亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        過氧化物酶體增殖物激活受體-γ對(duì)P.acnes誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞焦亡、增殖及凋亡的影響

        2023-10-08 10:10:52易莎胡楠李粵楊林張玉婷熊霞鐘桂書陳燕
        實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2023年16期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)研究

        易莎 胡楠 李粵 楊林 張玉婷 熊霞 鐘桂書 陳燕

        西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科(四川瀘州 646000)

        尋常痤瘡(acne vulgaris,AV)是常見的慢性炎癥性皮膚疾病。在我國(guó),此病的發(fā)病率約為39.2%,多發(fā)生于青少年[1]。皮損主要表形為顏面及胸、背部泛發(fā)丘疹膿皰、囊腫結(jié)節(jié),部分嚴(yán)重者因其損害大、難治愈、易反復(fù)、常遺留瘢痕,可引起患者出現(xiàn)多種心理障礙,給患者帶來沉重的心理負(fù)擔(dān)和精神壓力[2]。痤瘡的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了,主要認(rèn)為與皮脂腺導(dǎo)管的過度角質(zhì)化(皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes,P.acnes)和炎癥、皮脂腺細(xì)胞的皮脂分泌失調(diào)(皮脂過度分泌或脂質(zhì)成分改變)等四大因素有關(guān)[3-6]。目前多種方法用于痤瘡治療,例如局部治療、口服抗菌藥物及維 A 酸類藥物、激光治療和飲食干預(yù)等,但其病情極易反復(fù),長(zhǎng)期使用這些方法可能會(huì)導(dǎo)致治療抵抗甚至產(chǎn)生其自身無法克服的副作用[7]。因此,進(jìn)一步研究痤瘡的發(fā)病機(jī)制對(duì)于臨床改善痤瘡治療效果的至關(guān)重要。

        細(xì)胞焦亡是機(jī)體重要的免疫反應(yīng)及一種新型的程序性調(diào)控的細(xì)胞死亡方式,具有促炎效應(yīng),并伴隨細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞崩解。過度的細(xì)胞焦亡在導(dǎo)致細(xì)胞死亡的同時(shí),釋放炎癥因子,擴(kuò)大炎癥反應(yīng),參與多種疾病的發(fā)生[8]。LI 等[9]發(fā)現(xiàn),抑制NLRP3 介導(dǎo)的焦亡作用,可以改善抑郁癥。ZHAO 等[10]證實(shí)高血糖相關(guān)的巨噬細(xì)胞焦亡加速了牙周炎癥的發(fā)展。研究表明,痤瘡丙酸桿菌影響的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞,通過產(chǎn)生炎癥反應(yīng),參與痤瘡的進(jìn)程。然而,細(xì)胞焦亡是否參與了AV 的發(fā)生發(fā)展,及其發(fā)揮的作用機(jī)制尚未明確。

        過氧化物酶體增殖物激活受體(eroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)主要由:PPARα、PPAR-β/δ以及PPAR-γ構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn),PPAR-γ及其靶基因在角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá),發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞免受病原菌誘導(dǎo)的炎癥損傷的作用[11]。也有研究報(bào)道,PPAR-γ 可通過ROS/TXNIP/NLRP3 通路發(fā)揮對(duì)肝細(xì)胞的抗細(xì)胞焦亡保護(hù)作用[12]。目前認(rèn)為,抗細(xì)胞焦亡作用尤為關(guān)鍵[13]。而PPAR-γ 在痤瘡中是否通過影響P.acnes誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,從而影響?zhàn)畀徝覍?dǎo)管結(jié)構(gòu)中重要組成部分-角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)尚未闡明。

        本研究中擬檢測(cè)PPAR-γ在痤瘡組織中的表達(dá),并使用正常人永生化表皮角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT作為研究對(duì)象,探索PPAR-γ是否可以調(diào)節(jié)P.acnes誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,細(xì)胞增殖和凋亡從而減輕炎癥反應(yīng)。

