范紅波 黃欣媛

(1湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部,湖北 孝感 432000;2湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院)

阿爾茨海默病(AD)是老年人常見的以漸進(jìn)性記憶和認(rèn)知衰退為特征的神經(jīng)退行性疾病,其發(fā)病機(jī)制與大腦皮質(zhì)和海馬中β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑密切相關(guān)〔1〕。AD病因復(fù)雜,中藥診治在AD治療中得到重視。蝎毒是傳統(tǒng)中醫(yī)藥材,有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等藥理作用,治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病已有多年歷史。國內(nèi)已有商品化的蝎毒蛋白藥物制品——蝎毒注射液(SVI),目前該藥在臨床上僅用于鎮(zhèn)痛。有研究表明,蝎毒蛋白中的耐熱組分——蝎毒耐熱蛋白(SVHRP)能夠改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙〔2,3〕,研究也發(fā)現(xiàn)SVI能夠增加AD大鼠皮質(zhì)及海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá),改善學(xué)習(xí)記憶能力〔4〕。胰島素樣生長因子(IGF)-1和BDNF在神經(jīng)保護(hù)和營養(yǎng)作用方面有密切聯(lián)系,IGF-1能促進(jìn)BDNF分泌,提高BDNF活性,起到更好神經(jīng)保護(hù)的作用〔5〕。IGF-1主要通過磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路向胞內(nèi)傳遞信號,促進(jìn)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞增生及分化,其異常表達(dá)與AD關(guān)系密切〔6〕。本研究考察SVI對AD模型大鼠海馬中IGF-1/PI3K/Akt信號通路的影響,研究SVI改善AD大鼠認(rèn)知功能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 SVI購自通化衛(wèi)京藥業(yè)股份有限公司(批號:20150802,蝎毒蛋白含量為10 μg/ml),Aβ25～35為Sigma公司產(chǎn)品,IGF-1、PI3K、Akt、p-Akt(Ser473)和β-肌動蛋白(actin)一抗均為Abcam公司產(chǎn)品,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗購自武漢博士德生物工程有限公司,Trizol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品,二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物均為上海生工生物公司產(chǎn)品。

1.2實驗動物分組 6～7周齡SPF級健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量(230±20)g,購于湖北省實驗動物中心。在溫度20～23 ℃、相對濕度(50±5)%環(huán)境下,自由飲食和飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,編號后按照隨機(jī)數(shù)字表分為5組:假手術(shù)對照組,AD模型組及SVI低、中、高劑量干預(yù)組,每組12只。

1.3AD模型制作與SVI干預(yù) 參照文獻(xiàn)〔7〕報道的方法制備AD模型大鼠,即采用腦立體定位儀在大鼠雙側(cè)海馬區(qū)定位(前囟后3.3 mm,旁開1.8 mm,顱骨表面下3.5 mm)注射5 μg/μl的Aβ25～35溶液2 μl,10 min內(nèi)緩慢注射完,留針5 min。假手術(shù)對照組注射2 μl無菌生理鹽水。于AD造模完成后24 h開始腹腔注射SVI,每日1次,連續(xù)10 d。SVI低、中、高劑量組SVI注射量分別為5、10、20 μg/kg。選用SVI中劑量組為后續(xù)實驗SVI干預(yù)組。

1.4Morris水迷宮實驗檢測大鼠的認(rèn)知能力 于SVI干預(yù)治療完畢次日開始對5組進(jìn)行定位航行實驗,持續(xù)5 d。將水迷宮圓形水池分為4個象限,逃生平臺置于其中一個象限內(nèi)。每只大鼠固定時間訓(xùn)練2次/d,記錄其入水后120 s內(nèi)找到水下逃生平臺所用的時間,即逃避潛伏期,檢測大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。第6天撤去逃生平臺,進(jìn)行空間探索實驗,記錄各組入水后120 s內(nèi)穿過原平臺區(qū)域的次數(shù)及在原平臺所在象限游泳的時間,檢測大鼠對平臺空間位置的記憶保持能力。

