程健祥 杜文升 魏敏 王光慧

1徐州醫(yī)科大學(xué)研究生院（江蘇徐州 221004）；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科（江蘇徐州 221002）

卵巢癌是婦科最常見的三大癌癥之一，致死率位于婦科惡性腫瘤之首。卵巢癌發(fā)病初期沒有明顯的臨床癥狀，導(dǎo)致大約70%的患者就診時候為晚期，而且大約70%的卵巢癌患者在治療3年后會再次復(fù)發(fā)［1］，因此晚期卵巢癌的五年生存率低至30%［2］。即使現(xiàn)在外科技術(shù)飛速發(fā)展，卵巢癌的治療和預(yù)后仍沒有明顯改善［3-4］。卵巢癌惡性程度高，侵襲性強而且預(yù)后極差，目前其發(fā)病原因、分子機制仍然沒有明確共識。因此，研究卵巢癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，尋找到有效的治療靶點顯得尤為重要。

LMNB1 是V 型中間絲蛋白家族的重要成員之一，與LMNA、LMNC、LMNB2 一起組成了核層（NL）的主要成分V 型中間絲蛋白［5］。據(jù)報道，LMNB1廣泛的參與多種生物活動，如DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、細胞周期的調(diào)節(jié)、核遷移和凋亡、細胞的增殖和分化［6］。近年來，關(guān)于LMNB1 在腫瘤中的作用越來越引起人們的關(guān)注，TANG 等［7］的研究表明LMNB1 在肺癌中作為腫瘤促進因子，并且LMNB1的敲低可以調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡。王瑞官等［8］通過siRNA 敲低LMNB1 在肝癌HepG2 和Hep3B 細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)LMNB1 可以顯著降低端粒酶活性，細胞增殖和侵襲能力，表明LMNB1 有望成為評價肝癌患者臨床預(yù)后的指標。據(jù)報道，LMNB1 的過表達同樣與前列腺癌、宮頸癌、胰腺癌和肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9-11］。然而，LMNB1 在卵巢癌中的作用及臨床意義知之甚少，本研究通過實驗分析LMNB1 在卵巢癌中的表達及其對卵巢癌SKOV3細胞生物學(xué)行為的影響，并通過生物信息學(xué)初步探討LMNB1 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的具體機制，以期為卵巢癌的靶向治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2019年9月至2022年12月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科卵巢癌患者手術(shù)切術(shù)標本68 例，正常卵巢組織27 例。所有卵巢癌患者均經(jīng)病理科醫(yī)生明確診斷為卵巢癌，術(shù)前均未接受放化療、排除合并其他惡性腫瘤和免疫系統(tǒng)疾病。正常卵巢組織來源于生殖系統(tǒng)良性疾病患者的手術(shù)切除標本。所有患者臨床病例資料完整，均簽署知情同意書，本研究已經(jīng)獲得徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會的批準（XYFY2023-KL106-01）。

1.2 細胞系及實驗材料正常卵巢上皮細胞IOSE80，卵巢癌細胞SKOV3、A2780、CAOV3 均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。RPMI-1640 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco 公司。LMNB1 兔抗人抗體、MMP-2 兔抗人抗體、MMP-9 兔抗人抗體購自Proteintech 公司。SDS-PAGE 制膠試劑盒購自上海雅酶生物技術(shù)有限公司。Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD 公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司。Edu 細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)公司。

1.3 數(shù)據(jù)庫信息處理和分析TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫下載LMNB1 在卵巢癌上表達情況的相關(guān)信息，R 語言處理將患者按照表達量中位數(shù)分為高表達組和低表達組，并繪制相關(guān)表達差異圖。Kaplan-Meier Plotter 分析LMNB1 的表達量和卵巢癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，R 軟件中pROC 包用于分析，ggplot 包繪制ROC 曲線。

1.4 免疫組化將所有組織的石蠟切片烘烤后，放入不同濃度梯度的二甲苯和酒精溶液中進行脫蠟和水化，用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液在微波爐中進行抗原修復(fù)。PBS 浸泡，滴加3%過氧化氫覆蓋組織以去除過氧化氫酶。稀釋后的一抗滴于標本玻片上，4oC 孵育過夜。次日，取出濕盒恢復(fù)室溫，按照超敏二步法試劑盒說明書進行DAB 染色。再經(jīng)過蘇木素染核，鹽酸酒精分化、返藍、脫水封片，即可顯微鏡下觀察。

