杜姝 傅增輝 姜巖 劉晶 林再紅 陳團(tuán)團(tuán)

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)四科,黑龍江 齊齊哈爾 161000)

帕金森病(PD)屬于慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。多發(fā)于中老年,主要臨床特征包括肌強(qiáng)直、靜止性震顫、姿勢反射障礙和運(yùn)動(dòng)遲緩〔1,2〕。miRNA在多種細(xì)胞活動(dòng)中有著重要地位,可以指導(dǎo)形成miRNA-mRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體。近幾年,在PD中miRNA的作用引起重視,miR-214與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)〔3,4〕。目前的研究發(fā)現(xiàn),miR-214作為一種功能性的miRNA,可以抑制海馬神經(jīng)元的自噬和凋亡,故而miR-214-3p的表達(dá)可能與PD具有一定的關(guān)系〔5〕。研究顯示,Fas配體(FasL)屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族一種細(xì)胞表面分子,與其受體Fas結(jié)合,從而誘導(dǎo)Fas攜帶細(xì)胞凋亡〔6〕。目前miR-214-3p在PD中的相關(guān)研究較少,本研究采用miR-214-3p對(duì)PD模型大鼠進(jìn)行干預(yù),探究其臨床指標(biāo)及與Fas/FasL通路的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取36只清潔級(jí)SD雄性大鼠,8～12周齡;平均(9.50±1.90)周齡;體質(zhì)量180～230 g,平均(194.75±23.75)g,購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):SYXK(豫)2017-0002,大鼠均進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食、飲水,晝夜交替12 h,濕度在50%左右,統(tǒng)一適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2PD模型大鼠制備〔7〕采取頸背部皮下注射魚藤酮制備PD大鼠模型。28只大鼠稱體質(zhì)量后逐日給予魚藤酮2 mg/kg頸背部皮下注射,將大鼠行為變化分為6個(gè)等級(jí)計(jì)分。1分為大鼠拒逮捕能力減弱,外表顏色變黃變臟,毛發(fā)垂直,弓背,主動(dòng)活動(dòng)能力減少;2分為在1分大鼠基礎(chǔ)上出現(xiàn)主動(dòng)活動(dòng)能力明顯下降,動(dòng)作遲緩、震顫、步態(tài)不穩(wěn);4分為基于2分大鼠行為,步態(tài)不穩(wěn)定、不能直行、行走時(shí)向一側(cè)旋轉(zhuǎn);6分為單側(cè)斜倚,單側(cè)肢體癱瘓,進(jìn)食困難;8分為肢體完全癱瘓,體質(zhì)量明顯減輕,無法進(jìn)食,四肢拘攣;10分為瀕死狀態(tài)、死亡。造模后次日進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分,評(píng)分的環(huán)境與飼養(yǎng)環(huán)境一致,放置于具有干凈墊料的大籠子中,待大鼠適應(yīng)新環(huán)境后,記錄大鼠行為學(xué)特征并評(píng)分。行為學(xué)評(píng)分2～8分的大鼠為造模成功,共24只大鼠建模成功。

1.3分組及干預(yù) 將建模成功的24只大鼠隨機(jī)分為上調(diào)miR-214-3p組、下調(diào)miR-214-3p組、模型組各8只,未行建模的8只正常大鼠為正常組,下調(diào)miR-214-3p組腹腔注射antago miR-214-3p 30 mg/kg進(jìn)行干預(yù)。上調(diào)miR-214-3p組腹腔注射miR-214-3p 30 mg/kg,正常組、模型組腹腔注射等量生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。

1.4步幅距離測量 正式步幅試驗(yàn)前,大鼠先行步幅訓(xùn)練3次。裝置:木盒子長22 cm,寬18 cm,高12 cm;跑道長44 cm,寬5 cm,高10 cm,將跑道穿過木盒。大鼠前爪涂上黑墨水,跑道上放上白紙,寬5 cm,長44 cm,在放有白紙的跑道上行走,穿過盒子,記錄大鼠在白紙上遺留前爪印記前后間的距離,選取3個(gè)最長距離,記錄。重復(fù)測量3次。

1.5懸掛時(shí)間測定 正式懸掛開始前,大鼠先行懸掛訓(xùn)練3次。懸掛于直徑約3 mm水平鐵線上,正常大鼠將前爪懸掛于該鐵絲上,肌力越大且越持久懸掛時(shí)間越長,放置軟墊防止大鼠摔傷。大鼠不能翻坐于鐵線,通過前爪懸掛于鐵線上,記錄抓鐵絲線時(shí)間,重復(fù)檢測3次,每次檢測間隔2 min以防大鼠疲憊。