1.5免疫組織化學(xué)法測定海馬中IGF-1表達(dá) 水迷宮實驗結(jié)束后,對假手術(shù)對照組、AD模型組和SVI干預(yù)組進(jìn)行海馬組織取材。每只大鼠腹部注射10%水合氯醛(4 ml/kg)進(jìn)行麻醉,脫頸椎處死后立即取全腦,置于冰皿上剝離兩側(cè)海馬組織,其他組織置于-80 ℃冰箱保存。每組隨機(jī)選取3只進(jìn)行免疫組化實驗。將海馬組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h,30%蔗糖溶液脫水,石蠟包埋,恒冷箱切片機(jī)連續(xù)切5 μm厚度的薄片。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,5 min/次,加入羊抗大鼠IGF-1一抗(1∶500),4 ℃濕盒中孵育過夜。PBS沖洗3次,加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000),37 ℃濕盒中孵育1 h,PBS漂洗3次,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑避光反應(yīng)30 min,PBS沖洗,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并拍片,IGF-1免疫陽性反應(yīng)的細(xì)胞呈棕褐色。每只大鼠選取5張照片,每張取海馬CA1區(qū)中段3個視野,運用ImageJ 1.52v圖像分析軟件測定陽性細(xì)胞的平均光密度。

1.6RT-PCR法檢測海馬中IGF-1、PI3K和Akt的mRNA表達(dá) 按1.5方法獲取大鼠海馬組織,用Trizol試劑提取總RNA,超微量分光光度計測定RNA濃度和純度,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以之為模板,實時定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測IGF-1、PI3K和Akt的mRNA表達(dá)量變化,內(nèi)參為β-actin。基因特異性引物分別為:IGF-1上游引物:5′-GCACTCTGCTTGCTCACCTTTA-3′,下游:5′-TCCG-AATGCTGGAGCCATA-3′,擴(kuò)增片段長148 bp。PI3K上游引物:5′-AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA-3′,下游:5′-GAAACTTTTTCCCACCACGA-3′,擴(kuò)增片段長165 bp。Akt上游引物:5′-TCCTGCACCTGGAGCT CTGTTA-3′,下游:5′-CTCAGGGCAGCAGGACATGTAG-3′,擴(kuò)增片段長199 bp。β-actin上游引物:5′-GAGACCTACAAGACCCCAGCC-3′,下游:5′-TCGGCGCATCGGTACCGCTCA-3′,擴(kuò)增片段長183 bp。PCR條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性20 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,39個循環(huán);72 ℃延伸8 min。用2-ΔΔCt法分析目的基因較內(nèi)參基因β-actin相對表達(dá)水平。

1.7Western印跡法檢測海馬中PI3K、Akt、p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá) 按1.5方法獲取各組海馬組織剪碎后加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液,冰浴中勻漿提取總蛋白,BCA法定量測定蛋白濃度,根據(jù)濃度確定上樣量,進(jìn)行12%分離膠的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),條帶轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜,根據(jù)分子量大小剪膜后各加入相應(yīng)的IGF-1(1∶2 000)、PI3K(1∶2 000)、Akt(1∶1 500)、p-Akt(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)一抗,室溫下?lián)u動孵育2 h,等滲緩沖鹽溶液(TBST)清洗,加入HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000),室溫?fù)u動孵育2 h,TBST清洗,ECL試劑盒顯色,化學(xué)發(fā)光成像儀檢測記錄結(jié)果。ImageJ v1.52圖像軟件分析條帶的灰度。蛋白相對表達(dá)水平用目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度的比值來表示。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism8軟件,各組數(shù)據(jù)之間的差異性采用單因素方差分析,組間均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Morris水迷宮實驗結(jié)果 與假手術(shù)對照組比較,AD模型組逃避潛伏期延長,平臺穿越次數(shù)顯著減少(P<0.01)。SVI低、中、高劑量組,第1～5天逃避潛伏期均顯著少于AD模型組,平臺穿越次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間顯著多于AD模型組(P<0.01)。見表1。