1.5 Western blot在冰上用RIPA 法提取各組細胞和組織蛋白，BCA 法測量蛋白濃度后，配平制作樣品。配制10%的SDS-PAGE 分離膠，上好樣品后，分離膠80 V 電泳30 min，濃縮膠120 V 電泳90 min。將提前裁剪好的PVDF 膜甲醇預(yù)激30s，110 V 恒流濕轉(zhuǎn)1.5 h。5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST清洗后，4oC 過夜孵育一抗。次日，TBST 清洗3 次，孵育二抗2 h，TBST 洗膜3 次后，顯影儀進行顯影并拍照。

1.6 細胞劃痕實驗用Marker 筆在6 孔板背后垂直劃3 條線，將生長狀態(tài)良好的各組細胞均勻種植于六孔板中，待細胞生長完全融合后，用移液槍頭垂直于細胞平面用力均勻劃痕，PBS 沖洗3 遍，洗去劃落的細胞。將細胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在0、24、48 h 取出細胞，顯微鏡觀察并拍照。

1.7 Transwell 實驗選取各組生長狀態(tài)良好的細胞，胰酶消化后用不完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整好細胞密度吸取200 μL 置于小室上層，在小室下層加入600 μL 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后，取出小室，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗3 次。4%多聚甲醛固定30 min 后棄去固定液，結(jié)晶紫染色20 min，PBS 清洗3 遍，棉簽輕輕擦去內(nèi)室細胞，顯微鏡下觀察并拍照。侵襲實驗使用Matrigel 基質(zhì)膠包被小室，其余操作和遷移實驗相同。

1.8 EdU 細胞增殖實驗選取對數(shù)生長期細胞，接種于96 孔板，按照試劑說明書進行EdU 標記、細胞固定化、Apollo 染色、DNA 染色、拍照并統(tǒng)計。

1.9 集落形成實驗將處于對數(shù)生長期的各組細胞用胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)板計數(shù)，以每孔500 細胞的數(shù)目接種于6 孔板中，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，肉眼可見克隆后，4%多聚甲醛固定，PBS 清洗，用結(jié)晶紫染液進行染色20 min，PBS 洗滌后，晾干，拍照并統(tǒng)計。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法所有研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0，GraphPad Prism 8.0 進行統(tǒng)計分析并繪制相應(yīng)統(tǒng)計圖，獨立樣本t檢驗比較兩組樣本間的差異；不滿足t檢驗條件的采用非參數(shù)檢驗。P＜ 0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析LMNB1 在卵巢癌上的表達和預(yù)后情況通過TCGA 數(shù)據(jù)庫和GEO 數(shù)據(jù)庫分析LMNB1 在卵巢癌和正常卵巢上的表達差異，結(jié)果顯示LMNB1 在卵巢癌上高表達（P＜ 0.01）。Kaplan-Meier Plotter 分析LMNB1 的表達和卵巢癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，結(jié)果表明LMNB1 的高表達和卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān)（P＜ 0.05）。R 軟件中pROC 包用來分析LMNB1 在卵巢癌中潛在診斷價值，結(jié)果顯示：ROC 曲線下面積（AUC）為0.981，表明LMNB1 在卵巢癌中具有良好的診斷價值。見圖1。

圖1 數(shù)據(jù)庫分析LMNB1 在卵巢癌上的表達和預(yù)后情況Fig.1 The expression of LMNB1 and its prognostic value in ovarian cancer based on TCGA database

2.2 免疫組化檢測LMNB1 蛋白在卵巢癌組織中的表達卵巢癌組織中LMNB1 的陽性表達率為75%（51/68），在正常卵巢組織中的陽性表達率為22%（6/27）。與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織的LMNB1 陽性表達率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 免疫組化檢測LMNB1 在卵巢癌組織及在正常卵巢組織中的表達情況（×200）Fig.2 The expression of LMNB1 in ovarian cancer tissues and normal ovarian tissues is detected by immunohistochemistry（×200）

