馬志剛，馮夢(mèng)霞，湯永濤，劉如垚，閆雪朦，胡博，聶國(guó)興，周傳江，

（1. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)動(dòng)物疾病控制河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453007；2. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007）

鋸齒新米蝦Neocaridina denticulata是一種體型偏小的淡水蝦類，對(duì)水域環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，但分布范圍較狹窄，據(jù)記載，其在國(guó)內(nèi)僅分布于太湖區(qū)、福建等特定區(qū)域，后被移養(yǎng)至新疆、巴楚等地的部分區(qū)域（梁象秋，2004），在新米蝦屬Neocaridina的修訂中首次系統(tǒng)、詳細(xì)地描述了新米蝦屬的分類地位及其形態(tài)特征，為相關(guān)研究提供了理論依據(jù)。隨著更多物種的發(fā)現(xiàn)和分類學(xué)研究的深入（蔡奕雄，1996；梁象秋等，1999；梁象秋，2004），鋸齒新米蝦、大衛(wèi)米蝦Caridina davidi和異足新米蝦N. heteropoda的分類命名存在一定沖突和爭(zhēng)議，Klotz 等（2013）的研究認(rèn)為，大衛(wèi)米蝦、鋸齒新米蝦大衛(wèi)亞種N. denticula davidi、鋸齒新米蝦中華亞種N. denticula sinensis是異足新米蝦的同物異名，其有效物種名為N. davidii。

鋸齒新米蝦作為一種形態(tài)體色多變的常見(jiàn)小型淡水蝦，常被用作觀賞蝦類進(jìn)行交易和養(yǎng)殖。為了培育更多體色增加其觀賞價(jià)值，米蝦屬Caridina和新米蝦屬中許多種被人工雜交和選育（林師，2017）。此外，鋸齒新米蝦的環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，有學(xué)者對(duì)其低溶解氧脅迫的耐受能力、水體污染的生態(tài)響應(yīng)進(jìn)行研究報(bào)道（李典寶，2015；薛毓才等，2022），為后續(xù)鋸齒新米蝦環(huán)境適應(yīng)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

河南省地處中原腹地，地跨長(zhǎng)江、淮河、黃河、海河4 大流域，境內(nèi)有1 500 多條主干河流縱橫交錯(cuò)，水系資源豐富，地形復(fù)雜。對(duì)河南省境內(nèi)的蝦類資源調(diào)查結(jié)果顯示，相較于其他淡水蝦類而言，鋸齒新米蝦在河南境內(nèi)4大水系均有分布，且數(shù)量較大，但缺乏遺傳多樣性的研究報(bào)道。目前，DNA分子標(biāo)記是進(jìn)行群體遺傳多樣性研究的主要手段之一，線粒體COⅠ基因已被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類、蝦類種群遺傳多樣性的研究（馮建彬等，2008；公月月，2017）。本研究基于線粒體COⅠ基因?qū)幽暇硟?nèi)19 個(gè)野生鋸齒新米蝦群體的149 尾樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，評(píng)估河南境內(nèi)鋸齒新米蝦種質(zhì)資源現(xiàn)狀，為其種質(zhì)資源保護(hù)、可持續(xù)發(fā)展等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2012—2020 年于河南省4 大水系的干流及其部分支流中采集鋸齒新米蝦，標(biāo)本浸泡于95%乙醇中帶回實(shí)驗(yàn)室保存。選取其中19 個(gè)地理群體149尾樣本作為研究對(duì)象（表1）。

1.2 COⅠ基因的獲取

取適量樣本肌肉組織（約0.01 g），采取酚-氯仿法提取DNA（Sambrooket al.，1989）。用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 微量紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量與濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

擴(kuò)增線粒體COⅠ基因引物為L(zhǎng)CO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，HCO21 98：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’（Folmeret al.，1994），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為30 μL：2×Es Taq Master Mix 15 μL，正、反向引物各1.5 μL，DNA模板1 μL，無(wú)菌雙蒸水11 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存（馮建彬等，2008）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序獲得的DNA序列采用Lasergene 7.1的SeqMan（Swindell & Plasterer，1997）進(jìn)行人工核查、校正及組裝拼接。拼接完成的序列用BioEdit（Tippmann，2004）進(jìn)行多重比對(duì)，獲得一致序列備用。用DnaSP 5.0（Librado & Rozas，2009）計(jì)算DNA 序列的單倍型數(shù)、單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（π）等遺傳多樣性參數(shù)。用MEGA 7.0（Sudhiret al.，2016）計(jì)算序列堿基組成、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和組內(nèi)、組間遺傳距離等參數(shù)。

