亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        STT3A和STT3B在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

        2023-10-08 10:10:56孫崇鳳楊萍侯紀(jì)帥趙鄒宇于盼盼
        實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2023年16期
        關(guān)鍵詞:卵巢癌上皮卵巢

        孫崇鳳 楊萍 侯紀(jì)帥 趙鄒宇 于盼盼

        1石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科(新疆石河子 832008);2國(guó)家衛(wèi)生健康委中亞高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(新疆石河子 832008)

        上皮性卵巢癌(EOC)是起源于卵巢或輸卵管上皮的惡性程度極高的腫瘤,占卵巢惡性腫瘤所有類型的85%以上[1]。EOC 的高增殖和高侵襲能力是患者預(yù)后差的主要原因之一[2],研究EOC 的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要臨床意義,可為EOC 有效分子治療提供新的思路。N-連接糖基化(N-linked glycosylation)是蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中重要的修飾方式,其參與血管生成,免疫逃逸和耐受,腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程[3-4]。有研究[5-6]顯示,抑制N-糖基化過(guò)程,可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答,從而激活相關(guān)蛋白促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。寡糖轉(zhuǎn)移酶(OST)是這種N-糖基化過(guò)程的中心酶,催化定義明確的寡糖供體底物的轉(zhuǎn)移[7]。寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化亞基STT3是哺乳動(dòng)物中OST 復(fù)合物中主要的催化亞基,以STT3A 和STT3B 的形式存在[8],研究表明,STT3A和STT3B 在部分實(shí)體腫瘤中高表達(dá),且與患者預(yù)后密切相關(guān)。由此推測(cè)STT3A 和STT3B 在EOC 中亦可能存在差異表達(dá),但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于STT3A和STT3B 與EOC 的研究較少,STT3A 和STT3B 在EOC 中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性尚不明確。為此,本研究通過(guò)分析STT3A 和STT3B 在EOC 患者中的表達(dá)情況及其與患者臨床病理信息和預(yù)后的關(guān)系,為日后進(jìn)一步研究STT3A和STT3B在EOC發(fā)生和發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ),亦為EOC 患者的靶向治療提供新思路。

        1 資料與方法

        1.1 研究對(duì)象

        1.1.1 病例資料選擇2010年10月至2019年12月在本院收治的88 例EOC 患者癌組織為觀察組,同期收集22 例非EOC(子宮肌瘤、子宮腺肌病或者卵巢良性腫瘤)患者正常的輸卵管上皮及卵巢組織作為對(duì)照組。因目前學(xué)說(shuō)認(rèn)為卵巢高級(jí)別漿液性癌起源于輸卵管上皮,故高級(jí)別EOC 組織的正常對(duì)照選擇正常輸卵管上皮;其他EOC 組織的正常對(duì)照為正常卵巢組織[9]。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)后病理組織學(xué)檢查診斷為原發(fā)的EOC;(2)術(shù)前未接受過(guò)放化療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)未進(jìn)行手術(shù)的卵巢癌患者;(2)合并其他惡性腫瘤、免疫疾??;(3)術(shù)前接受過(guò)放療、化療或免疫治療。88 例EOC 患者基本臨床信息見(jiàn)表1。此項(xiàng)研究經(jīng)過(guò)石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):KJX-2021-111-02),所有參與人員皆簽署了《知情同意書》。

        表1 88 例EOC 患者臨床病理資料Tab.1 The clinicopathological data of 88 EOC patients

        1.1.2 細(xì)胞株及試劑EOC細(xì)胞系(SKOV3/A2780)和正常卵巢上皮細(xì)胞(IOSE-80)均購(gòu)自北納生物公司細(xì)胞庫(kù);McCoy's 5A 培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)博士德公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Ominmabs 公司;胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司;STT3A(12034-I-AP),STT3B(15323-I-AP),SP 染色試劑盒,DAB 試劑盒,蘇木精染色劑,抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