1.6各組前額葉皮層蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠麻醉后,斷頭取腦,腦組織放置冰盤,取前額葉皮層組織,予0.9%氯化鈉溶液洗凈組織中血液,吸干,于EP管中,-80 ℃保存?zhèn)溆?。組織塊固定在切片機(jī)標(biāo)本固定架上,暴露組織最大切面,4 μm的厚度切片。恒溫水浴鍋內(nèi)展平裱片,烘片2～6 h,依次浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟15 min,完成后依次浸入100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%Ⅰ、95%Ⅱ、90%、80%、70%乙醇溶液中各5 min,后置于蒸餾水中。置于蘇木素液中染色20 min,洗去蘇木素液,將切片浸入1%鹽酸乙醇溶液中,再水洗后流水返藍(lán)30 min。伊紅液中染色30 s水洗,以與入水相反順序乙醇溶液脫水,浸入二甲苯中3 min,中性樹膠封片,陰涼處晾干。置于光學(xué)顯微鏡下觀察各組前額葉皮層部位組織切片。

1.7miR-214-3p表達(dá)檢測 腦組織中miR-214-3p的表達(dá)采用熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測,取大鼠腦組織,Trizol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。加入PCR引物,進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性10 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán)。U6為內(nèi)參照,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)攝影,Quantity One軟件進(jìn)行掃描分析,計(jì)算采用2-ΔΔCt法。引物序列為:miR-214-3p上游5′-CAGCAGGCACAGACAGGC-3′,下游5′-CTATGTCCTCACCGZZCGCAACC-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.8大鼠炎癥因子檢測 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測腦組織中白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平,取大鼠腦組織進(jìn)行組織勻漿,4 ℃離心后收集上清液,應(yīng)用IL-1、TNF-α和IL-6 ELISA檢測試劑盒測定上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平,按照試劑盒說明書進(jìn)行具體步驟操作。

1.9Western印跡檢測Fas/FasL信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取出腦組織,對(duì)每塊進(jìn)行稱重后按12.5 μl/mg加入組織裂解液,充分研磨,靜置30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,抽取上清液,加熱10 min。-80 ℃冰箱保存,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉1 h,加入封閉液稀釋的Fas(1∶1 000)、FasL(1∶1 000)、甲狀腺激素(TH,1∶1 000)抗體,4 ℃孵育過夜。PBST洗滌3次,加入標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,PBST洗滌3次,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行齊性方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組miR-214-3p表達(dá)比較 與正常組相比,上調(diào)miR-214-3p組、下調(diào)miR-214-3p組、模型組miR-214-3p表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)miR-214-3p組miR-214-3p表達(dá)明顯升高,下調(diào)miR-214-3p組miR-214-3p表達(dá)明顯降低(P<0.05);與下調(diào)miR-214-3p組相比,上調(diào)miR-214-3p組miR-214-3p表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-214-3p表達(dá)、步幅距離、懸掛時(shí)間、腦組織中炎癥因子比較

2.2miR-214-3p對(duì)各組步幅距離、懸掛時(shí)間的影響 與正常組相比,上調(diào)miR-214-3p組、下調(diào)miR-214-3p組、模型組步幅距離明顯縮短,懸掛時(shí)間明顯減少(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)miR-214-3p組步幅距離明顯變長,懸掛時(shí)間明顯增加,下調(diào)miR-214-3p組步幅距離明顯縮短,懸掛時(shí)間明顯減少(P<0.05);與下調(diào)miR-214-3p組相比,上調(diào)miR-214-3p組步幅距離明顯變長,懸掛時(shí)間明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.3miR-214-3p對(duì)各組腦組織炎癥因子的影響 與正常組相比,上調(diào)miR-214-3p組、下調(diào)miR-214-3p組、模型組TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)miR-214-3p組TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)明顯降低,下調(diào)miR-214-3p組TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)明顯升高(P<0.05);與下調(diào)miR-214-3p組相比,上調(diào)miR-214-3p組TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組前額葉皮層HE染色 正常組前額葉皮層區(qū)域神經(jīng)元分布緊密,數(shù)量正常,排列整齊,形態(tài)較為規(guī)整,胞體輪廓清晰,大而圓,空泡變性較少;模型組前額葉皮層區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞則較正常組數(shù)量較少、排列散裂、胞體輪廓較模糊,胞核固縮與空泡變性較多;下調(diào)miR-214-3p組前額葉皮層區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少、排列疏松、胞體模糊,胞核固縮與空泡變性增多,上調(diào)miR-214-3p組前額葉皮層部位神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)有所增加,細(xì)胞整體形態(tài)與排列情況改善顯著。見圖1。

圖1 各組前額葉皮層變化(HE染色,×400)