用Arlequin 3.5（Excoffieret al.，2005）進(jìn) 行AMOVA 估算遺傳變異在不同水系間的分布和遺傳分化系數(shù)（FST），進(jìn)而評(píng)估不同水系鋸齒新米蝦群體的遺傳分化程度；為探究其種群歷史動(dòng)態(tài)，進(jìn)行Fu’sFs和Tajima’s D 中性檢驗(yàn)及錯(cuò)配分布分析，評(píng)估群體是否發(fā)生種群擴(kuò)張。根據(jù)長(zhǎng)臂蝦科Palaemonidae 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以細(xì)足米蝦C. nilotica gracilipes（GenBank 登錄號(hào)：MK190025）為外群（李新正等，2003），Bootstrap 設(shè)置為1 000檢驗(yàn)置信度，構(gòu)建鋸齒新米蝦19 個(gè)群體的ML 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以分析各群體之間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及地理分化情況。采用Network 5.0（Bandeltet al.，2000）中的Median-Joining 法構(gòu)建鋸齒新米蝦的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，以分析其單倍型演化關(guān)系。用BEAST 1.7.4（Heled & Drummond，2010）進(jìn)行貝葉斯天際線點(diǎn)（Bayesian skyline plot，BSP）分析估算鋸齒新米蝦種群歷史動(dòng)態(tài)的變化，采用1.4%COⅠ基因進(jìn)化速率（Knowlton & Weigt，1998），由Tracer 1.5（Rambaut & Drummond，2009）生成BSP圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅠ基因序列基本特征

19個(gè)地理群體149條鋸齒新米蝦的COⅠ基因序列長(zhǎng)632 bp，其中包括變異位點(diǎn)43 個(gè)（6.8%），簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)32 個(gè)，單變異位點(diǎn)11 個(gè)，轉(zhuǎn)顛換位點(diǎn)數(shù)的比值為2.628∶1；T、C、A 和G 的平均含量分別為33.4%、20.7%、27.2%和18.7%，表現(xiàn)出顯著的AT偏倚性。

2.2 種群遺傳多樣性

鋸齒新米蝦樣品共包含35 個(gè)單倍型，其中，24 個(gè)為獨(dú)享單倍型，11 個(gè)為群體間共享，Hap6被長(zhǎng)江、黃河、淮河10 個(gè)群體33 尾個(gè)體共享。各 水系 的Hd為0.773～0.924，平 均0.922，其中，淮河水系的最低（Hd=0.773），長(zhǎng)江水系的最高（Hd=0.924）；各水系的π 為0.002 28～0.006 37，平均為0.006 32，其中，淮河水系的最低（π=0.002 28），長(zhǎng)江水系的最高（π=0.006 37）。整體上，長(zhǎng)江水系群體顯示出更高的遺傳多樣性（Hd=0.924，π=0.006 37），遠(yuǎn)高于其他3 個(gè)水系（表2）。

表2 河南省4大水系鋸齒新米蝦群體的遺傳多樣性信息Table 2 Genetic diversity of Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

4 大水系群體內(nèi)遺傳距離為0.002 29～0.006 45，其中，淮河水系的最?。?.002 29），長(zhǎng)江水系的最大（0.006 45）；兩兩水系間的遺傳距離為0.004 71～0.008 87，其中，長(zhǎng)江水系與淮河水系的最?。?.004 71），海河水系與長(zhǎng)江水系的最大（0.008 87）。4 大水系間的FST為0.104 68～0.586 00，4 大水系之間均存在顯著的遺傳差異：黃河水系和長(zhǎng)江水系的最高（0.586 00），且存在極顯著遺傳差異；黃河水系與海河水系的最低（0.104 68），且存在顯著差異（表3）。

表3 河南省4大水系鋸齒新米蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)Table 3 Genetic structure of Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

海河水系中，E02 與C02、E05，E04 與C02 的遺傳分化較低（FST＜0.25），其余群體與所有群體的遺傳分化程度均較高（FST＞0.25），且分化程度均達(dá)到顯著或極顯著水平；海河水系的5個(gè)群體之間也存在一定遺傳差異，除E02與E04、E05之間的遺傳分化程度沒(méi)有達(dá)到顯著差異水平外，其他幾個(gè)群體之間的遺傳分化程度均達(dá)到了顯著或極顯著水平。FST分析與成對(duì)遺傳距離分析結(jié)果一致，均表明C02、E01、E02 和E04 群體與其他各鋸齒新米蝦群體間存在較大遺傳分化（表4）。

