黃勇 蘇韞 龔紅霞 曾元丁 李春波 李婷婷

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室,甘肅 蘭州 730000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)病主要機(jī)制中慢性炎癥起重要作用,其中慢性發(fā)炎所導(dǎo)致的氣道重塑也是最主要的疾病特征之一。慢性氣道炎癥和氣道重構(gòu)變化由許多原因引起,導(dǎo)致不斷出現(xiàn)的呼吸系統(tǒng)體征和氣流問題受限〔1～3〕。研究證實,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9在胞外基質(zhì)破壞中發(fā)揮重要作用,促使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量堆積,并引起氣道重塑〔4,5〕。MMP組織抑制因子(TIMP)-1為MMP-9的抑制劑,能夠特異性控制MMP-9,而MMP-9/TIMP-1平衡在COPD發(fā)生機(jī)制中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。本實驗通過現(xiàn)代制劑工藝技術(shù)提取野菊花有效成分,制備野菊花顆粒,觀察野菊花顆粒對COPD大鼠氣道炎癥反應(yīng)及MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響,探討野菊花顆粒在治療COPD中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 SPF級Wistar大鼠72只,雌雄各一半,體質(zhì)量180～220 g〔甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心,動物質(zhì)量檢測合格證編號:62001000000165;許可編號:SCXK(甘)2011-0001〕。各組適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,隨機(jī)分為空白組,模型組,醋酸潑尼松(陽性對照)組,野菊花顆粒高、中、低劑量組。

1.2野菊花顆粒制備方法〔6〕稱重選取野菊花中藥材,在藥材中加入12倍的純水。先使用蒸餾法將藥材放入水蒸氣中5用于提取揮發(fā)油,再采集揮發(fā)油。將藥渣與水提液兩者濾過分開,保留其中的水提液,在濾出的藥渣中再加入8倍的水回流萃取1 h,過濾得到水提液,水提液合并后濃縮至相當(dāng)于最初藥材量質(zhì)量比的5倍,加入一定量的乙醇靜置至60%沉淀,在經(jīng)過高速離心后,吸取上清液減壓濃縮到需要的濃度。在之前提取的揮發(fā)油中加入泊洛沙姆188研磨均勻后再加入少量的濃縮藥液制作成初乳。而野菊花提取液是由揮發(fā)油初乳加上濃縮藥液混勻構(gòu)成。濃縮至稠膏狀(藥物相對密度為D1.40,即每毫升濃縮液里含藥物1.40 g),60 ℃ 常壓烘干,粉碎至40目成顆粒即可。

1.3模型制備 各組大鼠使用注射器在腹腔注射烏拉坦(1.4 g/kg)麻醉后,將其放置固定于操作臺上呈仰臥位,進(jìn)行消毒,沿氣管平行方向剪開頸部,將氣管暴露出,使用4號針頭刺入氣管,空白組注入生理鹽水,其余組均注入1 g/L的脂多糖200 μl建立COPD模型〔7,8〕;造模第2天起,空白組和模型組每日灌服等容積生理鹽水,給予陽性對照組醋酸潑尼松0.040 5 mg/(ml·d),野菊花低、中、高劑量組分別給予0.7、1.4、2.8 g/(kg·d)野菊花顆粒灌胃,共28 d。

1.4生化法檢測支氣管肺部組織羥脯氨酸濃度 治療28 d后,將各組大鼠右側(cè)肺組織取出,結(jié)扎支氣管,并注入磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,采集灌洗液備用。生化法分別檢測支氣管肺組織和血清中羥脯氨酸的濃度。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察各組右肺組織病理學(xué)形態(tài) 處死大鼠,剖開胸腔,剝離肺組織,將大鼠右肺組織置于4%多聚甲醛固定液中固定,石蠟包埋后進(jìn)行切片,依次進(jìn)行梯度二甲苯脫蠟,酒精梯度脫水,蘇木素染色,水洗,鹽酸酒精,水洗,酒精梯度脫水,伊紅染色,酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察其病理變化。

1.6免疫組織蛋白法檢測各組肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá) 將石蠟切片常規(guī)脫蠟后清洗3次,3%H2O2封閉10 min,PBS徹底清洗切片3次,每次5 min;然后進(jìn)行抗原修復(fù),加入一抗,濕盒4 ℃過夜后加入二抗,37 ℃孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,脫水封片后與光學(xué)顯微鏡下觀察。蛋白陽性表達(dá)顯示為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在圖像分析系統(tǒng)(CX21 型生物顯微鏡,日本 OLYMPUS 公司;MiE 圖像處理系統(tǒng),山東易創(chuàng)電子有限公司;BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng),成都泰盟科技有限公司) 20 倍物鏡下,每張切片隨機(jī)選取 5 個視野,測定肺組織內(nèi)MMP-9和TIMP-1表達(dá)顆粒的積分光密度,取其平均值作為該只大鼠的肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白相對表達(dá)量。

1.7實時(Real-time)熒光定量PCR檢測MMP-9和TIMP-1 mRNA表達(dá) 肺組織取材后,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行PCR,反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 5 min,變性95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 20 s,共循環(huán)40次。運用相對表達(dá)量2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列(5′→3′):MMP-9正向:CATGCGCTGGGCTTAGATCA,反向:GAGGCCTTGG-GTCAGGTTTAGAG,156 bp;TIMP-1正向:CATCTCTGGCCTCTGGCATC,反向:CATAACGCTGGTATAAGGTGGTCTC,148 bp;GAPDH正向:TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC,反向:AAGATGGTGATGGGCTTCCCG,130 bp。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組羥脯氨酸含量 與空白組比較,模型組羥脯氨酸含量異常增高(P<0.01);與模型組比較,陽性對照組、野菊花各劑量組羥脯氨酸含量表達(dá)均顯著減弱(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組肺組織羥脯胺酸含量、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)比較

