寧家輝 王蕾 衣紅杰 韓雪 孫旭

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 1中醫(yī)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014;2第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

血管性認(rèn)知障礙(VCI)是一類嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病〔1〕。VCI的病理機(jī)制十分復(fù)雜,主要包括缺血、缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激事件、炎性反應(yīng)及繼發(fā)的神經(jīng)元損傷和凋亡〔2〕。若長(zhǎng)時(shí)間不能恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),終將導(dǎo)致神經(jīng)元大量丟失,加重認(rèn)知障礙進(jìn)展與惡化。

p-Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號(hào)通路是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程密切相關(guān)〔3〕。其主要作用于基因表達(dá)的調(diào)控,是多種細(xì)胞因子的下游調(diào)控途徑〔4〕。JAK-STAT通路蛋白廣泛存在于海馬及大腦皮層,參與海馬缺血損傷修復(fù)、神經(jīng)細(xì)胞增殖等多種細(xì)胞活動(dòng)〔5〕。同時(shí),JAK-STAT通路的激活是多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的基礎(chǔ)。研究顯示,JAK-STAT通路可促進(jìn)突觸可塑性,在海馬神經(jīng)突觸的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)依賴突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)機(jī)制中發(fā)揮促進(jìn)作用〔6〕。有研究顯示首烏益智膠囊具有促神經(jīng)細(xì)胞增殖、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等多種神經(jīng)保護(hù)作用〔7,8〕,可改善VCI患者學(xué)習(xí)、記憶能力,臨床功效顯著。本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)法建立VCI大鼠模型,探討首烏益智膠囊對(duì)VCI大鼠的治療效果及其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制,為完善首烏益智膠囊的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠50只,體質(zhì)量(350±20)g,雌雄各半。大鼠均飼養(yǎng)在(25±1)℃無(wú)菌環(huán)境中,12 h光照/12 h黑暗周期,自由進(jìn)食和飲水。

1.2分組及給藥 取40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、VCI模型組、首烏益智膠囊組及尼莫地平組,每組10只。采用MCAO法對(duì)除假手術(shù)組外的大鼠進(jìn)行造模,將首烏益智膠囊(山東中醫(yī)藥研究院,批號(hào):魯藥制字 Z20110015)制成40 mg/ml的懸濁液,給首烏益智膠囊組進(jìn)行灌胃(1 ml/100 g),1次/d。將尼莫地平片(尼膜同,拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字 H20003010)制成30 mg/ml懸濁液,給尼莫地平組進(jìn)行灌胃(1 ml/100 g),1次/d。模型組及假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃,共14 d。14 d后,各組進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),21 d處死大鼠,進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.3VCI大鼠模型的制作 MCAO法建立VCI大鼠模型。5%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉后,固定大鼠頸前正中切口,分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)外動(dòng)脈。將尼龍縫合線于頸總動(dòng)脈至頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處導(dǎo)入,沿頸內(nèi)動(dòng)脈向大鼠顱內(nèi)推進(jìn),穿過(guò)大腦中動(dòng)脈起始端,直至大腦前動(dòng)脈近端。結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈,縫合切口,留取1 cm拴線尾端。缺血90 min后外拉拴線至頸內(nèi)動(dòng)脈,縫合切口。假手術(shù)組在不結(jié)扎、栓塞的情況下進(jìn)行相同手術(shù)。

1.4Morris水迷宮測(cè)試 于暗室中央放置圓形水池,距水面2 cm,不可見(jiàn)處固定平臺(tái),實(shí)驗(yàn)前對(duì)大鼠進(jìn)行4 d適應(yīng)性訓(xùn)練。正式測(cè)試時(shí),將大鼠于距原平臺(tái)最遠(yuǎn)處放下,120 s內(nèi)記錄大鼠找到平臺(tái)時(shí)間(逃逸潛伏時(shí)間)。24 h后,撤去平臺(tái),于相同位置放下大鼠,120 s內(nèi)記錄大鼠過(guò)平臺(tái)次數(shù)。

1.5透射電鏡觀察 干預(yù)14 d,每組隨機(jī)取5只大鼠,5%水合氯醛間斷腹腔注射法麻醉,4%多聚甲醛灌注,迅速斷頭剝離腦組織,在冰盒上沿冠狀位分離出海馬組織(1 mm3)數(shù)塊,進(jìn)行固定、蔗糖溶液脫水、20 μm超薄切片,每只大鼠取5張玻片醋酸鈾-硝酸鉛雙重染色,日立-H765透射電鏡觀察大鼠腦組織海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。

1.6Western印跡檢測(cè)p-JAK2、p-STAT3及JAK2、STAT3 蛋白表達(dá) 每組取剩余5只大鼠,5%水合氯醛間斷腹腔注射法麻醉,分離海馬組織后置于液氮中保存,檢測(cè)時(shí),將冰凍組織轉(zhuǎn)入勻漿緩沖液,加入蛋白酶抑制劑,離心后取上清液,二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒測(cè)定總蛋白濃度,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上,p-JAK2、p-STAT3及JAK2、STAT3一抗孵育一夜,洗滌3次,二抗孵育2 h,檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組Morris水迷宮測(cè)試 與假手術(shù)組比較,模型組、尼莫地平組及首烏益智膠囊組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),過(guò)站臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)。與模型組比較,尼莫地平及首烏益智膠囊組逃避潛伏期明顯縮短,過(guò)站臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05,P<0.01)。與尼莫地平組比較,首烏益智膠囊組逃避潛伏期明顯縮短,過(guò)站臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.01)。首烏益智膠囊可以保護(hù)MCAO大鼠免受缺血缺氧造成的認(rèn)知損害,改善大鼠的認(rèn)知能力。見(jiàn)表1。