表4 河南省4大水系鋸齒新米蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)Table 4 Genetic structure of Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

AMOVA 結(jié)果顯示，鋸齒新米蝦的遺傳變異主要源自其群體內(nèi)的個(gè)體間，且群體內(nèi)鋸齒新米蝦個(gè)體間的變異占總變異的38.10%，群體間的變異則占35.71%（表5）。

表5 河南省4大水系鋸齒新米蝦群體AMOVA分析Table 5 Analysis of molecular variance among Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

鋸齒新米蝦19個(gè)群體的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1：a）顯示，各水系不同群體間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系成交叉式嵌套，無(wú)明顯水系和地理分化。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，鋸齒新米蝦群體各水系35 個(gè)單倍型之間總體上并未呈現(xiàn)出明顯的水系交叉，除Hap1、Hap4、Hap6存在不同水系鋸齒新米蝦樣品之間單倍型共享的情況外，其他各個(gè)鋸齒新米蝦群體形成了比較明顯的地理結(jié)構(gòu)，不同水系的群體間多為特有單倍型；此外，35 個(gè)單倍型中，除Hap1、Hap27 和Hap29 拓展出少量的單倍型外，Hap6 的拓展單倍型最多（圖1：b）。

圖1 基于COⅠ基因構(gòu)建的河南境內(nèi)4大水系鋸齒新米蝦的ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（a）及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（b）Fig. 1 ML phylogenetic tree （a） and network of haplotypes （b） of Neocaridina denticulata from four river systems in Henan Province based on COⅠ gene sequences

2.4 種群歷史動(dòng)態(tài)

河南省鋸齒新米蝦群體的Tajima’sD檢驗(yàn)值和Fu’sFS檢驗(yàn)值均為負(fù)數(shù)（Tajima’sD=-1.692 13，F(xiàn)u’sFS=-1.167 07），均未達(dá)到顯著差異水平（表2）；錯(cuò)配分布分析表明，群體的錯(cuò)配分布曲線呈現(xiàn)出多峰狀態(tài)（圖2），推測(cè)河南省鋸齒新米蝦種群相對(duì)穩(wěn)定，近期未發(fā)生過(guò)種群擴(kuò)張事件。BSP分析結(jié)果顯示，鋸齒新米蝦群體整體保持穩(wěn)定趨勢(shì)，并未經(jīng)歷種群擴(kuò)張或瓶頸效應(yīng)（圖3）。

圖2 河南境內(nèi)4大水系鋸齒新米蝦群體錯(cuò)配分布分析Fig. 2 Mismatch distribution analysis of Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

圖3 河南境內(nèi)4大水系鋸齒新米蝦群體總貝葉斯天際線點(diǎn)圖Fig. 3 Bayesian skyline plots of Neocaridina denticulata populations from four river systems in Henan Province

3 討論

3.1 河南境內(nèi)鋸齒新米蝦的遺傳多樣性

采集的河南境內(nèi)149 尾鋸齒新米蝦群體平均遺傳多樣性指數(shù)（Hd=0.922，π=0.006 32）均低于河南境內(nèi)日本沼蝦M. nipponense群體（Hd=0.785 74，π=0.010 59），但是略高于掌肢新米蝦N. palmata palmata群體（Hd=0.557±0.025，π=0.000 98±0.000 07）（鄭小壯等，2019）?？傮w而言，河南境內(nèi)鋸齒新米蝦與河南境內(nèi)日本沼蝦群體、掌肢新米蝦（鄭小壯等，2019）、4 個(gè)海域口蝦蛄Oratosqilla oratoria群體（董鑫等，2015）及紫貽貝Mytilus galloprovincialis群體（沈玉幫等，2011）均表現(xiàn)出單倍型多樣性較高、核苷酸多樣性較低的特點(diǎn)。

遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)江水系鋸齒新米蝦群體顯示出更高的遺傳多樣性（Hd=0.924，π=0.006 37），均遠(yuǎn)高于其他3 個(gè)水系，表明長(zhǎng)江水系鋸齒新米蝦群體目前具有較高的遺傳多樣性，這與河南境內(nèi)日本沼蝦群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀（鄭小壯等，2019）相一致。而淮河水系和黃河水系因采樣點(diǎn)多為半封閉水體，群體間可能存在基因交流，導(dǎo)致結(jié)果偏低。

