劉穎 熊磊 蔡若雪 陳越 葉勁軍 沈波 周國仁
肺癌發(fā)病率在全球惡性腫瘤中位居第二[1],其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌的85%。免疫檢查點抑制劑的臨床應用顯著改善了NSCLC患者的臨床預后。但是,腫瘤微環(huán)境具有復雜性和異質性,因此仍有部分患者不能受益于免疫治療[2]。目前已知的預測因子包括腫瘤組織中程序性細胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)的表達[3]和腫瘤突變負荷(tumor mutational burden, TMB)[4-6]等,評估腫瘤微環(huán)境中的詳細成分(如骨髓細胞和其他免疫細胞)的研究正在不斷開展[7]。三級淋巴結構(tertiary lymphoid structure, TLS)是與次級淋巴器官(secondary lymphoid organs, SLO)高度相似的異位淋巴器官,有研究[8,9]發(fā)現TLS的存在與多種實體瘤(包括NSCLC)免疫治療的良好預后密切相關。本文對TLS在NSCLC免疫治療中的預后價值進行綜述,旨在為篩選NSCLC免疫治療適宜人群以及開展后期研究提供參考。
1.1 TLS的組成 TLS通常在生理條件下不會形成,它是在慢性炎癥部位非淋巴組織中發(fā)育的異位淋巴器官[10],在各種病理生理學情況下發(fā)展,包括自身免疫性疾病[11]、感染性疾病[12]和腫瘤[13]等,驅動一系列環(huán)境依賴性效應。當前已經在多種實體瘤(包括黑色素瘤[14]、結直腸癌[15]、乳腺癌[16]和NSCLC[17]等)中發(fā)現,TLS與腫瘤免疫治療的預后密切相關。TLS主要由B細胞、T細胞和樹突狀細胞(dentritic cell, DC)組成[18]。在腫瘤微環(huán)境中,TLS作為免疫細胞聚集體,盡管主要由內部CD20+B細胞區(qū)和周圍CD3+T細胞區(qū)組成[19],不同的DC也同時構成DC細胞群。TLS為DC將相鄰腫瘤抗原局部呈遞給T細胞,以及為B細胞、T細胞的活化和增殖提供場所,從而產生記憶性輔助T細胞、效應記憶性細胞毒性細胞、記憶性B細胞和產生抗體的漿細胞[20,21]。TLS的成熟度可分成三個階段:早期TLSs(early-TLS, E-TLS)——無濾泡樹突狀細胞(follicle dendritic cell, FDC)的致密淋巴細胞聚集體;初級濾泡樣TLSs(primary follicle-like TLS, PFL-TLS)——B細胞簇,無生發(fā)中心的FDC網;次級濾泡樣TLS(secondary follicle-like TLS, SFL-TLS)——B細胞簇,具有生發(fā)中心的FDC網。
高內皮小靜脈作為TLS的重要組成部分,起著招募免疫細胞的作用[22]。TLS的形成是一個多步驟的過程,這些免疫細胞、基質細胞和細胞外基質組分的逐漸積累和組織化最終形成功能性的淋巴組織,從而實現局部適應性免疫應答。因此,TLS的存在與良好的預后和對免疫治療的反應有關[23]。
1.2 TLS的特點及臨床應用 關于TLS在腫瘤中的分布位置尚無統(tǒng)一定論,這和它的位置難以確切評估相關。當前較多研究的是其在腫瘤周邊和腫瘤內位置與預后的關系。盡管在肝細胞癌和膽管癌中都有研究[24,25]證實腫瘤內TLS相較于腫瘤周邊與腫瘤更好的預后相關,但是大多數腫瘤中尚未發(fā)現TLS分布位置與預后的確切關系。此外,TLS在腫瘤中的成熟狀態(tài)具有異質性,不同成熟狀態(tài)的TLS在腫瘤中的預后作用可能不同。具有高成熟TLS的NSCLC患者免疫治療預后更好[26],這在食管癌[27]和胰腺癌[28]等多種實體瘤中都有證實。
由于TLS的位置、成熟度和豐度等均可能對腫瘤患者免疫治療的預后有影響,因此研究者們綜合TLS的特征,建立評分系統(tǒng),以完善TLS在預后作用中的臨床應用。根據TLS在腫瘤周圍組織和腫瘤內的TLS豐度進行評分是應用較多的方法[8],以此為基礎的免疫分型系統(tǒng)在很大程度上提高了TLS預后預測潛力,有助于精準治療的推動??偟膩碚f,TLS的組成、位置和空間結構的異質性,在臨床應用上體現在不同空間分布下其密度與腫瘤預后的相關性。評分過程中不可避免地會出現誤差,這主要是由于不同病理學家的評估標準不同以及評估過程中出現的問題,未來需要對TLS各個方面進行細化,對評分標準進行更嚴格的規(guī)定,以提高其對腫瘤預后作用的預測精確性。