2.2MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果表明,MMP-9、TIMP-1陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì),呈棕黃色或黃褐色顆粒。與空白組相比,模型組MMP-9、TIMP-1陽性表達(dá)著色較深,光密度值顯著升高(P<0.05);與模型組比較,醋酸潑尼松組及野菊花高、中、低劑量組陽性表達(dá)著色較淺,光密度值明顯降低(P<0.05),見表1、圖1。

2.3MMP-9和TIMP-1 mRNA表達(dá) 與空白組相比,模型組MMP-9、TIMP-1 mRNA 表達(dá)明顯增高(P<0.01);與模型組相比,野菊花高、中劑量組和醋酸潑尼松組MMP-9、TIMP-1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01),見表1。

2.4大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)觀察 HE結(jié)果表明,空白組肺部組織及支氣管結(jié)構(gòu)完好,黏膜表面光滑且腺體無增生,管壁各層均無明顯炎性細(xì)胞浸潤,支氣管腔內(nèi)也無滲出物。模型組支氣管黏膜上皮出現(xiàn)變性脫落,黏膜層明顯充血、水腫,視野中可見炎性細(xì)胞大量浸潤。與模型組比較,陽性對照組炎癥減輕,細(xì)支氣管腔內(nèi)可見排出少許分泌物,炎性細(xì)胞浸潤程度較輕。野菊花高劑量組可見肺組織少量炎性細(xì)胞浸潤,支氣管壁結(jié)構(gòu)完整、黏膜充血顯著減輕、腔內(nèi)無明顯分泌物,病變嚴(yán)重程度減低,病變區(qū)域縮小。野菊花中劑量組肺組織構(gòu)造完整,支氣管壁增厚不明顯,黏液分泌物減少,較少炎性細(xì)胞浸潤。野菊花低劑量組肺組織病變程度接近模型組,大量炎性細(xì)胞浸潤,支氣管管壁增厚明顯,分泌物明顯增多,見圖2。

3 討 論

目前普遍認(rèn)為MMP-9/TIMP-1系統(tǒng)的失衡是COPD發(fā)病中氣道重塑的主要機(jī)制之一。ECM的降解和沉積失衡在COPD發(fā)生氣道重構(gòu)、肺實質(zhì)破壞及間質(zhì)增生中扮演著重要的角色〔8,9〕。而MMPs在調(diào)節(jié)ECM代謝中也起到了主要作用。MMP-9作為主要限速酶是MMPs家族的一員,可以保障肺基底膜及其結(jié)構(gòu)支架的完整性、并在合成與降解平衡ECM中起至關(guān)重要的作用,與氣道重塑發(fā)生、發(fā)展密不可分〔10〕。在正常組織中MMP-9的表達(dá)極低,但是在一定刺激下其表達(dá)量升高例如炎性細(xì)胞因子。TIMPs能夠抑制MMPs的活性,具有改變正常ECM及各種病理過程的作用。其中,TIMP-1能夠特異性抑制MMP-9的生物學(xué)效應(yīng),從而降低基質(zhì)的降解,主要作用于阻斷MMP-9的活化及抑制已活化的MMP-9活性兩部分。因此,TIMP-1表達(dá)升高代表了氣道修復(fù)及重塑過程,是氣道纖維化的重要標(biāo)志。在氣道進(jìn)行炎癥和重塑的步驟中,MMP-9/TIMP-1系統(tǒng)失衡,會降解大量ECM成分,嚴(yán)重破壞基底膜。MMP-9升高,氣道炎癥反應(yīng)增強(qiáng),導(dǎo)致組織破壞;TIMP-1升高,可以修復(fù)氣道,導(dǎo)致組織重建。因此在炎癥損傷和氣道重塑階段,抑制MMP-9和TIMP-1的過度表達(dá),使MMP-9/TIMP-1系統(tǒng)平衡,成為阻止氣道重塑的有效途徑之一。

COPD在祖國醫(yī)學(xué)中可歸屬于“痰飲”“肺脹”“喘證”等范疇,其病位主要在肺,并涉及脾、腎、肝。病因包括吸煙等,吸煙導(dǎo)致人體內(nèi)津化為痰,得氣機(jī)運行受阻,生瘀化熱〔11〕。COPD急性發(fā)作期中醫(yī)病機(jī)主要為痰熱夾瘀,治法上以祛痰化瘀,宣肺泄熱為主〔12〕。野菊花性涼,味苦、辛,歸肺、肝經(jīng),具有清熱解毒、消散癰腫、疏風(fēng)平肝之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明,其活性成分主要有黃酮類、揮發(fā)油類、多糖、有機(jī)酸及微量元素等,具有良好具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)抑菌、抗病毒、抗氧化、肝保護(hù)、降血壓、降血脂及抗腫瘤等藥理作用〔13,14〕。有研究表明〔15〕,野菊花能通過核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎性因子產(chǎn)生,從而產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果表明,結(jié)締組織大量增生與破壞,發(fā)生氣道結(jié)構(gòu)重建。MMP-9、TIMP-1表達(dá)升高,表明氣道發(fā)生炎癥反應(yīng)和氣道重塑。而各治療組較模型組相比,羥脯氨酸含量下降,MMP-9、TIMP-1表達(dá)降低,表明野菊花顆粒對COPD大鼠模型氣道炎癥與重塑具有抑制作用,野菊花顆粒明顯降低了COPD模型大鼠肺組織中羥脯氨酸濃度和MMP-9、TIMP-1的表達(dá)水平,從而減輕氣道炎癥與重塑,為臨床用于治療COPD提供了科學(xué)依據(jù)。