羅宏 代思思 李亞倫 田攀文 李沁桐 蔡緒雨

肺癌是當(dāng)今全球最常見的癌癥，其發(fā)病率和癌癥致死率都位居前列[1]。多數(shù)肺癌患者就診時(shí)已處于疾病晚期，預(yù)后較差；以免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）為主的免疫治療的應(yīng)用是腫瘤治療中的一項(xiàng)重大轉(zhuǎn)折，顯著提高了晚期非小細(xì)胞肺癌患者的臨床預(yù)后，已成為晚期肺癌患者的一線治療。但僅有20%肺癌患者從免疫治療中獲益[2]，在目前的臨床實(shí)踐中，很難準(zhǔn)確篩選患者群體在免疫療法中持續(xù)受益。靶向程序性死亡受體1（programmed death receptor 1, PD-1）和程序性死亡配體1（programmed death ligand 1, PD-L1）是ICIs治療的主要策略，因此，PD-L1的表達(dá)最初被認(rèn)為是預(yù)測(cè)抗PD-1/PD-L1治療反應(yīng)的合理生物標(biāo)志物，但現(xiàn)有研究[3,4]指出，PD-L1表達(dá)無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)免疫治療療效。并且，由于PD-L1檢測(cè)依賴于腫瘤組織，取材限制導(dǎo)致其表達(dá)的時(shí)空異質(zhì)性[5,6]，更加影響了PD-L1檢測(cè)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性[7]。另外，組織樣本無法多次取樣，難以實(shí)時(shí)檢測(cè)免疫治療過程中的變化。因此迫切地需要取材方便的檢測(cè)方法，以監(jiān)測(cè)免疫治療全過程的療效。外周血檢測(cè)作為臨床常規(guī)的檢查方案，具有簡(jiǎn)便且創(chuàng)傷小的優(yōu)勢(shì)，且能在不同時(shí)間點(diǎn)多點(diǎn)取樣以達(dá)到縱向?qū)Ρ确治霾⑷瘫O(jiān)測(cè)的目的，其作為探究免疫治療生物標(biāo)志物的重要價(jià)值正在被不斷開發(fā)[8-10]。除此之外，外周血中免疫細(xì)胞狀態(tài)與接受免疫治療的肺癌患者預(yù)后的關(guān)系也被多次報(bào)道[11-13]。本研究對(duì)接受ICIs治療的晚期肺癌患者外周血實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)及免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行探究，分析其與ICIs治療療效及預(yù)后的相關(guān)性，以期為晚期肺癌免疫治療療效預(yù)測(cè)和預(yù)后評(píng)估提供新的見解。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 本研究前瞻性納入2021年5月至2023年7月在四川大學(xué)華西醫(yī)院肺癌中心就診并接受抗PD-1/PD-L1治療的III-IV期肺癌患者，收集臨床病理資料及外周血實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn)：①組織病理學(xué)檢查確診為肺癌；②臨床分期為III-IV期的肺癌；③基因檢測(cè)無表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）/間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）/c-ros肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶（ROSproto-oncogene 1, receptor tyrosine kinase,ROS1）等驅(qū)動(dòng)基因突變；④東部合作腫瘤小組（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）評(píng)分≤2分；⑤接受免疫聯(lián)合化療作為系統(tǒng)抗腫瘤治療；⑥未患有需要全身治療的活動(dòng)性自身免疫性疾??；⑦未接受其他已批準(zhǔn)的全身性免疫調(diào)節(jié)劑、長期大量使用激素或使用其他免疫抑制劑；⑧臨床資料完整且具備至少1年的隨訪信息。

1.2 資料收集 對(duì)于所有符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者，收集臨床病理學(xué)資料：診斷、性別、年齡、ECOG、吸煙史、腫瘤家族史、病理類型和臨床分期和治療方案。收集患者外周血實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)包括：外周血白細(xì)胞（white blood cell, WBC）計(jì)數(shù)、外周血淋巴細(xì)胞百分比（lymphocyte percentage,LYMPH%）、中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞百分比（neutrophil-tolymphocyte ratio, NLR）及細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1）等。免疫治療反應(yīng)根據(jù)實(shí)體瘤免疫療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)（modified Response Evaluation Criteria in Solid Tumors 1.1 for immune-based therapeutics, iRECIST 1.1）每周期（3-4周）進(jìn)行評(píng)估，6個(gè)月緩解狀態(tài)依據(jù)患者從首次用藥開始隨訪至6個(gè)月的全程綜合評(píng)估，反應(yīng)者（responders, R）包括完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）和疾病穩(wěn)定（stable disease,SD）持續(xù)時(shí)間≥6個(gè)月，無反應(yīng)者（non-responders, NR）定義為在首次用藥開始6個(gè)月內(nèi)發(fā)生疾病進(jìn)展（progressive disease, PD），無論最佳療效如何。預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)采用無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）。PFS是指從首次接受免疫治療開始直至影像學(xué)或PD或因任何原因死亡的時(shí)間。末次隨訪時(shí)間為2023年7月9日，隨訪時(shí)長為369-844 d。