        1.2 方法

        1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法(Immunohistochemistry,IHC)將EOC及正常對(duì)照的組織標(biāo)本切片,依次在二甲苯中脫蠟,乙醇梯度脫水,雙蒸水水化,枸櫞酸溶液熱修復(fù),冷卻后,經(jīng)過(guò)PBS 溶液沖洗切片(3 次),在室溫條件下,雙氧水封閉10 min,再使用PBS 溶液沖洗切片(3 次),滴加適量相應(yīng)的一抗[STT3A(稀釋濃度為1∶400);STT3B(稀釋濃度為1∶400)],4 ℃過(guò)夜。次日早,切片在37 ℃烘箱或者室內(nèi)恢復(fù)至室溫,經(jīng)過(guò)PBS 溶液連續(xù)清洗切片(3 次),滴入濃度適當(dāng)量的生物素標(biāo)記的二抗,孵育30 min,PBS 溶液連續(xù)清洗切片(3 次),顯色液顯色延長(zhǎng)20s,蘇木素復(fù)染,乙醇梯度脫水處理,中性樹膠封片。

        1.2.2 結(jié)果評(píng)定所有結(jié)果均由2 位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師在普通光學(xué)顯微鏡下通過(guò)雙盲法對(duì)兩組切片染色情況按評(píng)分細(xì)則進(jìn)行評(píng)分。染色范圍評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:陽(yáng)性細(xì)胞的比例評(píng)分為1=0~10%,2=10%~25%,3=50%~75%,4=75%~100%。染色強(qiáng)度評(píng)分為0=無(wú)染色,1=弱染色,2=中度染色,3=強(qiáng)染色。最終的IHC 評(píng)分為以上兩個(gè)評(píng)分的乘積。IHC評(píng)分 ≤ 6分,為低表達(dá)組;> 6 分為高表達(dá)組[10]。

        1.2.3 患者術(shù)后隨訪所有EOC 患者一般在完成了初次手術(shù)治療之后即可開始進(jìn)行隨訪,隨訪的方法:< 2年每隔3 個(gè)自然月1 次,2~5年每6 個(gè)月1 次,> 5年隨訪者應(yīng)至少每1年1 次,臨床表現(xiàn)明顯異常的患者縮短隨訪間隔時(shí)間。

        1.2.4 總蛋白的提取及Western blot 檢測(cè)收集SKOV-3、A2780、IOSE-80 細(xì)胞,用RIPA 和PMSF 提取各組蛋白,以BCA 法測(cè)蛋白濃度并調(diào)齊蛋白濃度,100 ℃加熱5 min,電泳(10%聚丙酰胺凝膠,80 V,110 min),轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn),80 V,90~110 min),BSA封閉,TBST 溶液清洗(5次),進(jìn)行一抗孵育[山羊抗鼠STT3A 多克隆抗體(1∶2 000);山羊抗兔STT3B 多克隆抗體(1∶2 000)和山羊抗鼠β-actin單克隆抗體(1∶5 000)],4 ℃過(guò)夜,次日洗膜后,加入相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h,TBST 溶液清洗(3 次),ECL 化學(xué)發(fā)光,Bio-Rad 成像系統(tǒng)曝光顯影獲取圖像。

        1.2.5 生物信息學(xué)分析通過(guò)GENT2(http://gent2.appex.kr/gent2/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載1 516 例卵巢癌組織和110 例正常卵巢組織的STT3A 和STT3B 表達(dá)譜數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0和R 軟件3.5.3。對(duì)于計(jì)量資料,以表示;正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用Kruskal Wallis 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于計(jì)數(shù)資料,采用χ2檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。選擇Kaplan-Meier 法來(lái)進(jìn)行生存分析,并通過(guò)Graphpad Prism(v7.0)軟件進(jìn)行生存曲線的繪制。采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模擬分析各種影響患者生存率的風(fēng)險(xiǎn)因素,將有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的單變量因素納入多變量分析之中。STT3A 與STT3B 蛋白表達(dá)相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析。采用R 軟件建立列線圖模型,比較ROC 曲線、校正曲線以確定預(yù)后模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 STT3A和STT3B在卵巢癌中高表達(dá)通過(guò)下載GENT2 卵巢癌數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示STT3A和STT3B 在卵巢癌中高表達(dá)(P< 0.05)。

        2.2 STT3A和STT3B在EOC組織中高表達(dá)IHC染色法檢測(cè)88 例觀察組和22 例對(duì)照組中STT3A和STT3B 的表達(dá)水平(圖2)。STT3A 和STT3B 在高級(jí)別漿液性卵巢癌與輸卵管上皮中的高表達(dá)率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),見(jiàn)表2。而非高級(jí)別漿液性卵巢癌即其他類型的EOC 中,STT3A 和STT3B 高表達(dá)率與正常卵巢也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),見(jiàn)表3。

