崔頎 江瑾 周娟 王芳

(青島大學(xué) 1附屬青島市口腔醫(yī)院牙周科,山東 青島 266001;2附屬青島市中心醫(yī)院口腔科;3附屬青島市口腔醫(yī)院藥劑科)

口腔鱗狀細(xì)胞癌是人口腔頜面部最易好發(fā)的惡性腫瘤之一〔1〕?？谇击[癌是一種多因素疾病,涉及多種細(xì)胞信號(hào)通路。研究表明Hippo/Yes相關(guān)蛋白(YAP)在口腔鱗癌、肝癌、膽囊癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和分化相關(guān)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用〔2～4〕。阿霉素(ADM)可以抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔5〕。維替泊芬(VEP)是一種YAP靶向抑制劑,可破壞YAP-TEAD的相互作用。研究證明,VEP依賴于YAP信號(hào)具有抗腫瘤療效〔6〕。本研究旨在探討ADM聯(lián)合VEP通過(guò)YAP蛋白對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞HSC-4增殖和周期的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 HSC-4細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);VEP、ADM購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;雙抗購(gòu)于浙江天航生物科技股份有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)于賽默飛世爾生物化學(xué)有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒購(gòu)于日本Takara公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;RIPA裂解液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;所有抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將人口腔鱗癌細(xì)胞HSC-4培養(yǎng)在含10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。每隔2～3 d傳代1次,取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 胰酶消化細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。設(shè)置空白組、對(duì)照組、ADM組、VEP組。培養(yǎng)24 h后,加入不同濃度ADM(4.0、2.0、1.0、0.5 μg/ml、VEP(4.0、2.0、1.0、0.5 μg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束前,每孔加入20 μl的MTT溶液〔5 mg/ml溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)〕,繼續(xù)置于37 ℃恒溫箱中孵育4 h。吸去上清液后,每孔加入150 μl DMSO隨后震蕩10 min溶解藍(lán)色結(jié)晶。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量其吸光度值。

1.4細(xì)胞分組 后續(xù)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為對(duì)照組、ADM組(1.0 μg/ml)、VEP組(2.0 μg/ml)、ADM(1.0 μg/ml)+VEP(2.0 μg/ml)組。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,PBS洗滌,離心棄上清,重懸細(xì)胞加入預(yù)冷的70%乙醇,4 ℃固定過(guò)夜,PBS洗滌,加入核糖核酸酶(RNase)A,37 ℃孵育30 min,加入碘化丙啶(PI)染色液,避光染色15 min,上機(jī)檢測(cè),用流式細(xì)胞儀和 DNA 細(xì)胞周期分析軟件對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)YAP mRNA表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,加入Trizol裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照熒光定量試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增,相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。YAP以β-actin為內(nèi)參,YAP上游引物:5′-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3′,下游:5′-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3′;β-actin上游引物:5′-TCCTGGATGTTGTGTGTATCGAGAG-3′,下游:5′-ACTTGCGCGTCACAGGACAG-3′。

1.7Western印跡檢測(cè)cyclinB1、cdc2、YAP蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒測(cè)試蛋白濃度,加入上樣緩沖液,100 ℃煮沸5 min。將30 μg蛋白上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,切膠、轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 h,TBST洗滌3次,加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜: 細(xì)胞周期蛋白(cyclin)B1(1∶1 000)、細(xì)胞分裂周期蛋白(cdc)2(1∶1 000)、YAP(1∶1 000)和β-actin(1∶2 000),TBST洗膜3次,加入二抗孵育1 h,TBST洗滌3次,ECL發(fā)光,凝膠成像系統(tǒng)曝光。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組HSC-4細(xì)胞增殖 ADM作用24、48、72 h后,HSC-4細(xì)胞存活率隨著藥物濃度的增高而降低,呈現(xiàn)ADM濃度依賴性和時(shí)間依賴性(P<0.05)。1.0 μg/ml ADM作用3個(gè)時(shí)間點(diǎn)后,HSC-4細(xì)胞存活率在作用48 h時(shí)為70%左右,但是72 h細(xì)胞存活率在50%左右,而且72 h培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)可能不夠,不適于后期的實(shí)驗(yàn),因此選擇1.0 μg/ml ADM作用48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。隨著VEP濃度的增高而降低,呈現(xiàn)VEP濃度依賴性和時(shí)間依賴性(P<0.05)。選擇2.0 μg/ml VEP作用48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2。MTT結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,ADM組、VEP組和ADM+VEP組可以明顯抑制HSC-4細(xì)胞增殖(P<0.01)。ADM+VEP組細(xì)胞存活率明顯低于ADM組和VEP組(P<0.01)。見表3。