1.3 樣本采集 對(duì)于流式分析隊(duì)列的所有患者，自愿參與研究并簽署書面知情同意書，采集首次用藥前3天內(nèi)的外周血及用藥1個(gè)周期后的外周靜脈血5.0 mL于含有EDTA抗凝劑的真空采血管中，顛倒混勻，轉(zhuǎn)移到離心管中，離心分層后，分離血漿及外周血。將外周血緩慢加入Ficoll液中，4oC、800g20 min，升速=1，降速=1。吸取中間白膜層于5 mL RPMI中，4oC、500g、7 min。加入1-2 mL裂紅液，室溫裂解約3 min后，4oC、500g、5 min。PBS清洗，4oC、500g、5 min。將細(xì)胞重懸于PBS至濃度為2×106/mL，備用。

1.4 多色流式細(xì)胞術(shù)分析 熒光抗體CD3、CD19、CD8、轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子1（transcription factor T cell factor 1,TCF1）購自美國BD公司；CD4、PD-1購自Biolegend公司；LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain（L/D）、BV stain buffer購自Sigma-Aldrich公司。355、405、640 nm激光器配置Symphony A5流式細(xì)胞儀（美國BD Bioscience）。根據(jù)已滴定好的抗體質(zhì)量濃度及建立的流式檢測(cè)方案，檢測(cè)27例晚期肺癌患者接受ICIs治療前后兩次外周血標(biāo)本。預(yù)先將CD3、CD19、CD4、CD8、TCF-1、PD-1抗體和L/D染料混合于50.0 μL BV stain buffer中，抗體加入量按照已滴定好的最適濃度加入。取50.0 μL已準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液與50.0 μL混合抗體混勻，于冰上避光孵育30 min，加入1 mL PBS，400g5 min清洗，棄上清，加入300 μL PBS重懸，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄約1×106個(gè)Events，通過Flowjo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖均采用R 4.2.1進(jìn)行。比較不同療效組別間指標(biāo)差異，分類計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切檢驗(yàn)分析；定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）或中位數(shù)（Q1, Q3）表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析。通過繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線確定外周血免疫細(xì)胞因子在預(yù)測(cè)晚期肺癌免疫治療療效中的cut-off值，并通過Logistic回歸分析確定患者免疫治療療效的影響因素。繪制Kaplan-Meier曲線并利用Log-rank檢驗(yàn)比較組間PFS差異。通過Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行單因素與多因素分析校正其他變量后PFS的預(yù)后影響因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床病理特征 本臨床研究共納入69例晚期肺癌患者。其中男性61例（88.4%），女性8例（11.6%），年齡≥65歲25例（36.2%），＜65歲44例（63.8%）。其中腺癌34例（49.3%），鱗癌20例（29.0%），其他病理類型15例（21.7%）。所有入組患者接受抗PD-1/PD-L1免疫治療，66例（95.7%）患者接受化療聯(lián)合免疫治療，3例（4.3%）患者接受免疫單藥治療?；颊呓邮苤委熀驲組42例（60.9%），NR組27例（39.1%）。流式隊(duì)列是來自總臨床研究隊(duì)列中的27例患者，其中男性24例（88.9%），女性3例（11.1%），年齡≥65歲10例（37.0%），年齡＜65歲17例（63.0%），R組13例（48.1%），NR組14例（51.9%）。表1為本研究隊(duì)列患者不同療效組別臨床病理特征，R組與NR組患者在年齡、性別、吸煙史等臨床病理特征方面無顯著差異（P＞0.05），基線可比。

表1 晚期肺癌患者臨床病理特征及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果Tab 1 Clinical characteristics and laboratory test results of patients with advanced lung cancer

