胡謙，李欣奕，袁野，韓旭，齊曉松，李嘉琦，郭艷莉，馬曉虎，劉偉

陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，陜西省生命分析化學(xué)重點(diǎn)實驗室，西安 710119

1 引言

近年來，中級分析化學(xué)實驗已經(jīng)在國內(nèi)的一些院校開設(shè)[1]，我校也給本科生開設(shè)了中級分析化學(xué)實驗的選修課。由于中級分析化學(xué)實驗在大學(xué)三年級開設(shè)，學(xué)生已經(jīng)學(xué)習(xí)了化學(xué)的四大基本學(xué)科，也具備了基本的實驗操作技巧，因此中級分析化學(xué)實驗的開展可以促進(jìn)本科生化學(xué)綜合知識的應(yīng)用，同時也能夠培養(yǎng)學(xué)生交叉融合的實驗?zāi)芰?。因此，本著這樣的理念，我們設(shè)計了一些與生活實踐相關(guān)的中級分析化學(xué)實驗，使同學(xué)們在融會貫通各門知識的基礎(chǔ)上，能夠真正具備解決問題的能力，從而培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力[2]。

本實驗利用化學(xué)發(fā)光檢測，設(shè)計了一種可以測定微量過氧化氫(H2O2)的紙分析芯片。H2O2是一種強(qiáng)氧化劑，其水溶液就是俗稱的雙氧水[3]。在日常生活中，H2O2的使用十分廣泛，其水溶液適用于醫(yī)用傷口消毒及環(huán)境和食品消毒。但H2O2同時具有一定的環(huán)境和健康危害，過量的H2O2會傷害人體的中樞神經(jīng)。同時在生物代謝過程中，H2O2也是一種重要的信號物質(zhì)[4]，體內(nèi)過多的H2O2會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，因此測定微量的H2O2具有一定的研究意義。目前見到的微量H2O2的光學(xué)分析方法中，比色[5]、熒光[6]及化學(xué)發(fā)光[7]的方法均得到比較普遍的應(yīng)用。而在光學(xué)分析方法中，化學(xué)發(fā)光方法[7]因其無需光源、靈敏度高和線性范圍寬的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于H2O2的檢測中。魯米諾-H2O2[8]體系是一個最基本的化學(xué)發(fā)光體系，在該體系中，H2O2是其基本的測定物質(zhì)，所有能與H2O2發(fā)生直接或間接反應(yīng)的物質(zhì)均可用該體系進(jìn)行測定。

基于以上的研究背景，在師范類院校中開展與化學(xué)發(fā)光有關(guān)的相關(guān)實驗可以促進(jìn)師范類高校對于創(chuàng)新性人才的培養(yǎng)，同時也可以提高師范生的學(xué)科專業(yè)素養(yǎng)。因此結(jié)合本課題組在化學(xué)發(fā)光紙芯片上多年的研究，選取課題中比較前沿且研究完整的實驗，以微量H2O2的測定開展中級分析化學(xué)實驗。該實驗中，選擇具有大的比表面和化學(xué)發(fā)光催化活性的有機(jī)金屬框架(MOFs)材料[9]，作為魯米諾-H2O2體系的催化劑。利用1,3,5-均苯三甲酸(H3BTC)作為配體合成Cu-BTC，在紙芯片上結(jié)合Cu-BTC[10]對魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光[11]體系的催化作用，可實現(xiàn)微量過氧化氫的測定。在該中級分析化學(xué)實驗的進(jìn)行中，學(xué)生需要掌握有機(jī)化學(xué)的合成操作，簡易紙芯片的基本制作手段和反應(yīng)釜的使用操作，同時還要熟悉化學(xué)發(fā)光儀的使用。在實驗開展之前，需要學(xué)生們自主進(jìn)行文獻(xiàn)檢索和文獻(xiàn)閱讀，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立閱讀文獻(xiàn)的能力和探究精神。實驗中遇到問題時，可以讓學(xué)生自主分析問題的產(chǎn)生原因，使動手能力和科研思維均得到鍛煉和提高，同時也可以培養(yǎng)師范生和非師范生的多方面能力。

