嘌呤致使腎組織中氮質(zhì)化合物代謝異常,腎小管發(fā)生阻塞,動(dòng)物的腎功能異常,血清中的過飽和尿酸刺激血管中血管活性肽(主要是AngⅡ的表達(dá)升高),激活TGF-β1,誘發(fā)大鼠腎間質(zhì)纖維化〔12〕。本研究以過表達(dá)pcDNA3.1-TGF-β1作為對照,過表達(dá)組改善情況較實(shí)驗(yàn)組明顯變差,證實(shí)了藥物的作用靶點(diǎn)。

綜上,腎氣丸能減輕腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織的病理損傷,改善其腎功能,這與抑制TGF-β1/Smad3信號的激活有關(guān)。但是將腎氣丸全面用于疾病的臨床治療,需要更為詳盡、系統(tǒng)的研究。