        1 材料與方法

        1.1 組織樣本本研究工作經(jīng)過了西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn);所有參與者都提供了書面的知情同意書。在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科門診病理檢查中,采集4 例痤瘡背部皮損標(biāo)本,4 例正常背部皮膚組織作為對(duì)照。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng)正常人永生化表皮角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT(中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞生物所)。培養(yǎng)基含有10%胎牛血清(四季青,Invitrogen 公司),高糖培養(yǎng)基(DMEM,Gibico)和1%青霉素鏈霉素(Invitrogen)。培養(yǎng)于5% CO2,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

        1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染使用重組慢病毒(吉瑪,中國(guó)上海),包含PPAR-γ質(zhì)粒(LV-PPARγ)和陰性對(duì)照,轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞系過表達(dá)PPAR-γ。使用靶向PPAR-γ基因(5'-CTGCGGAGCCCTTTGGTGACTTTATGGACAATCTGCCTGAGGTCTGTCATCTTCT-3')[14]。轉(zhuǎn)染前,細(xì)胞(2×105個(gè)細(xì)胞/孔)在12 孔板中培養(yǎng)。在達(dá)到50%匯合后,用慢病毒以50的感染復(fù)數(shù)(MOI)轉(zhuǎn)染HaCaT 細(xì)胞。在含有1 μg/mL 嘌呤霉素(Invivogen)的培養(yǎng)基中選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過Western blot 分析確定基因的過表達(dá)效率。

        1.4 分組和處理使用或不使用1×107CFU/mLP.acnes分別處理HaCaT 細(xì)胞12、24、48、72 h 后,檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中的IL-1β和IL-18水平。分別使用(P.acnes+LV-PPARγ 組)和(P.acnes+LV-PPARγ-NC組)轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞48 h,再使用1×107CFU/mLP.acnes處理24 h 后,進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

        1.5 ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-18使用ELISA試劑盒(R&D Systems 公司)對(duì)HaCaT 細(xì)胞上清液炎性因子IL-1β和IL-18 水平進(jìn)行檢測(cè),將細(xì)胞上清液稀釋到100 μL(1∶20),步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作,使用酶標(biāo)儀(Bio-Rad,Hercules)在450 nm 處讀取吸光度值。

        1.6 EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)使用EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(索萊寶,中國(guó)上海)來檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,步驟均嚴(yán)格按說明書操作。染色完成后,立即在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)并拍照。

        1.7 Western blot檢測(cè)使用適量含PMSF的RIPA裂解液(PMSF+RIPA 按1∶100 混合)裂解細(xì)胞并取出各組細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白,BCA 蛋白試劑盒(碧云天,中國(guó)江蘇)定量檢測(cè)蛋白質(zhì)。等量蛋白用經(jīng)8%、10%和12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺膠電泳分離,然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚到偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,MA,USA)上。與一抗NLRP3(1∶1 000),Caspase-1(1∶1 000),PPAR-γ(1∶1 000),GSDMD(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)等,4 ℃過夜;洗滌后二抗室溫孵育2 h,使用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶,并使用Fusion 軟件分析結(jié)果。

        1.8 免疫組織化學(xué)(IHC)痤瘡組織樣本用福爾馬林固定,石蠟包埋,切片成4 μm。切片與PPAR-γ一抗(1∶250)和二抗一起溫育。在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

        1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每種實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。所有計(jì)量數(shù)據(jù)使用表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。采用GraphPad Software 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 PPAR-γ 在痤瘡組織樣本中表達(dá)明顯降低采用IHC方法檢測(cè)PPAR-γ在痤瘡及正常皮膚組織中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:PPAR-γ主要在表皮基底層和棘層表達(dá);與正常皮膚組織相比,痤瘡皮膚組織中PPAR-γ 表達(dá)明顯下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)(圖1)。

        圖1 PPAR-γ 在痤瘡組織中表達(dá)下調(diào)Fig.1 PPAR-γ expression was decreased in acne

        2.2 P.acnes 可誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞焦亡效應(yīng)ELISA 和Western blot 結(jié)果顯示:IL-1β 和IL-18 水平顯著升高,且呈時(shí)間-依賴方式升高(t=4.957,4.72;P< 0.01)。與對(duì)照組相比,P.acnes明顯促進(jìn)了焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1 和GSDMD表達(dá)。這表明P.acnes可誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞焦亡,表現(xiàn)為胞內(nèi)IL-1β 和IL-18,及細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高。