2.5miR-214-3p對(duì)PD模型大鼠Fas/FasL信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響 與正常組相比,上調(diào)miR-214-3p組、下調(diào)miR-214-3p組、模型組Fas、FasL表達(dá)較高,TH表達(dá)較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)miR-214-3p組Fas、FasL表達(dá)較低,TH表達(dá)較高,下調(diào)miR-214-3p組Fas、FasL表達(dá)較高,TH表達(dá)較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與下調(diào)miR-214-3p組相比,上調(diào)miR-214-3p組Fas、FasL表達(dá)較低,TH表達(dá)較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

1～4:下調(diào)miR-214-3p組、模型組、上調(diào)miR-214-3p組、正常組

表2 miR-214-3p對(duì)PD模型大鼠Fas/FasL通路蛋白的影響

3 討 論

目前,尚未明了PD的致病機(jī)制,成功的動(dòng)物模型制備不僅能夠?yàn)檠芯刻峁┝己没A(chǔ),且可以明確疾病的發(fā)病機(jī)制〔8～10〕。

miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)豐富,具有明顯的組織和細(xì)胞特異性,多個(gè)miRNA均與PD的發(fā)生相關(guān),可能參與并調(diào)節(jié)PD的發(fā)病機(jī)制。據(jù)報(bào)道,miRNA調(diào)節(jié)的相關(guān)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)機(jī)制也成為PD發(fā)病機(jī)制研究重點(diǎn),膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎性過程均能對(duì)PD的發(fā)病和進(jìn)展起到促進(jìn)作用〔11～12〕。miR-214-3p在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要地位,范文秀等〔13〕研究顯示,miR-214-3p的表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),故miR-214-3p的表達(dá)應(yīng)該引起相應(yīng)的重視,以促進(jìn)早期干預(yù),為生物治療提供新靶點(diǎn),阻止病情的發(fā)展。步幅試驗(yàn)是評(píng)價(jià)PD動(dòng)物模型四肢運(yùn)動(dòng)障礙程度的方法,可檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力,懸掛試驗(yàn)評(píng)價(jià)PD模型動(dòng)物在姿勢平衡障礙的程度,因此本研究對(duì)PD模型大鼠采用步幅試驗(yàn)與懸掛試驗(yàn)的進(jìn)行評(píng)價(jià),以側(cè)面反映PD模型大鼠腦部多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞丟失程度〔14〕。本文研究顯示,上調(diào)miR-214-3p表達(dá),可有效改善PD模型大鼠步幅距離、懸掛時(shí)間,側(cè)面反映miR-214-3p上調(diào)可有效改善神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)功能。

在PD患者腦內(nèi)過度的激活引起的神經(jīng)元丟失及TNF-α等炎癥因子的增加。在PD動(dòng)物模型的中同樣有研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α引起后續(xù)的炎癥反應(yīng),而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活并減少TNF-α的分泌,可以進(jìn)一步防止神經(jīng)元的損失〔15〕。研究表明,在雄性大鼠注射脂多糖,可以產(chǎn)生IL-1,IL-6等激活的小膠質(zhì)細(xì)胞,介質(zhì)的過度釋放會(huì)導(dǎo)致PD。抑制促炎分子可阻止PD的進(jìn)展〔16〕。說明在PD的病情發(fā)生發(fā)展中,炎癥因子引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)揮著決定性的作用。本研究顯示,上調(diào)miR-214-3p表達(dá)可顯著改善PD大鼠TNF-α、IL-6、IL-1表達(dá),通過抑制促炎性細(xì)胞因子與程序性黑質(zhì)的神經(jīng)元死亡的關(guān)系,降低細(xì)胞毒性作用,促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)。

Fas是屬于TNF受體超家族成員的一種跨膜蛋白,它與FasL結(jié)合誘導(dǎo)Fas自身的三聚化,然后在細(xì)胞膜上形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物。同時(shí),Fas-FasL系統(tǒng)可自行執(zhí)行Fas介導(dǎo)的凋亡,從而下調(diào)免疫應(yīng)答〔17,18〕。研究發(fā)現(xiàn),Fas/FasL配體相互作用,以自主的方式誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞死亡。Fas通路不僅是重要的凋亡通路,而且與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔19〕。本文研究顯示,miR-214-3p可靶向調(diào)控凋亡通路,改善相關(guān)蛋白表達(dá),引起細(xì)胞骨架重塑和突觸形成,誘導(dǎo)細(xì)胞分泌金屬基質(zhì)酶,凋亡敏感性增強(qiáng),有利于機(jī)體清除病毒感染的細(xì)胞〔20〕,提示上調(diào)miR-214-3p改善PD的作用機(jī)制可能與Fas/FasL信號(hào)通路有關(guān)。

綜上,miR-214-3p上調(diào)對(duì)PD大鼠神經(jīng)功能可有效改善,降低炎癥因子,其作用機(jī)制可能與Fas/FasL信號(hào)通路有關(guān)。