1.3 TLS的檢測方法 對腫瘤組織切片進行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色是檢測TLS最簡單的方法。目前,通過免疫組化在組織中檢測TLS已成為較為普遍的形式,且特異性較好,可鑒定CD4+T細胞、CD8+T細胞和CD20+B細胞[29]。但TLS陽性的腫瘤組織中提取到的mRNA的多個特征比較具有異質性,且該方法無法探究TLS中免疫細胞互相作用的情況,因此仍需要開發(fā)更可靠的TLS檢測方法。多重免疫熒光技術可以在組織切片上標記TLS相關細胞,進行識別和定量分析,區(qū)分不同亞型和成熟度的TLS[30],是當前使用較多的檢測方法,用于評估TLS成熟度、密度以及組成對腫瘤預后的影響。轉錄組測序技術是高通量分析的理想選擇,但是受限于參考數據的偏差,并且需要大量樣本才能建立參考數據并進行驗證[31,32]??臻g組學的進步使得TLS的檢測方法過渡到數字空間分析技術和多重免疫熒光技術,可以從分子層面更清晰地探索TLS的組成和功能[33]。
既往有研究[34]證實,TLS評分是一個獨立的陽性預后因素,提高了各病理分期的預后能力,因此有望完善可切除NSCLC的腫瘤原發(fā)灶-淋巴結-轉移(tumor-nodemetastasis, TNM)分期。一項納入112例接受完全切除的IB期肺腺癌患者的研究[35]也證實了TLS作為獨立預后因素的作用。該研究中,TLS陽性患者與TLS陰性患者相比,TLS陽性與更長的無復發(fā)生存期(recurrence free survival, RFS)相關(HR=0.47, 95%CI: 0.23-0.88,P=0.02),多因素分析發(fā)現TLS是RFS的獨立預后因素,且TLS陽性和陰性患者的PD-L1表達(P=0.54)和TMB(P=0.39)均無明顯差異。該研究中通過HE染色和免疫組化評估TLS是否存在,表明NSCLC中存在TLS是有利的預后因素,且與肺腺癌患者的PD-L1表達無關。在軟組織肉瘤中也證實存在TLS患者的6個月無進展生存率(non-progression rate, NPR)和客觀緩解率(objective response rate, ORR)分別為40%(95%CI:22.7%-59.4%)和30%(95%CI: 14.7%-49.4%),遠高于全隊列的NPR和ORR[36]。一項納入147例NSCLC患者的單中心回顧性研究[37]中,TLS高表達組的無病生存期(diseasefree survival, DFS)高于低表達組(P=0.027),證實II、III期NSCLC患者手術后TLS高表達與預后良好相關。此外,該研究還發(fā)現外周血中低中性粒細胞淋巴細胞比值和少量抗原呈遞細胞可表明腫瘤微環(huán)境中存在TLS。
TLS組成和空間結構決定其與免疫治療的關系密不可分,因此它在化學治療中的預測作用十分有限。一項納入來自114例接受鉑類化療作為轉移性一線治療NSCLC患者的研究[38]中,TLS陽性組的ORR和中位無進展生存期(progression-free survival, PFS)與TLS陰性組之間無差異(50%vs48.8%,P=1;4.7個月vs4.4個月,P=0.9),表明TLS不能預測接受化療的轉移性NSCLC患者的臨床結果。然而,有研究[39]顯示TLS與新輔助化療可切除NSCLC患者的主要病理反應密切相關,亦有研究[40,41]報道新輔助化療增加細胞毒性T細胞和B細胞浸潤,并降低可切除NSCLC患者腫瘤中叉頭框蛋白P3(forkheadbox P3, FoxP3)T細胞的密度。
總結來說,TLS是否存在、成熟度和表達度等都會對NSCLC患者的預后產生影響,并且主要是與接受免疫治療的患者相關。但是TLS的特征中究竟何者是最佳選擇尚無定論,因此當前越來越多研究基于TLS的分布位置,結合其豐度等特點,建立TLS評分系統(tǒng),旨在提高其對NSCLC預后的預測能力。