2 實驗?zāi)康?/h2>

(1) 掌握Cu-BTC材料的合成和紙芯片的制備方法及主要應(yīng)用；

(2) 了解化學(xué)發(fā)光儀的原理，掌握其基本的操作方法；

(3) 掌握魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光原理；

(4) 掌握H2O2濃度與發(fā)光強(qiáng)度的數(shù)學(xué)模型關(guān)系及數(shù)據(jù)處理方法。

3 實驗原理

紙芯片的概念最早由Whitesides提出，就是在一定尺寸的紙片上精細(xì)加工親、疏水通道，使分離及檢測等一系列工作[12]集成在紙上進(jìn)行的微流控平臺。目前，紙芯片已廣泛應(yīng)用于各種檢測方法中[13]。

近年來，MOFs的研究和應(yīng)用得到了迅速發(fā)展。MOFs是由無機(jī)金屬中心與橋聯(lián)的有機(jī)配體通過自組裝相互連接的具有周期性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的多孔材料，因其具有穩(wěn)定性、剛?cè)嵝?、多孔性和性能的可設(shè)計性[9]，已被廣泛應(yīng)用于催化[14]及氣體儲存與分離[15]等諸多領(lǐng)域。

Cu-BTC作為一種新型MOFs材料，具有良好的親水性能、多孔性和高孔容的骨架結(jié)構(gòu)[10]。并且已見報道，Cu-BTC具有催化魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光的作用[11]，與傳統(tǒng)的魯米諾體系的催化劑辣根過氧化物酶(HRP)相比，Cu-BTC受環(huán)境影響小，使用范圍廣。所以本實驗選擇Cu-BTC作為化學(xué)發(fā)光的催化劑，將Cu-BTC負(fù)載在紙芯片之上，結(jié)合常見的魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光體系，在紙表面上完成了微量H2O2的測定。實驗原理圖如圖1所示。

圖1 紙芯片及實驗原理示意圖

4 試劑和儀器

4.1 反應(yīng)試劑和材料

實驗中所需化學(xué)試劑和材料如表1所示。

表1 實驗中的試劑和材料

4.2 實驗儀器

本實驗使用到的小型儀器有試管、移液槍、注射器和鑷子，所需的大型儀器如表2所示。

表2 實驗用到的儀器

5 實驗步驟

5.1 紙芯片的制備

本實驗中首先需要制作實驗用的紙芯片載體。如圖1所示，采用紙切割機(jī)實現(xiàn)直徑為8 mm的圓形芯片的制作。然后將白色泡沫塑料溶解于三氯甲烷中，制備粘稠的疏水試劑[16]，裝于空的水彩筆內(nèi)芯中，畫出直徑為6 mm的圓圈，這樣便制得具有疏水和親水區(qū)域的紙芯片。

5.2 Cu-BTC的制備

對于Cu-BTC的合成手段，本實驗中采用文獻(xiàn)[17]中的水熱合成的方案，具體的制備方法如下：

(1) 配制配體混合溶液。稱取試劑DMF (15 mL)，乙醇(15 mL)，并將DMF與乙醇按體積比1 : 1混合后，稱量固體1,3,5-均苯三甲酸(H3BTC) (1.0 g，4.8 mmol)，攪拌，使固體完全溶解。

(2) 配制0.57 mol·L-1的Cu(NO3)2水溶液。稱量固體Cu(NO3)2·3H2O (2.1 g，8.6 mmol)溶于15 mL H2O中。

(3) 混合溶液并反應(yīng)?；旌?和2中所得溶液并置于反應(yīng)釜中，在100 °C下反應(yīng)10 h。

(4) 離心及洗滌樣品。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)釜內(nèi)液體與藍(lán)色固體倒入離心管，離心。取出離心管，倒掉上清液，再加入適量DMF振搖，離心。操作重復(fù)兩次。最后加入乙醇振搖，離心，再倒掉上清液。

(5) 烘干樣品。將離心管置于真空烘箱內(nèi)，在50 °C下烘干12 h，得到干燥的Cu-BTC固體。

5.3 魯米諾及過氧化氫儲備液的配制

1.0 × 10-2mol·L-1的魯米諾儲備液的配制：稱取0.18 g魯米諾，用0.10 mol·L-1的NaOH溶液溶解后轉(zhuǎn)入100 mL棕色容量瓶中，用超純水定容，避光保存一周后稀釋使用。

實驗用不同濃度的H2O2溶液由30%的H2O2溶液逐級稀釋得到。實驗前需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.4 化學(xué)發(fā)光測定

打開MPI-B型多功能化學(xué)發(fā)光檢測儀及負(fù)高壓(測量高壓600 V)，暗盒關(guān)閉的情況下預(yù)熱30 min，使基線平穩(wěn)。