        圖2 STT3A 和STT3B 在EOC 組織和對(duì)照組織的免疫組化代表性圖片(IHC×400,標(biāo)尺50 μm)Fig.2 Representative pictures of immunohistochemistry of STT3A and STT3B in EOC tissues and control tissues(IHC×400,scale 50 μm)

        表2 STT3A 和STT3B 在高級(jí)別漿液性卵巢癌和正常輸卵管上皮中的表達(dá)Tab.2 The expression of STT3A and STT3B in high-grade serous carcinoma and normal oviduct parietal epithelial tissues例

        表3 STT3A 和STT3B 在非高級(jí)別漿液性卵巢癌和正常卵巢中的表達(dá)Tab.3 The expression of STT3A and STT3B in non-highgrade serous carcinoma and normal ovarian例

        2.3 EOC 組織中STT3A 和STT3B 表達(dá)的相關(guān)性分析在EOC 組織中,STT3A和STT3B蛋白同時(shí)高表達(dá)有40例(45.5%),同時(shí)低表達(dá)有18例(20.5%),STT3A 高表達(dá)、STT3B 低表達(dá)有17 例(19.3%),STT3A 低表達(dá)、STT3B 高表達(dá)有13 例(14.7%)。Spearman 秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,STT3A 和STT3B之間具有正相關(guān)的關(guān)系(r=0.511 9,P< 0.001)。

        2.4 卵巢癌細(xì)胞中STT3A 和STT3B 的表達(dá)Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:SKOV-3 和A2780 細(xì)胞中STT3A 和STT3B 的表達(dá)均比IOSE-80 高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),見(jiàn)圖3。

        圖3 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞系中STT3A、STT3B 的表達(dá)情況Fig.3 The expression of STT3A and STT3B in cell lines detected by Western blot

        2.5 STT3A 和STT3B 在EOC 組織中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系STT3A 在EOC 組織中表達(dá)水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。STT3B 在EOC 組織中的表達(dá)與FIGO 分期、腫瘤分化程度、血清CA125 水平、淋巴脈管間隙浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),見(jiàn)表4。

        表4 88 例EOC 組織中STT3A 和STT3B 的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系Tab.4 The relationship between the expression of STT3A and STT3B in 88 EOC tissue and clinical characteristics of patients例(%)

        2.6 STT3A 和STT3B 在EOC 組織中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系對(duì)EOC 患者進(jìn)行隨訪,時(shí)間截止為2023年1月30日,共計(jì)隨訪148 個(gè)月,中位隨訪時(shí)間為50(4~148)個(gè)月,其中在訪82例,失訪6例,隨訪率為93.2%,復(fù)發(fā)37 例,死亡30 例。Kaplan-Meier 生存分析顯示,STT3A 高表達(dá)組患者的OS 及PFS 均顯著低于低表達(dá)組(圖4A),STT3B 高表達(dá)組患者的OS及PFS均顯著低于低表達(dá)組(圖4B)。

        圖4 EOC 組織中STT3A、STT3B 表達(dá)與患者OS 及PFS 的關(guān)系Fig.4 The relationship between the expression of STT3A and STT3B in EOC cancer cells with patients' OS and PFS

        2.7 預(yù)測(cè)模式的建立和驗(yàn)證根據(jù)單因素Cox 回歸模型,在EOC 患者中,年齡、FIGO 分期、腫瘤分化程度、STT3A 和STT3B 高表達(dá)是影響EOC 患者PFS 的單變量風(fēng)險(xiǎn)因素。將上述因素納入多因素Cox 回歸模型中,結(jié)果表明:年齡、腫瘤分化程度、STT3A 和STT3B 高表達(dá),為EOC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表5)。

        將年齡、腫瘤分化程度、STT3A 和STT3B 高表達(dá)納入構(gòu)建預(yù)測(cè)EOC 患者生存的列線圖(圖5A)。校準(zhǔn)曲線顯示,在EOC 患者的1、3、5年P(guān)FS 中,列線圖預(yù)測(cè)的概率和實(shí)際概率之間具有良好的一致性(圖5B)。同時(shí),1、3、5年P(guān)FS的ROC 曲線下面積分別為0.796、0.758、0.854(圖5C)。預(yù)測(cè)模型c-指數(shù)為0.748,預(yù)測(cè)效果較好。