3.2 河南境內(nèi)鋸齒新米蝦的遺傳結(jié)構(gòu)

淮河水系的遺傳距離最小，長(zhǎng)江水系與其他水系之間的遺傳距離均較大。其次是黃河水系和海河水系，海河遺傳距離也相對(duì)較大。FST值差異顯著性檢驗(yàn)顯示，海河水系與其他各水系的群體均存在顯著或極顯著的遺傳差異（P＜0.05，P＜0.01），達(dá)到高度遺傳分化（FST＞0.25），就海河水系內(nèi)部來(lái)看，其5個(gè)群體之間也存在一定遺傳學(xué)差異。或因海河水系涉及3 個(gè)采樣點(diǎn)（E02、E04、E05）為水庫(kù)，其他2個(gè)采樣點(diǎn)則位于林州市太行山脈中，與其他幾個(gè)地理群體存在一定地理隔離和基因交流障礙，從而導(dǎo)致了該水系鋸齒新米蝦群體與其他群體產(chǎn)生了差異。

單倍型Hap6 在10 個(gè)種群中共享，且以其為中心直接拓展出10個(gè)單倍型，呈明顯的星形輻射狀，占據(jù)除海河以外的其他3個(gè)水系，為分布最廣泛的單倍型，推斷Hap6 是一個(gè)存在時(shí)間較為久遠(yuǎn)的主要單倍型。

3.3 河南境內(nèi)鋸齒新米蝦的種群歷史動(dòng)態(tài)

中性檢測(cè)結(jié)果顯示，河南境內(nèi)鋸齒新米蝦群體的平均Fu’Fs值和Tajima’sD值均為負(fù)值但未達(dá)顯著差異水平；錯(cuò)配分布分析顯示其群體錯(cuò)配分布圖為多峰泊松分布；BSP分析結(jié)果顯示鋸齒新米蝦群體整體上保持穩(wěn)定趨勢(shì)。推測(cè)河南境內(nèi)鋸齒新米蝦種群整體比較穩(wěn)定，未經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張及瓶頸效應(yīng)。

鋸齒新米蝦作為一類古老的小型淡水蝦類，在我國(guó)除了分布于幾個(gè)已知的區(qū)域（梁象秋，2004）外，在貴州（鄧一德，吳本壽，1997）、江西（李文浩等，2016）、湖北三峽（楊振冰等，2018）等多個(gè)地方記錄有分布。鋸齒新米蝦不同地理群體間的遺傳距離雖然較小，但多存在單獨(dú)的遺傳結(jié)構(gòu)和一定的地理格局，推測(cè)其原因可能有以下幾點(diǎn)：首先，采集樣點(diǎn)的設(shè)置和采樣方法的不同均會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，如水庫(kù)等靜水與溪流等流水的群體可能存在因?yàn)樯姝h(huán)境的不同和基因交流的阻礙而產(chǎn)生遺傳分化現(xiàn)象；其次，由于鋸齒新米蝦個(gè)體較小，且大多生活在靜水或水體流動(dòng)性較小的水體，遷移能力相對(duì)較弱，因此，不同水系鋸齒新米蝦群體之間可能因?yàn)榈乩?、水系上的隔離而存在一定的交流障礙，從而造成群體之間的分化；最后，氣候和環(huán)境等不同也會(huì)引起其局部適應(yīng)性的改變，捕撈、放流等人為因素造成鋸齒新米蝦不同地理群體及其棲息環(huán)境之間存在一定的差異。為了適應(yīng)不同的水域環(huán)境，不同群體之間可能會(huì)發(fā)生一定程度的進(jìn)化或變異（易嘯等，2018；鄭小壯等，2019）。

本研究對(duì)河南省境內(nèi)鋸齒新米蝦遺傳多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，對(duì)進(jìn)一步評(píng)價(jià)河南省淡水蝦類物種多樣性和淡水蝦類廣布種的遺傳多樣性現(xiàn)狀，豐富河南省境內(nèi)關(guān)于淡水蝦類的相關(guān)研究，完善境內(nèi)淡水蝦類的物種名錄和后續(xù)相關(guān)研究提供了理論依據(jù)和參考。