2.2 臨床隊(duì)列外周血實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)與免疫治療療效的相關(guān)性 共有42例（60.9%）患者在接受免疫治療后獲得持續(xù)6個(gè)月以上的臨床緩解。收集患者治療前基線（B1）與1個(gè)周期治療后（B2）的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，對(duì)比R組和NR組治療前及治療1個(gè)周期后外周血檢測(cè)指標(biāo)的差異，結(jié)果顯示治療1個(gè)周期后R組患者的LYMPH%（P=0.006）高于治療NR組。而治療1個(gè)周期后有R組患者的腫瘤標(biāo)志物CYFRA21-1（P＜0.001）、WBC（P＜0.001）、NLR（P=0.011）明顯低于治療NR組（表1）。采用ROC曲線，確定第1個(gè)周期治療后外周血的WBC的cut-off值為8.275×109/L（圖1A），高于8.275×109/L的患者為高水平組；CYFRA21-1的cut-off值為4.255 ng/mL（圖1B），高于4.255 ng/mL的患者為高水平組；LYMPH%的cut-off值為31.550%（圖1C），高于31.850%的患者為高水平組；NLR的cut-off值為1.738（圖1D），高于1.738的患者為高水平組。將患者治療1個(gè)周期后外周血的CYFRA21-1、LYMPH%、WBC、NLR以及年齡、吸煙史、腫瘤家族史等指標(biāo)納入Logistic單因素分析（表2），結(jié)果顯示治療1個(gè)周期后高CYFRA21-1（OR=15.00,95%CI: 3.40-66.00,P＜0.001）、高WBC（OR=13.00,95%CI: 2.80-63.00,P=0.001）、高NLR（OR=10.00, 95%CI:1.20-86.00,P=0.033）是免疫治療療效的危險(xiǎn)因素，高LYMPH%（OR=0.09, 95%CI: 0.01-0.74,P=0.025）是免疫治療療效的保護(hù)因素（表2）。

表2 晚期肺癌患者療效與外周血指標(biāo)單因素Logistic回歸分析Tab 2 Univariate Logistic regression analysis between response to treatment and peripheral factors in patients with advanced lung cancer

2.3 臨床隊(duì)列外周血實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)與患者PFS的相關(guān)性69例晚期肺癌患者中位PFS為250 d。對(duì)PFS進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)治療1個(gè)周期后低水平的WBC可以降低進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)（HR=0.44, 95%CI: 0.23-0.84,P=0.013），治療后低水平的CYFRA21-1（HR=0.51, 95%CI: 0.26-1.00,P=0.049）的患者有更長的PFS，詳見表3。根據(jù)Cox回歸發(fā)現(xiàn)的影響預(yù)后的因素分組繪制相應(yīng)的生存曲線圖（圖2A-圖2C）。發(fā)現(xiàn)治療1個(gè)周期后WBC＜8.275×109/L組的患者相較于WBC≥8.275×109/L組有更長的PFS（P＜0.001），治療1個(gè)周期后LYMPH%≥31.550%的患者PFS顯著長于低水平組（P=0.041），NLR＜1.738的患者比高水平組的患者有更長的PFS（P=0.030）。

圖2 晚期肺癌患者PFS的Kaplan-Meier生存分析。A：用藥1個(gè)周期后（B2），按WBC分組的患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線；B：用藥1個(gè)周期后（B2），按LYMPH%分組的患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線；C：用藥1個(gè)周期后（B2），按NLR分組的患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線；D：治療前（B1），按外周血TCF1+CD8+ T 細(xì)胞分組的患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線；E：用藥1個(gè)周期后（B2），按WBC細(xì)胞分組的患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線。Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis for PFS of patients with advanced lung cancer.A: Kaplan-Meier survival curves for PFS in 69 patients with advanced lung cancer grouped by WBC 1 cycle after treatment (B2); B: Kaplan-Meier survival curves for PFS in 69 patients with advanced lung cancer grouped by LYMPH% 1 cycle after treatment (B2); C: Kaplan-Meier survival curves for PFS in 69 patients with advanced lung cancer grouped by NLR 1 cycle after treatment (B2); D: Kaplan-Meier survival curves for PFS in FACS cohort patients grouped by TCF1+CD8+ T at baseline(B1); E: Kaplan-Meier survival curves for PFS in FACS cohort patients grouped by peripheral WBC 1 cycle after treatment (B2).PFS: progression-free survival.