將制得的Cu-BTC固體均勻分散在5.0 mL DMF試劑中，得到一定濃度的Cu-BTC催化劑溶液。向紙芯片上滴加2.5 μL新制備的2.6 mg·mL-1Cu-BTC催化劑溶液，待其干燥后置于化學(xué)發(fā)光儀暗盒中固定位置的載物臺上?；瘜W(xué)發(fā)光儀上的暗盒關(guān)閉，通過暗盒上的小孔在充分避光的情況下，連接注射泵滴加2.0 μL的2.0 × 10-3mol·L-1魯米諾溶液于紙芯片之上；然后接著滴加2.0 μL的不同濃度的H2O2于紙芯片之上，用儀器自帶的化學(xué)發(fā)光軟件記錄化學(xué)發(fā)光相對強(qiáng)度信號。

5.5 最佳魯米諾和Cu-BTC濃度的選擇

進(jìn)行H2O2測定前，選擇反應(yīng)中最佳的魯米諾和Cu-BTC的濃度。保證滴加體積和量不變，選擇Cu-BTC的濃度時，在電子天平上稱量不同量的Cu-BTC固體，分散于5.0 mL DMF中，得到濃度為0.5-3.8 mg·mL-1的溶液。2.5 μL不同濃度的Cu-BTC滴加在紙芯片之上，后滴加2.0 × 10-3mol·L-1的魯米諾溶液和1.0 × 10-6mol·L-1H2O2，記錄化學(xué)發(fā)光信號值。

進(jìn)行魯米諾最佳濃度選擇時，配制0.5 × 10-3-5.0 × 10-3mol·L-1的魯米諾溶液，固定Cu-BTC(2.6 mg·mL-1)和H2O2(1.0 × 10-6mol·L-1)濃度，按相同步驟操作，記錄化學(xué)發(fā)光信號值。

5.6 線性范圍和檢出限

在選定的實驗條件下，按照上述實驗步驟，測定不同濃度(1.0 × 10-4-1.0 × 10-8mol·L-1)的H2O2溶液濃度與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系。以H2O2溶液濃度為橫坐標(biāo)，以發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線。按照檢出限計算公式3δblank/k(δblank為空白信號標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為校準(zhǔn)曲線的斜率)計算檢出限。

6 結(jié)果與討論

6.1 Cu-BTC的表征

實驗初期，需要在反應(yīng)釜中合成Cu-BTC。合成完畢后，對照文獻(xiàn)[17]找中合成的Cu-BTC，為了確認(rèn)Cu-BTC的成功制備，通過X射線的粉末衍射分析(XRD)衍射峰位置以及場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察其形貌，得到圖2的結(jié)果。從圖2A中可以看出，XRD的衍射峰出現(xiàn)在6.6°、9.4°和11.5°，與文獻(xiàn)[17]中報道的衍射峰一致。圖2B顯示，Cu-BTC的形貌呈現(xiàn)的是八面體型，該晶體結(jié)構(gòu)也與文獻(xiàn)報道相符。

圖2 Cu-BTC的XRD (A)及SEM (B)圖

6.2 最佳魯米諾濃度

對于魯米諾-H2O2體系，為了提高H2O2檢測的準(zhǔn)確性與顯著性，魯米諾的濃度高低會影響測定結(jié)果，因此，首先考察魯米諾濃度帶來的影響。在2.6 mg·mL-1的Cu-BTC-DMF溶液和1.0 × 10-6mol·L-1的H2O2溶液濃度時，室溫條件下，記錄0.5 × 10-3-5.0 × 10-3mol·L-1的魯米諾溶液產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，當(dāng)濃度在2.0 × 10-3mol·L-1時有最佳效果，因此，選擇魯米諾溶液濃度為2.0 × 10-3mol·L-1。

圖3 魯米諾最佳濃度的選擇

6.3 最佳Cu-BTC濃度

為了在最佳條件下檢測H2O2，考慮其他因素可能造成的影響，Cu-BTC的濃度也需要優(yōu)化。選擇2.0 × 10-3mol·L-1的魯米諾溶液和1.0 × 10-6mol·L-1的H2O2溶液濃度，在室溫條件下記錄0.5-3.8 mg·mL-1的Cu-BTC溶液產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號，得到結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，當(dāng)濃度在2.6 mg·mL-1時擁有最佳效果，因此選擇Cu-BTC溶液濃度為2.6 mg·mL-1。