2.3 卵巢癌組織中LMNB1 表達與臨床病理因素的關(guān)系LMNB1 陽性表達率與患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型無明顯相關(guān)性（P＞ 0.05）；而腫瘤的FIGO 分期、組織學(xué)分級等與LMNB1 的陽性表達有相關(guān)性（P＜ 0.05）。見表1。

表1 LMNB1 表達與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between LMNB1 protein expression and clinicopathological features in 68 cases of ovarian cancer例

2.4 LMNB1 在卵巢癌細胞上的表達情況以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建Western blot 檢測LMNB1 在卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞的表達情況，結(jié)果顯示：LMNB1 在卵巢癌細胞上的表達明顯高于正常卵巢細胞（P＜ 0.01），其中LMNB1 在SKOV3 細胞系中表達量高，用慢病毒轉(zhuǎn)染進卵巢癌SKOV3細胞，構(gòu)建穩(wěn)定敲低LMNB1 的卵巢癌細胞系SKOV3。Western blot 實驗檢測敲低效果，結(jié)果顯示sh-LMNB1#2 的慢病毒敲低效果最好，選取2 號慢病毒用于后續(xù)實驗，并命名為sh-LMNB1 組，對照組為sh-NC。見圖3。

2.5 敲低LMNB1 的表達對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響CCK-8 實驗結(jié)果顯示，與sh-NC 組相比，sh-LMNB1 組卵巢癌細胞增殖能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。EdU 細胞增殖實驗結(jié)果表明，下調(diào)LMNB1 的表達后，EdU陽性細胞比例減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。細胞集落形成實驗結(jié)果表明，下調(diào)LMNB1 的表達后，卵巢癌細胞SKOV3 的集落形成能力顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。細胞劃痕實驗和Transwell 實驗結(jié)果顯示：下調(diào)LMNB1 的表達，可以顯著抑制卵巢癌SKOV3 細胞的侵襲和遷移能力。Western blot 實驗檢測LMNB1 對促進侵襲蛋白MMP-2、MMP-9 和抑制侵襲蛋白TIMP-1 的影響，結(jié)果顯示：下調(diào)LMNB1 的表達后，促進侵襲蛋白MMP-2、MMP-9 表達量也隨之下降，抑制侵襲蛋白TIMP-1 的表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。以上結(jié)果表明LMNB1 可以促進卵巢癌SKOV3 的增殖、遷移和侵襲能力。見圖4。

2.6 生物信息學(xué)分析LMNB1 的潛在功能和基因通路通過String 和GeneMania 數(shù)據(jù)庫分析出和LMNB1 共表達的基因，并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，隨后對共表達基因進行GO 分析和KEGG 分析以便研究LMNB1 的潛在生物學(xué)功能和通路。富集分析結(jié)果顯示：在生物學(xué)過程（BP）主要參與NDA 包裝、有絲分裂、核組織等；分子功能（MF）主要包括核小體結(jié)合、核纖層蛋白綁定、組蛋白激酶活性等；細胞成分（CC）主要位于核內(nèi)膜、核被膜等；KEGG 分析信號通路主要在PI3K-AKT、P53、細胞周期、細胞凋亡等信號通路上。見圖5。

3 討論

卵巢癌是婦科最常見的腫瘤之一，同時也是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。卵巢癌早期癥狀不明顯，缺乏早期有效的篩查手段，高達70%的卵巢癌患者直至晚期才被發(fā)現(xiàn)，而且卵巢癌惡性程度高，導(dǎo)致晚期卵巢癌患者5年生存率低于30%［12-13］，嚴重威脅女性身體健康。因此，急需尋找卵巢癌新的有效的治療靶點。

圖3 LMNB1 在敲低卵巢癌細胞中的效率驗證Fig.3 Efficiency verification of LMNB1 in ovarian cancer cells after knocking down LMNB1