表1 不同濃度ADM對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

表2 不同濃度VEP對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

表3 ADM和VEP對(duì)細(xì)胞增殖活性、周期中各期細(xì)胞所占比例、cyclinB1、cdc2、YAP mRNA及蛋白的影響

2.2各組HSC-4細(xì)胞周期 與對(duì)照組比較,ADM組、VEP組和ADM+VEP組可以使HSC-4細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞比例明顯增多(P<0.05)。ADM+VEP組G2/M期細(xì)胞比例分別明顯高于ADM組、維替泊芬組。見表3、圖1。

圖1 4組HSC-4細(xì)胞周期

2.3各組HSC-4細(xì)胞YAP mRNA表達(dá) 與對(duì)照組比較,ADM組、VEP組和ADM+VEP組可以使HSC-4細(xì)胞的YAP mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05,P<0.01)。ADM+VEP組YAP mRNA明顯低于ADM組和VEP組(P<0.05)。見表3。

2.4各組HSC-4細(xì)胞蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較,ADM組、VEP組和ADM+VEP組可以使HSC-4細(xì)胞的cyclinB1、cdc2、YAP蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。ADM+VEP組三種蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于ADM組和VEP組(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 HSC-4細(xì)胞cyclinB1、cdc2、YAP 蛋白表達(dá)

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是世界上第6大常見癌癥〔7〕。由于口腔鱗癌是一種嚴(yán)重復(fù)雜的疾病,因此使用單一方法進(jìn)行治療通常效果不佳。在臨床上,通常采用兩種藥物進(jìn)行合用,旨在擴(kuò)大治療作用,減少副作用,同時(shí)還要降低甚至避免藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)〔8〕。ADM是臨床上常用的抗癌藥物之一,廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤、乳腺癌、頭頸部鱗癌、胃癌等腫瘤的治療,具有抗瘤譜廣、療效好的特點(diǎn)〔9,10〕。Ling等〔11〕研究表明,ADM誘導(dǎo)白血病P388細(xì)胞的細(xì)胞毒性是細(xì)胞周期依賴的,至少部分是通過(guò)干擾p34cdc2/cyclinB1復(fù)合物的調(diào)控,從而導(dǎo)致G2/M期阻滯。Tyagi等〔12〕研究顯示,ADM能有效抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞的生長(zhǎng),通過(guò)抑制cdc25C、cdc2/p34、cyclinB1蛋白表達(dá)和cdc2/p34激酶活性使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。眾所周知,YAP靶向抑制劑VEP是一種用于光動(dòng)力療法的光敏劑,可用于消除與黃斑變性等病癥相關(guān)的眼內(nèi)異常血管。近期研究顯示,VEP作為非光敏劑具有顯著的抗腫瘤作用〔13〕。Liu等〔14〕研究結(jié)果說(shuō)明,維替泊芬顯著抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞SCC-4和SCC-25增殖、遷移和侵襲,并將細(xì)胞周期阻滯在G2期。

Hippo-YAP 信號(hào)通路已被證實(shí)在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中作用顯著〔15〕。YAP作為Hippo通路的核心效應(yīng)蛋白,可以促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移〔16〕。Huo等〔17〕研究表明,ADM通過(guò)抑制YAP表達(dá)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。Ma等〔18〕研究證實(shí),YAP的下調(diào)增加了癌細(xì)胞對(duì)低劑量ADM治療的敏感性,導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。Wei等〔19〕研究表明,VEP通過(guò)破壞YAP-TEAD復(fù)合物抑制胰腺導(dǎo)管腺癌的細(xì)胞存活和血管生成。Morice等〔20〕研究證實(shí),VEP通過(guò)降低YAP的表達(dá)、YAP/轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)相關(guān)結(jié)構(gòu)域(TEAD)轉(zhuǎn)錄活性來(lái)抑制骨肉瘤的腫瘤生長(zhǎng)。

綜上,ADM聯(lián)合VEP通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G2/M期抑制口腔鱗癌HSC-4細(xì)胞增殖,這種抑制效應(yīng)與cyclinB1、cdc2及YAP表達(dá)下調(diào)有關(guān)。