        2.3 PPAR-γ 過表達(dá)細(xì)胞系檢測(cè)本研究使用慢病毒LV-PPARγ 轉(zhuǎn)染HaCaT 細(xì)胞過表達(dá)PPAR-γ,并采用Western blot 驗(yàn)證了過表達(dá)效率,見圖3。

        2.4 過表達(dá)PPAR-γ可抑制P.acnes誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)炎癥因子水平ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明,對(duì)比未處理組,P.acnes組與LV-PPARγ-NC 組細(xì)胞均產(chǎn)生高水平的IL-1β和IL-18(t=5.26,7.23;P< 0.05)。然而,與P.acnes組和P.acnes+LV-PPARγ 組對(duì)比,P.acnes+ LV-PPARγ 組PPAR-γ 表達(dá)明顯上調(diào)并且使IL-1β和IL-18水平明顯減少。提示,上調(diào)PPAR-γ可抑制P.acnes誘導(dǎo)的炎癥因子水平,保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受細(xì)胞焦亡損傷。

        圖2 體外人角質(zhì)形成細(xì)胞中P.acnes 誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡Fig.2 P.acnes induced cell pyroptosis in human keratinocytes vitro

        圖3 PPAR-γ 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection Results of PPAR-γ Protein Expression Level

        圖4 過表達(dá)PPAR-γ 抑制P.acnes 誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞焦亡相關(guān)炎癥因子水平Fig.4 The upregulation of the PPAR-γ inhibited P.acnes-induced pyroptotic-related inflammatory factors in human keratinocytes

        2.5 過表達(dá)PPAR-γ 可抑制P.acnes 誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)HaCaT轉(zhuǎn)染LV-PPARγ過表達(dá)PPAR-γ,Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),P.acnes明顯降低了PPARγ 蛋白水平,促進(jìn)了Caspase-1;GSDMD表達(dá),見圖5。在相同條件下,P.acnes+ LV-PPARγ組與P.acnes組比較,NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的蛋白質(zhì)水平(t=6.27,6.43,7.15;P< 0.05)均明顯減低。綜上,上調(diào)人角質(zhì)形成細(xì)胞中PPAR-γ 表達(dá)可降低P.acnes誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的表達(dá)水平。

        圖5 Western blot 檢測(cè)P.acnes 誘導(dǎo)條件下過表達(dá)PPAR-γ HaCaT 后人角質(zhì)形成細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的變化Fig.5 The changes of pyroptotic-related proteins of human keratinocytes with PPAR-γ upregulation under P.acnes treatment detected by Western blot

        2.6 過表達(dá)PPAR-γ可促進(jìn)P.acnes誘導(dǎo)條件下人角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力EdU結(jié)果顯示:P.acnes組HaCaT 細(xì)胞的增殖能力明顯降低;與P.acnes組對(duì)比,P.acnes+ LV-PPARγ 組中檢測(cè)到較高的細(xì)胞增殖水平,見圖6。提示,上調(diào)PPAR-γ 可促進(jìn)P.acnes誘導(dǎo)條件下人角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。

        圖6 P.acnes 誘導(dǎo)條件下過表達(dá)PPAR-γ 后對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖能力的影響Fig.6 Effect of PPAR-γ upregulation on proliferation of HaCaT cells under P.acnes treatment

        2.7 過表達(dá)PPAR-γ 可抑制P.acnes 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡EdU 結(jié)果顯示:P.acnes組HaCaT 細(xì)胞凋亡明顯增加;與P.acnes組對(duì)比,P.acnes+ LV-PPARγ組中檢測(cè)到較少的細(xì)胞發(fā)生凋亡,見圖7。提示,上調(diào)PPAR-γ 可抑制P.acnes誘導(dǎo)下人角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡。

        圖7 P.acnes 誘導(dǎo)下過表達(dá)PPAR-γ 后對(duì)HaCaT 細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effect of PPAR-γ upregulation on the apoptosis of HaCaT cells under P.acnes treatment