表3 晚期肺癌患者PFS相關(guān)單因素和多因素分析Tab 3 Univariate and multivariate analysis of PFS in patients with advanced lung cancer

2.4 外周血淋巴細(xì)胞亞群與療效的相關(guān)性 對(duì)本研究隊(duì)列中27例具有治療前后配對(duì)的外周血樣本進(jìn)行多色流式細(xì)胞術(shù)，分析淋巴細(xì)胞亞群與治療反應(yīng)的相關(guān)性。對(duì)比分析R組和NR組治療前及治療1個(gè)周期后外周血檢測(cè)指標(biāo)的差異，結(jié)果顯示治療前R組患者的基線TCF1+CD8+T淋巴細(xì)胞占比（P=0.035）高于治療NR組。治療1個(gè)周期后PD-1+CD4+T淋巴細(xì)胞在R組患者中顯著更高（P=0.043）（表4），而相應(yīng)指標(biāo)在治療前基線樣本中未發(fā)現(xiàn)顯著差異。采用ROC曲線，確定基線（B1）外周血的TCF1+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比的cut-off值為24%（圖1E），高于24%的患者為高水平組；治療1個(gè)周期后（B2）PD-1+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比的cut-off值為3.3%（圖1F），高于3.3%的患者為高水平組。將基線TCF1+CD8+T淋巴細(xì)胞占比、治療1個(gè)周期后PD-1+CD4+T淋巴細(xì)胞占比、CYFRA21-1、LYMPH%以及WBC等指標(biāo)作為變量納入Logistic回歸模型，結(jié)果顯示，治療1個(gè)周期后高WBC（OR=7.30, 95%CI: 1.20-46.00,P=0.034）是免疫治療反應(yīng)的危險(xiǎn)因素，基線外周血中高水平TCF1+CD8+T淋巴細(xì)胞占比（OR=0.05, 95%CI: 0.0047-0.49,P=0.010）、治療1個(gè)周期后高LYMPH%（OR=0.09, 95%CI: 0.01-0.90,P=0.041）和高水平PD-1+CD4+T淋巴細(xì)胞占比（OR=0.12, 95%CI: 0.02-0.69,P=0.017）是免疫治療反應(yīng)的保護(hù)性因素（表2）。

2.5 外周血淋巴細(xì)胞亞群與患者PFS的相關(guān)性 流式隊(duì)列27例晚期肺癌患者中位PFS為199 d。對(duì)PFS進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)基線低水平TCF1+CD8+T淋巴細(xì)胞占比的疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)更高（HR=4.84, 95%CI: 1.44-16.31,P=0.011），治療1個(gè)周期后低水平WBC（HR=0.32, 95%CI:0.11-0.93,P=0.037）和低水平CYFRA21-1（HR=0.16, 95%CI:0.05-0.54,P=0.003）可以降低患者疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，詳見表5。根據(jù)Cox回歸發(fā)現(xiàn)的影響預(yù)后的因素分組繪制相應(yīng)的生存曲線圖（圖2D-圖2E）。發(fā)現(xiàn)基線TCF1+CD8+T淋巴細(xì)胞占比＞24%的患者的PFS顯著長于低水平組患者（P=0.020），治療1個(gè)周期后WBC＜8.275×109/L組的患者相較于WBC≥8.275×109/L組有更長的PFS（P=0.017）。

表5 流式隊(duì)列晚期肺癌患者PFS相關(guān)單因素和多因素分析Tab 5 Univariate and multivariate analysis of PFS in FACS cohort patients with advanced lung cancer