研究者們[42]通過建立小鼠模型研究TLS與肺腺癌免疫治療反應之間的潛在機制,發(fā)現小鼠模型中有效的免疫療法需要形成CXCL13依賴性TLS,并且TLS與肺腺癌對免疫治療的反應相關。多項研究[43,44]都證明免疫治療可以誘導腫瘤小鼠模型的TLS形成和成熟。在肺腺癌患者中,研究者們通過免疫組化研究TLS表型,將TLS分為高成熟組和低成熟組,證實成熟TLS與引流淋巴結中細胞毒性淋巴細胞數量增加和淋巴細胞轉移頻率降低相關,這表明成熟的TLS 可能通過活化淋巴細胞增強抗腫瘤免疫治療效果[45]。在食管癌[46]、膽管癌[25]和結直腸癌[15]等實體瘤中,也證實了TLS的空間分布和豐度與免疫治療反應顯著相關。
新輔助治療可降低原發(fā)灶腫瘤負荷,為患者爭取手術機會,隨著精準治療理念的深入,新輔助治療方案也從既往的新輔助化療發(fā)展至新輔助靶向治療、新輔助免疫治療和新輔助內分泌治療等多種策略。輔助免疫治療可以誘導機體產生持久的抗腫瘤免疫反應,并清除微小殘留病灶。因此,可切除肺癌患者可通過新輔助免疫治療方案獲得更低的術后復發(fā)或遠處轉移風險,從而有更好的臨床獲益[47-49]。探索新輔助免疫治療的適宜人群也刻不容緩。截至目前,TLS在肺癌免疫治療預后中的價值已被大量研究證實。越來越多的研究者們開始探索TLS在肺癌新輔助免疫治療中的預后作用。一項回顧性研究[50]探討了腫瘤微環(huán)境與不同新輔助方式治療的病理反應在NSCLC的相關性,研究中達到主要病理緩解(major pathological response,MPR)的患者有更高的TLS,達到完全病理緩解(pathologic complete response, PCR)的患者有顯著較低的FoxP3 T細胞密度,從腫瘤微環(huán)境角度為理解新輔助免疫聯合化療優(yōu)于單獨化療的機制提供新見解。TLS與病理反應的關系不僅存在于NSCLC中,在接受新輔助免疫聯合化療的乳腺癌患者中,TLS狀態(tài)與PCR顯著相關,TLS豐度對人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)陰性乳腺癌病理反應具有獨立預測價值[16]。接受了伊匹木單抗和納武利尤單抗雙免治療的尿路上皮癌患者中,達到完全緩解的患者可觀察到TLS富集[51]。為探索新輔助免疫聯合化療方案的潛在分子機制,研究者們選取了IIIA期行手術切除的NSCLC患者,對其CD45免疫細胞行單細胞轉錄組和T細胞受體測序,這些患者都接受了新輔助免疫聯合化療,研究發(fā)現在腫瘤病變中,CXCL13和CXCL12趨化因子顯著富集,證實新輔助免疫聯合化療刺激了TLS形成[17]。一項探索三級淋巴結結構的成熟度和豐度與接受新輔助免疫治療的肺癌患者的療效相關性的研究[26]發(fā)現,TLS高成熟度和高豐度組比低成熟度和低豐度組具有更好的DFS,多變量分析顯示TLS成熟度在新輔助免疫聯合化療組中(P=0.014, HR=4.527, 95%CI: 1.351-15.167)是DFS的獨立預測因子。該研究通過HE和免疫組化對TLS進行鑒定和定量分析,證實TLS成熟度與MPR相關,是接受新輔助免疫聯合化療的NSCLC患者DFS的獨立預測因子,并且誘導TLS成熟可能是新輔助化療免疫治療在可切除NSCLC中的潛在作用機制。鑒于TLS不同特征在NSCLC預后和免疫治療中的作用,本文在表1對相關研究進行了總結。
表1 TLS與NSCLC患者預后的相關性研究Tab 1 Studies on the relationship between TLS and the prognosis of NSCLC
在腫瘤微環(huán)境的背景下,TLS的形成和發(fā)展有利于調節(jié)抗腫瘤免疫應答并改善腫瘤患者對免疫檢查點抑制劑的耐藥性。當前多項研究探索了TLS在NSCLC免疫治療中的預后作用,尤其在新輔助免疫療法推進的同時,起著不可或缺的作用,但其具體作用機制仍不清楚。并且,由于TLS的檢測方法多樣,最常用的HE染色難以清晰識別TLS并進行評估,多重免疫熒光和轉錄組測序等尚不能在臨床普遍應用,因此TLS在臨床上的擴展受限。TLS的空間分布和豐度等都與NSCLC免疫治療的預后相關,未來需進一步細化TLS結構和功能,綜合TLS多種特征,建立完善的評分機制。并且后續(xù)在研究TLS作用機制的同時,探索TLS誘導、化療藥物和免疫治療間的潛在協同作用將有利于制定更有效的治療方案。未來在腫瘤微環(huán)境的推動下,腫瘤預后生物標志物的研究將越來越精準化,逐步實現NSCLC的個性化治療。