核纖層是緊貼在內(nèi)核膜的一層高密度纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，廣泛存在于真核細胞中，核纖層由核纖層蛋白（Lamins）組成［5］，Lamins 被認為是IF 家族中V型成員。根據(jù)Lamins 的編碼基因不同，將Lamins分成A 型、B 型和C 型，而B 型又分為Lamin B1 和Lamin B2 兩種亞型［14-16］。LMNB1 可以保持細胞核的完整性，調(diào)節(jié)細胞增殖和衰老、DNA 復(fù)制以及DNA 損傷的修復(fù)［17］。CHEN 等［18］的研究表明，層粘連蛋白B1 或?qū)诱尺B蛋白B2 的缺乏會導(dǎo)致遷移神經(jīng)元的核膜（NM）破裂，伴隨著DNA 損傷和細胞死亡。近年來，關(guān)于LMNB1 在腫瘤方面的作用引起越來越多的學(xué)者注意，據(jù)報道LMNB1 在許多腫瘤中異常表達，例如在肺腺癌、前列腺癌和宮頸癌等中高表達，并通過不同的途徑促進癌癥的進展［15，19］。而LMNB1 在卵巢癌中的作用如何目前尚未見報道，本研究前期通過數(shù)據(jù)庫信息發(fā)現(xiàn)LMNB1 在卵巢癌中高表達并且可能預(yù)示著卵巢癌患者的不良預(yù)后，因此我們擬研究LMNB1 在卵巢癌進展中的機制，以期為卵巢癌的治療提供一種新的思路。

在本研究中，我們通過免疫組化法檢測LMNB1在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達差異，結(jié)果顯示：LMNB1在卵巢癌組織中表達水平顯著升高（P＜ 0.05）。隨后，我們從細胞層面通過Western blot 實驗檢測LMNB1 在多種卵巢癌細胞中的表達情況，我們發(fā)現(xiàn)LMNB1 在卵巢癌細胞中的表達明顯高于正常卵巢細胞，并且在卵巢癌SKOV3 細胞中表達量最高。之后，我們采用慢病毒轉(zhuǎn)染進卵巢癌SKOV3細胞，通過CCK8實驗、平板克隆實驗、EdU 細胞增殖實驗和Transwell 實驗檢測LMNB1 表達水平的改變對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果表明，隨著LMNB1 基因的沉默，卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為能力也隨之減弱。

MMP-2 和MMP-9 是MMPs 家族中的一員，MMP-9 可以降解細胞外蛋白質(zhì)成分，參與細胞外基質(zhì)蛋白的重組和消除細胞遷移的物理屏障，被認為是促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的標志物［20-21］。本研究結(jié)果顯示當(dāng)LMNB1 表達量下降時，MMP-2 和MMP-9 的表達量隨之下降，TIMP1 的表達量升高，表明LMNB1 可能通過激活MMP 的活性促進卵巢癌細胞的侵襲能力。

圖4 敲低LMNB1 抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲能力Fig.4 LMNB1 Koncking down LMNB1 inhibits proliferation ，migration and invasion ability of ovarian cancer cells

通過以上研究結(jié)果表明，LMNB1 在卵巢癌組織中高表達，并且扮演促癌因子的角色，可以促進卵巢癌細胞的惡性生物學(xué)行為。為了研究LMNB1潛在的生物學(xué)功能和促進卵巢癌進展?jié)撛诘姆肿訖C制，我們通過生物信息學(xué)構(gòu)建LMNB1 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，同時通過富集分析到LMNB1 很有可能通過P53 信號通路和PI3K-AKT 信號參與卵巢癌細胞周期和細胞凋亡的調(diào)節(jié)，但其具體調(diào)節(jié)機制仍需進一步的實驗來驗證闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LMNB1 在卵巢癌組織中高表達，并且與卵巢癌患者臨床病理特征密切相關(guān)，通過細胞學(xué)實驗，我們發(fā)現(xiàn)LMNB1 表達量的下調(diào)可以顯著抑制卵巢癌SKOV3 細胞增殖、遷移和侵襲能力。并且我們通過生物信息學(xué)預(yù)測到LMNB1 可能通過P53 信號通路、PI3K-AKT 信號通路參與卵巢癌的進展，但其具體機制仍需進一步實驗進行驗證和深入研究。

圖5 LMNB1 共表達基因功能富集分析Fig.5 The enrichment analysis of LMNB1 co-expression genes

【Author contributions】CHENG Jianxiang performed the experiments and wrote the article.WEI Min and WANG Guanghui performed the experiments.DU Wensheng and WEI Min revised the article.DU Wensheng designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.