        同理,F(xiàn)IGO 分期、腫瘤分化程度、淋巴脈管間隙浸潤(rùn)、STT3A 和STT3B 高表達(dá)是影響EOC 患者OS 的單變量風(fēng)險(xiǎn)因素。腫瘤分化程度、STT3A 和STT3B 高表達(dá),為EOC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表6)。構(gòu)建預(yù)測(cè)EOC患者生存的列線圖(圖6A)。校準(zhǔn)曲線顯示,在EOC 患者的1、3、5年OS 中,列線圖預(yù)測(cè)的概率和實(shí)際概率之間具有良好的一致性(圖6B)。同時(shí),1、3、5年OS 的ROC 曲線下面積分別為0.694、0.755、0.828(圖6C)。預(yù)測(cè)模型c-指數(shù)為0.733,預(yù)測(cè)效果較好。

        3 討論

        近年來(lái),EOC 的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì),EOC 仍然是婦科中病死率最高的疾?。?1]。雖然腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及靶向藥物的臨床應(yīng)用很大程度上改善了患者的預(yù)后,但EOC 的總體復(fù)發(fā)及病死率仍較高,綜合治療后的生存率仍較低。因此,尋找早期的診斷和治療新靶點(diǎn)及改善EOC 患者預(yù)后的因素尤為迫切。

        OST 是蛋白質(zhì)N-糖基化過(guò)程中重要的調(diào)控因子[7],STT3 作為OST 高度保守的催化亞基,在人類組織中廣泛表達(dá)。并且現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)支持STT3A和STT3B 與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PATEL 等[12]通過(guò)檢測(cè)甲狀腺癌中STT3A 的表達(dá),發(fā)現(xiàn)有73%的甲狀腺濾泡性癌中STT3A 高表達(dá)。CHENG 等[13]研究結(jié)果顯示相對(duì)于正常肺組織而言,STT3A 在肺腺癌組織中的表達(dá)更高。DING等[14]研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌患者癌組織中STT3A 和STT3B 高表達(dá)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)初步研究發(fā)現(xiàn),STT3A 和STT3B 在卵巢癌中高表達(dá),進(jìn)一步通過(guò)組織及細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)證實(shí),STT3A 及STT3B蛋白在EOC 癌細(xì)胞中高表達(dá),這表明STT3A 及STT3B 的表達(dá)與EOC 的發(fā)生發(fā)展可能有一定的關(guān)系。通過(guò)分析STT3A 和STT3B 與EOC 患者臨床病理特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)STT3A 高表達(dá)與低分化程度、存在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示STT3A 高表達(dá)可能與較高的腫瘤惡性程度有關(guān);同時(shí),STT3B 高表達(dá)與FIGO 分期(Ⅲ-Ⅳ期)、低分化程度、血清CA125 水平(≥ 200 μL)、存在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有淋巴脈管間隙浸潤(rùn)等因素有關(guān),提示STT3B高表達(dá)與EOC 進(jìn)展可能有重要聯(lián)系。以上結(jié)果表明,STT3A 和STT3B 的高表達(dá)可能與EOC 侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。

        表5 EOC 患者PFS 的單因素和多因素Cox 回歸分析Tab.5 Univariate and multivariate Cox regression analysis of PFS in EOC patients

        表6 EOC 患者OS 的單因素和多因素Cox 回歸分析Tab.6 Univariate and multivariate Cox regression analysis of OS in EOC patients