        3 討論

        痤瘡作為一種常見的累及毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性疾病。炎癥在AV的發(fā)病進(jìn)程中起重要作用,其中,皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(skin keratinocytes)可通過產(chǎn)生異常炎癥反應(yīng),參與AV 的進(jìn)展[15]。為探究P.acnes在人角質(zhì)形成細(xì)胞中引起的細(xì)胞焦亡效應(yīng),本研究使用1×107CFU/mLP.acnes誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在HaCaT 細(xì)胞中,經(jīng)P.acnes處理后可顯著刺激IL-1β 和IL-18 生成;且IL-1β 和IL-18 生成呈時(shí)間依賴性模式,同時(shí)促進(jìn)了NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 的表達(dá)。這表明P.acnes可以誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。有研究發(fā)現(xiàn),P.acnes通過誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)炎細(xì)胞中NLRP3/Caspase-1 通路產(chǎn)生過量的炎癥因子,在對(duì)抗細(xì)胞焦亡方面的能力下降[16]。TANG 等[17]發(fā)現(xiàn),P.acnes可通過刺激NLRP3/Caspase-1 細(xì)胞焦亡信號(hào)通路,可誘導(dǎo)髓核細(xì)胞表達(dá)NLRP3、IL-1β、caspase-1 和GSDMD 增加,并呈時(shí)間和劑量依賴的方式,對(duì)IL-1β 和IL-18 的過度表達(dá)有明顯的上調(diào)作用。這均證明:P.acnes能誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。在機(jī)制方面,既往研究報(bào)道:細(xì)胞焦亡過程依賴于Caspase-1,在外界條件的刺激下,Caspase-1 和 NLRP3 可以成為一種聚合物復(fù)合物,即炎性小體,也稱為 Caspase-1 依賴性炎性體。當(dāng)Caspase-1被激活時(shí),一方面可通過切割GSDMD,進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔、破裂,釋放炎癥因子,引起炎癥反應(yīng);另一方面,IL-1β 和IL-18 的前體被切割,形成具有活性的IL-1β 和IL-18 分泌到胞外,募集更多的炎癥細(xì)胞,從而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[18]。同時(shí),在NLRP3 的靶基因中,Caspase-1 是一個(gè)主要效應(yīng)蛋白酶,能夠介導(dǎo)細(xì)胞膜離子梯度發(fā)生改變,導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂,釋放炎性因子IL-1β 和IL-18,誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[19]。上述研究表明,通過細(xì)胞焦亡進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng),可加重細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞破壞。因此,P.acnes在人角質(zhì)形成細(xì)胞中可通過誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡效應(yīng),參與痤瘡角質(zhì)形成細(xì)胞破壞的過程。

        既往有研究報(bào)道[20],過表達(dá)PPAR-γ,可阻斷Wnt/β-catenin 通路,改善大鼠的NP 和神經(jīng)炎癥。為了進(jìn)一步探索PPAR-γ 是否參與痤瘡疾病發(fā)展及發(fā)揮的作用,本研究發(fā)現(xiàn):PPAR-γ 在AV 中表達(dá)下調(diào),且過表達(dá)PPAR-γ 可以降低與細(xì)胞焦亡相關(guān)的炎癥因子IL-1β 和IL-18 表達(dá)水平,NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的表達(dá)也減少。既往有研究報(bào)道[21],肝細(xì)胞可通過激活PPAR-γ,減少乳酸脫氫酶(LDH)、IL-1β和IL-18的釋放,抑制Caspase-1、GSDMD 的激活和NLRP3 的NOD 樣受體的表達(dá),來發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用。因此,PPAR-γ 在痤瘡中,也可能是通過減少焦亡相關(guān)炎癥因子IL-1β 和IL-18的釋放,抑制焦亡相關(guān)基因Caspase-1、GSDMD和NLRP3,來降低痤瘡的炎癥反應(yīng)。在抗細(xì)胞焦亡的機(jī)制研究中,以往研究[12]也報(bào)道PPAR-γ 可通過ROS/TXNIP/NLRP3 通路發(fā)揮對(duì)肝細(xì)胞的抗細(xì)胞焦亡保護(hù)作用。文獻(xiàn)報(bào)道,發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)元中miR-223[22]及糖尿病腎病lncRNA H19[23]過表達(dá)均可能通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路來減輕相應(yīng)細(xì)胞的焦亡,從而減輕細(xì)胞炎癥損傷。進(jìn)一步說明,PPAR-γ 通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路可減輕細(xì)胞焦亡。