圖4 Cu-BTC紙上負(fù)載最佳量的選擇

6.4 過氧化氫的化學(xué)發(fā)光測定

在所選定的最佳條件下，測定不同濃度H2O2的化學(xué)發(fā)光信號值，結(jié)果表明，過氧化氫濃度在1.0 × 10-4-1.0 × 10-8mol·L-1內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性趨勢，方程為I= 621.48lgC+ 5004 (R2= 0.9865)，I表示化學(xué)發(fā)光相對強(qiáng)度；C表示H2O2的濃度(mol·L-1)，如圖5A所示。同時，測定了H2O2濃度在1.0 × 10-8-1.0 × 10-7mol·L-1內(nèi)的校準(zhǔn)曲線(圖5B)，其線性回歸方程I= 63.96C+ 44.62 (R2= 0.9970)，其中I表示化學(xué)發(fā)光相對強(qiáng)度；C表示H2O2的濃度，單位為10-8mol·L-1。根據(jù)IUPAC規(guī)定的檢出限的計算公式，得到該方法檢出限為3 × 10-9mol·L-1。因此本方法能實現(xiàn)微量H2O2含量的測定。

圖5 不同濃度H2O2與化學(xué)發(fā)光信號圖(A)及校準(zhǔn)曲線(B)

7 實驗組織及注意事項

中級分析化學(xué)實驗采用小班組授課和大循環(huán)上課模式，每組設(shè)置4-6名同學(xué)，分工協(xié)作具體的實驗操作和化學(xué)發(fā)光儀的使用和檢測工作。實驗共需要16 h，4個單元的實驗時間。前2單元的實驗主要是進(jìn)行合成，后2單元進(jìn)行相關(guān)的表征和過氧化氫的化學(xué)發(fā)光測定實驗。在實驗中采用大循環(huán)的小組合作模式，可以將MOFs的合成步驟與前一實驗的操作同時進(jìn)行，即可合并2單元的實驗時間，大大提高實驗時間的利用效率。同時，本實驗中因需要使用反應(yīng)釜，在實驗過程中需將實驗過程和步驟反復(fù)強(qiáng)化，并強(qiáng)調(diào)注意事項，提高學(xué)生的風(fēng)險意識及加強(qiáng)對實驗安全性的正確引導(dǎo)。

本中級分析化學(xué)中存在以下注意事項：

(1) 在實驗過程中要注意做好個人防護(hù)，戴好口罩和手套。

(2) 在制備固體Cu-BTC的過程中，加入反應(yīng)釜內(nèi)的反應(yīng)物不能超過釜體容積的四分之三；加熱容器如烘箱的溫度設(shè)置要按照操作規(guī)程嚴(yán)格進(jìn)行；反應(yīng)完成后務(wù)必使反應(yīng)釜的溫度降至室溫時打開釜蓋。

(3) 在配制溶液時，過氧化氫溶液與Cu-BTC溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，魯米諾溶液的儲備液(1.0 × 10-2mol·L-1)需要提前配制并避光保存一周后方可稀釋使用。

(4) 在測定光信號的過程中，化學(xué)發(fā)光儀需要提前開啟，待基線穩(wěn)定后再進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)測定。在測定光信號時，需關(guān)緊儀器蓋并在實驗中嚴(yán)格避光。

8 結(jié)語

本實驗將MOFs合成于紙芯片之上，發(fā)展了一種紙上化學(xué)發(fā)光測定H2O2的中級分析化學(xué)實驗，有望實現(xiàn)實際樣品中微量H2O2含量的測定。由于中級分析化學(xué)實驗在大學(xué)三年級開設(shè)，學(xué)生已經(jīng)具備了無機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)和物理化學(xué)的基本知識和實驗操作技巧，同時也具備了基本的數(shù)據(jù)統(tǒng)計能力，因此該實驗的開設(shè)對于提高學(xué)生的綜合實驗?zāi)芰哂幸欢ǖ囊饬x。該實驗與生活實踐具有一定的聯(lián)系，為后續(xù)實現(xiàn)樣品中痕量過氧化氫含量的測定提供一定的研究思路，可以拓展本科生的科研興趣和視野，對于本科生開展后續(xù)的研究型實驗和本科畢業(yè)論文具有一定的推動作用，可促進(jìn)教學(xué)研究的開展和培養(yǎng)學(xué)生的綜合及創(chuàng)新能力。