        圖5 PFS 列線圖預(yù)后模型Fig.5 Nominegram prognostic model of PFS

        圖6 OS 列線圖預(yù)后模型Fig.6 Nominegram prognostic model of OS

        文獻(xiàn)報(bào)道,STT3A 和STT3B 的高表達(dá)與上皮來(lái)源的惡性腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)[14-16]。RUAN等[15]研究證實(shí)了STT3A 和STT3B 在結(jié)腸腺癌患者的癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá),且根據(jù)無(wú)病生存期分析,發(fā)現(xiàn)STT3A 和STT3B 與患者的預(yù)后不良有關(guān)。MA等[16]研究結(jié)果顯示STT3A 在鼻咽癌中高表達(dá),且STT3A 高表達(dá)與晚期鼻咽癌相關(guān)。DING 等[14]通過(guò)OS 分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的STT3A 和STT3B 與患者的預(yù)后不良相關(guān),同時(shí)STT3A 和STT3B 與乳腺癌患者的年齡、分級(jí)、TMN 分期等臨床病理特征具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中,通過(guò)Kaplan-Meier 分析發(fā)現(xiàn),EOC 中STT3A 和STT3B 表達(dá)越高,患者的預(yù)后越差,提示STT3A 和STT3B 的異常表達(dá)可能與患者的預(yù)后不良有關(guān),與上述研究結(jié)果趨勢(shì)一致。同時(shí),Cox 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果顯示,年齡、腫瘤分化程度、STT3A 和STT3B 蛋白高表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。為了更好地評(píng)估個(gè)體化生存預(yù)期并規(guī)劃EOC 患者個(gè)體化治療的短期隨訪,構(gòu)建基于Cox 結(jié)果的列線圖預(yù)后模型,結(jié)果顯示該預(yù)后模型具有較好的預(yù)測(cè)性能。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了STT3A 和STTB 可能是EOC 患者預(yù)后中的關(guān)鍵因素。

        綜上所述,本研究結(jié)果表明STT3A 和STT3B在EOC 中高表達(dá),且與EOC 患者臨床病理特征具有一定的聯(lián)系,可能與EOC 的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在EOC 組織中,STT3A 和 STT3B 表達(dá)水平越高,患者臨床預(yù)后越差,這些結(jié)果表明STT3A 和STT3B 的異常表達(dá)與EOC患者的預(yù)后不良有關(guān),可能是EOC患者評(píng)估預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

        【Author contributions】SUN Chongfeng performed the experiments and wrote the article.HOU Jieshuai,ZHAO Zouyu and YU Panpan provided follow-up information.YANG Ping oversaw the study.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

        猜你喜歡
        卵巢癌上皮卵巢
        保養(yǎng)卵巢吃這些
        卵巢多囊表現(xiàn)不一定是疾病
        卵巢癌:被遺忘的女性“沉默殺手”
        如果卵巢、子宮可以說(shuō)話,會(huì)說(shuō)什么
        Wnt3 a和TCF4在人卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義
        CXXC指蛋白5在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義
        手部上皮樣肉瘤1例
        microRNA與卵巢癌轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展
        JMJD2B在人卵巢癌中的定位表達(dá)
        FHIT和PCNA在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及相關(guān)性
        亚洲精品国产第一综合色吧| 久久久www成人免费无遮挡大片| 玩弄极品少妇被弄到高潮| 美女脱了内裤洗澡视频| 久久96国产精品久久久| 最新亚洲精品国偷自产在线| 午夜免费福利一区二区无码AV| 亚洲激情视频在线观看a五月| 亚洲综合另类小说色区| 精产国品一二三产品蜜桃| 亚洲午夜无码久久yy6080| 国产无套粉嫩白浆内精| 日韩午夜理论免费tv影院| 中文字字幕在线精品乱码 | 免费国产一级特黄aa大片在线| 日本人妻三级在线观看| 蜜桃视频插满18在线观看| 人妻献身系列第54部| 在线观看av国产自拍| 国产伦理一区二区久久精品| 狠狠躁18三区二区一区| 亚洲中文字幕无码久久2020| 青草青草久热精品视频国产4| 国产一级黄色片在线播放| 麻豆婷婷狠狠色18禁久久| 亚洲AV日韩AV永久无码电影| 国产一区二区三区免费主播| 东北女人一级内射黄片| 精品国产乱码久久久久久1区2区 | 黑人巨大无码中文字幕无码| 少妇无码av无码去区钱| 国产视频免费一区二区| 狠狠色丁香婷婷久久综合| 一本色道av久久精品+网站| 手机在线中文字幕国产| 国产精品一区二区av不卡| 久久国内精品自在自线图片| 中文AV怡红院| 在线国产丝袜自拍观看| 青青青爽在线视频观看| 欧美精品中文字幕亚洲专区|