表1 各組Morris 水迷宮測(cè)試及海馬組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)

2.2各組JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,模型組、尼莫地平組及首烏益智膠囊組海馬JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,首烏益智膠囊組JAK2蛋白表達(dá)顯著升高,尼莫地平組及首烏益智膠囊組p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01)。與尼莫地平組比較,首烏益智膠囊組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。首烏益智膠囊可以通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。見(jiàn)表1。

2.3各組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)觀察 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整,胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰,染色質(zhì)均勻分布。模型組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不規(guī)整,細(xì)胞核表面較粗糙,核內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂不齊,染色質(zhì)輕度凝聚,胞質(zhì)內(nèi)線粒體部分腫脹變性,尼氏體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)部分空泡。尼莫地平組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)尚規(guī)整,細(xì)胞核表面部分粗糙,核內(nèi)結(jié)構(gòu)尚完整可見(jiàn),少量線粒體腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)尚清晰,有輕度擴(kuò)張。首烏益智膠囊組海馬神經(jīng)元細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰,核膜光滑,雙層核膜可辨,胞質(zhì)中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微管等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整且清晰可見(jiàn),尼氏小體清晰,首烏益智膠囊可保護(hù)VCI大鼠損傷的神經(jīng)元,維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性。見(jiàn)圖1。

圖1 各組海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)(×4 000)

3 討 論

當(dāng)下,VCI病理機(jī)制尚不明確,基于不同發(fā)病機(jī)制,各類造模方法層出不窮。MCAO是目前常用的VCI模型之一,通過(guò)模擬海馬等關(guān)鍵部位梗死使大鼠出現(xiàn)認(rèn)知障礙。相較其他造模方案,MCAO可更好地模擬神經(jīng)元變性與凋亡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等嚴(yán)重腦組織損傷〔9,10〕。首烏益智膠囊由制首烏、益智仁、黃芪、天麻、丹參、地龍、遠(yuǎn)志、川芎等組成,采用補(bǔ)腎填精益氣、祛瘀化痰通竅之法,使腎精得充,瘀血得祛,血脈通暢〔7〕。本研究結(jié)果表明,首烏益智膠囊可顯著改善MCAO大鼠的記憶、學(xué)習(xí)能力。研究發(fā)現(xiàn),大鼠海馬組織與空間記憶、學(xué)習(xí)能力息息相關(guān),而缺血再灌注損傷造成的海馬神經(jīng)元凋亡是認(rèn)知能力損傷的主要因素〔11〕。本研究結(jié)果表明,首烏益智膠囊可保護(hù)受損傷的神經(jīng)元,維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整,抑制神經(jīng)細(xì)胞的壞死與凋亡。

首烏益智膠囊的神經(jīng)保護(hù)作用涉及多種活性成分及反應(yīng)機(jī)制。二苯乙烯苷是何首烏的特異性活性物質(zhì),在各類腦器質(zhì)性病變中起到神經(jīng)保護(hù)作用,可挽救突觸并抑制大腦中α-突觸核蛋白過(guò)表達(dá),從而改善其記憶和運(yùn)動(dòng)功能〔9〕。圓柚酮為益智仁主要活性成分,可作用于α-2a 腎上腺素能受體,進(jìn)而生成腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)神經(jīng)再生的效用〔12〕。黃芪、天麻富含多種甾體類、多糖類成分,其與促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖、抑制炎性反應(yīng)等具有廣泛聯(lián)系,可促進(jìn)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)2等內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖與代謝,同時(shí)使衰老、受損細(xì)胞存活〔13〕。丹參、地龍、川芎可有效提高腦血流量,并刺激一氧化氮合酶(NOS)3的生成,促進(jìn)血管擴(kuò)張及抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成,從而發(fā)揮血管保護(hù)及促血液流通作用〔14〕。本研究通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路證實(shí),首烏益智膠囊對(duì)MCAO大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。

JAK-STAT信號(hào)通路是近年研究細(xì)胞存活、增殖、分化的重點(diǎn)通路,先前眾多研究顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)與JAK-STAT通路的激活有關(guān)。JAK2 是JAKs家族中的重要組成部分之一,JAK2蛋白廣泛存在于大鼠神經(jīng)元與少數(shù)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi),其激活與炎性因子〔腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6等〕和生長(zhǎng)因子〔EGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等〕密切相關(guān)。最初,JAK2通過(guò)細(xì)胞膜受體結(jié)合作用磷酸化。隨后,p-JAK2激活細(xì)胞質(zhì)中STAT3,從而導(dǎo)致STAT3的二聚化,p-STAT3易位至細(xì)胞核,與特定元素結(jié)合,然后轉(zhuǎn)錄各種靶基因發(fā)揮作用〔15〕。研究顯示,STAT3可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化,抑制炎性反應(yīng),同時(shí)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),JAK-STAT信號(hào)通路可影響惡性NK細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯與凋亡〔16〕,保護(hù)新生神經(jīng)元。本研究結(jié)果證明,首烏益智膠囊通過(guò)激活JAK-STAT信號(hào)通路發(fā)揮促神經(jīng)元增殖、維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、抑制神經(jīng)元凋亡等神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上,首烏益智膠囊可顯著改善腦缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)元凋亡引起的認(rèn)知障礙,同時(shí)激活JAK-STAT信號(hào)通路,促進(jìn)神經(jīng)元增殖,抑制神經(jīng)元凋亡,減輕炎性反應(yīng),從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。