3 討論

大部分肺癌患者確診時(shí)已處于病情中晚期階段，喪失手術(shù)根治性切除病灶的機(jī)會(huì)。以抗PD-1/PD-L1為主的免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合化療治療已經(jīng)成為驅(qū)動(dòng)基因陰性中晚期肺癌的一線標(biāo)準(zhǔn)治療，在大量的臨床研究中都顯示出優(yōu)于化療的效果[14-17]，能夠有效延長肺癌患者總生存期及PFS。然而，只有一少部分患者可從免疫治療中獲益，而目前尚缺乏用于指導(dǎo)臨床實(shí)踐的生物標(biāo)志物。目前對(duì)于免疫治療生物標(biāo)志物的探索，大多研究者都關(guān)注于在腫瘤微環(huán)境、腫瘤免疫和循環(huán)腫瘤DNA等層面的研究，但腫瘤組織取材具有較大難度，無法作為常規(guī)臨床監(jiān)測(cè)方案。近期有不少研究關(guān)注到免疫治療過程中外周血指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，提示外周血免疫細(xì)胞狀態(tài)與免疫治療反應(yīng)的相關(guān)性[12,13,18]，因此本研究收集了入組中晚期肺癌患者的臨床病理學(xué)資料，結(jié)合臨床常規(guī)的血液學(xué)標(biāo)志物結(jié)果，探索出一些與PD-1/PD-L1抑制劑療效及預(yù)后相關(guān)的因素。以期望能夠篩選出中晚期肺癌患者中最可能從免疫治療中獲益的人群，為臨床用藥決策提供一些思路。

本研究的療效相關(guān)性分析結(jié)果提示相對(duì)于NR組的患者而言，治療1個(gè)周期后R組患者有顯著更高的LYMPH%，而治療1個(gè)周期后腫瘤標(biāo)記物CYFRA21-1、WBC及NLR水平明顯更低。推測(cè)可能與免疫治療有效地激活了機(jī)體的免疫系統(tǒng)并縮減了患者腫瘤負(fù)荷有關(guān)。此外，治療早期的外周血標(biāo)志物能夠很好地預(yù)測(cè)患者6個(gè)月的臨床獲益，這與既往文獻(xiàn)[8,19,20]報(bào)道的早期外周血指標(biāo)具有預(yù)測(cè)免疫治療療效的價(jià)值的觀點(diǎn)一致。在預(yù)后分析結(jié)果中，治療1個(gè)周期后LYMPH%、WBC、CYFRA21-1、NLR可以預(yù)測(cè)PFS，且WBC與CYFRA21-1是PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

總研究隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)在治療1個(gè)周期后外周血LYMPH%與治療反應(yīng)顯著相關(guān)，本研究進(jìn)一步探索與免疫療效及預(yù)后相關(guān)的外周血細(xì)胞亞群。前瞻性地采集了27例患者新鮮外周血樣本進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)。通過分析患者治療前后的縱向外周血發(fā)現(xiàn)基線TCF1+CD8+T細(xì)胞與治療1個(gè)周期后PD-1+CD4+T細(xì)胞與免疫治療反應(yīng)顯著相關(guān)，并且基線TCF1+CD8+T細(xì)胞占比是中晚期肺癌患者PFS的獨(dú)立影響因素。我們的結(jié)果提示，基線TCF1+CD8+T細(xì)胞占比更高的患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療有更好的反應(yīng)并且PFS更長。既往小鼠研究也提到TCF1+干性記憶T細(xì)胞亞群可能是腫瘤免疫微環(huán)境中T細(xì)胞的主要來源，可以自我更新以及分化，介導(dǎo)對(duì)免疫治療的持續(xù)反應(yīng)[21-24]。推測(cè)具有此類特征的患者更可能從免疫治療中獲益，但尚需研究揭示其反應(yīng)機(jī)制。

本研究作為單中心前瞻性隊(duì)列研究，符合標(biāo)準(zhǔn)的入組患者數(shù)量少，導(dǎo)致一定的集合偏倚，患者使用的免疫治療藥物和治療周期不同，隨訪時(shí)間不同。另外，本研究入組患者中23%患者的CYFRA21-1水平結(jié)果未完善導(dǎo)致未能收集。因此需要更大規(guī)模多中心前瞻性研究來進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。

綜上所述，本研究顯示基線高TCF1+CD8+T細(xì)胞占比、治療1個(gè)周期后外周血LYMPH%更高、WBC、NLR及CYFRA21-1水平明顯更低的中晚期肺癌患者更可能從免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中獲益。未來可以通過更大樣本量的研究進(jìn)一步探索TCF1+CD8+T細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)在晚期肺癌患者中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床醫(yī)生提供更方便有效的參考依據(jù)。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Cai XY and Li QT conceived and designed the study.Luo H and Dai SS performed the experiments.Luo H and Dai SS analyzed the data.Li YL and Tian PW contributed analysis tools.Cai XY, Li QT, Li YL and Tian PW provided critical inputs on design, analysis and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the fnal manuscript as submitted.