        在本研究中還發(fā)現(xiàn),P.acnes誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞過表達(dá)PPAR-γ,人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力增加,細(xì)胞凋亡受到抑制。相關(guān)研究已證明[24],通過激活PPAR-γ/RXR-α/Wnt 信號(hào)可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和入侵。在心肌及軟骨中激活PPAR-γ可抑制細(xì)胞的炎癥,保護(hù)細(xì)胞免受凋亡[25-26]。因此,在P.acnes誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞中過表達(dá)PPAR-γ,可促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,減少細(xì)胞凋亡。

        綜上所述,本研究證明P.acnes可誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞焦亡,過表達(dá)PPAR-γ 逆轉(zhuǎn)P.acnes誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞焦亡和凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,可能與PPAR-γ 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)基因,如NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 等的表達(dá)發(fā)生改變相關(guān)。這有助于對(duì)痤瘡炎癥發(fā)生及調(diào)節(jié)機(jī)制的理解,且使用任何方法激活PPAR-γ 通路或細(xì)胞焦亡相關(guān)基因可能是減輕痤瘡患者角質(zhì)形成細(xì)胞炎癥損傷的有效策略。PPAR-γ 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在痤瘡的發(fā)病機(jī)制中的研究是本文創(chuàng)新之處。由于本研究目前僅在體外利用HaCaT 細(xì)胞系進(jìn)行研究,有必要進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)的研究,以確定本研究的發(fā)現(xiàn)與正常角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行比較。

        【Author contributions】CHEN Yan performed the experiments and wrote the article.YI Sha,ZHANG Yuting,HU Nan,LI Yue and YANG Lin performed the experiments.YI Sha revised the article.CHEN Yan and ZHONG Guishu designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

        猜你喜歡
        檢測(cè)研究
        FMS與YBT相關(guān)性的實(shí)證研究
        “不等式”檢測(cè)題
        “一元一次不等式”檢測(cè)題
        “一元一次不等式組”檢測(cè)題
        2020年國(guó)內(nèi)翻譯研究述評(píng)
        遼代千人邑研究述論
        “幾何圖形”檢測(cè)題
        “角”檢測(cè)題
        視錯(cuò)覺在平面設(shè)計(jì)中的應(yīng)用與研究
        科技傳播(2019年22期)2020-01-14 03:06:54
        EMA伺服控制系統(tǒng)研究
        天天鲁一鲁摸一摸爽一爽| 亚洲精品久久蜜桃av| 成年女人免费v片| 人妻中文无码久热丝袜| 精品一级毛片| 亚洲国产精品夜男人天堂| 免费看黄片的视频在线观看| 免费看又色又爽又黄的国产软件| 亚洲国产人在线播放首页| 韩国女主播一区二区在线观看| 日本一区二区三区在线观看视频| 偷拍一区二区视频播放器| 午夜福利院电影| 91精品国产91久久久无码95| 国产一区二区av男人| 亚洲伦理第一页中文字幕| 国产激情久久久久影院老熟女| 久久成年片色大黄全免费网站| 自拍视频在线观看成人| 中文字幕一区二区三区久久网| 51国偷自产一区二区三区| 国产精品青草视频免费播放| 精品在线亚洲一区二区三区| 影音先锋久久久久av综合网成人| 亚洲欧美激情在线一区| 青青国产成人久久91| 在线观看国产激情免费视频| av无码国产精品色午夜| 少妇人妻真实偷人精品视频| 国产精品久久这里只有精品| av在线播放亚洲天堂| 99精品国产一区二区三区不卡| 屁屁影院一区二区三区| 免费啪啪av人妻一区二区| 在线人成视频播放午夜| 激情偷乱人成视频在线观看| 91超碰在线观看免费 | 日本老熟妇五十路一区二区三区| 欧美激情在线播放| 久久精品日韩av无码| 一区二区三区岛国av毛片|