表1 各組學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.2免疫組織化學(xué)檢測IGF-1含量 AD模型組平均光密度值(22.52±4.89)明顯低于假手術(shù)對照組(45.46±5.92);SVI干預(yù)組(38.96±5.58)明顯高于AD模型組(均P<0.05),但與假手術(shù)對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 免疫組化分析各組海馬中IGF-1表達(dá)(DAB染色,×400)

2.3IGF-1、PI3K與Akt mRNA和蛋白表達(dá) AD模型組和SVI干預(yù)組IGF-1和PI3K mRNA相對表達(dá)水平均顯著低于假手術(shù)對照組,SVI干預(yù)組IGF-1、PI3K和Akt mRNA相對表達(dá)水平明顯高于AD模型組(P<0.05);與假手術(shù)對照組相比,AD模型組和SVI干預(yù)組PI3K、Akt與p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)。與AD模型組比較,SVI干預(yù)組PI3K、p-Akt(Ser473)、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組海馬組織中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 各組海馬組織內(nèi)IGF-1、PI3K和Akt mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

AD在65歲以上老年人中發(fā)病率高達(dá)1%～2%,85歲以上3.35%〔1〕,因而闡明AD發(fā)病機(jī)制對其預(yù)防和治療具有重要意義〔2〕。SVHRP還可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)或抑制神經(jīng)元型一氧化氮合酶活性,或上調(diào)海馬組織BDNF表達(dá)水平,分別對帕金森癥、癲癇等疾病發(fā)揮改善作用〔2,3,8,9〕,但具體作用機(jī)制尚未十分明確。蝎毒對神經(jīng)系統(tǒng)疾病展現(xiàn)出潛在的治療價值,需闡明其作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究Morris水迷宮實驗與于勝波等〔2,10〕研究結(jié)果類似。該研究發(fā)現(xiàn)SVHRP可抑制Aβ引起的突觸密度降低和突觸退變,削弱Aβ對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害。Zhang等〔11〕也報道了SVHRP對表達(dá)人Aβ1～42的轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲的毒性緩解和神經(jīng)保護(hù)作用,提示蝎毒有成為治療AD藥物的潛力。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,IGF-1是一種多肽類神經(jīng)營養(yǎng)因子,廣泛表達(dá)于神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞,具有神經(jīng)保護(hù)作用。IGF-1及其下游信號通路是預(yù)防或治療認(rèn)知功能減退的潛在靶點〔12〕。在大腦中,IGF-1與其受體結(jié)合后,主要通過激活PI3K/Akt信號途徑來參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的生長代謝、突觸可塑性和神經(jīng)組織修復(fù),其異常表達(dá)與AD密切相關(guān)〔6,13,14〕。PI3K/Akt信號途徑被激活后,至少可通過以下途徑阻止AD的惡化:使下游的糖原合成酶激酶(GSK)-3β被磷酸化,活性降低,減少tau蛋白過度磷酸化〔12〕;同時激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2信號通路,降低細(xì)胞中β-淀粉樣前體蛋白裂解酶(BACE)-1的表達(dá),從而減少Aβ的生成和沉積〔15〕。AD患者和AD模型大鼠大腦中IGF-1水平降低,提升內(nèi)、外源IGF-1水平能改善AD模型鼠的認(rèn)知功能,IGF-1已成為治療AD的神經(jīng)保護(hù)劑〔12,14,16〕。本研究結(jié)果說明,IGF-1/PI3K/Akt信號通路被抑制,與有關(guān)研究結(jié)果一致〔17〕。而給予AD大鼠SVI治療后,說明SVI能活化IGF-1/PI3K/Akt信號通路,有助于AD治療。