楊華軍 何仕瓊 李小平 林江 杜飛 簡悅

(1遵義市第一人民醫(yī)院(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院)呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 遵義 563002;2興義市人民醫(yī)院(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬興義醫(yī)院))

肺癌是起源于肺實(shí)質(zhì)或氣道的惡性腫瘤,是癌癥死亡的首要原因〔1〕。因早期診斷困難,大多數(shù)患者出現(xiàn)疑似肺癌的癥狀或偶然發(fā)現(xiàn)胸部影像學(xué)異常而進(jìn)行診斷性評估,確診時(shí)已喪失最佳治療機(jī)會,預(yù)后較差。肺癌轉(zhuǎn)移是病情惡化的主要原因,但轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散的分子機(jī)制尚不明確。研究表明,miRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及分化,在腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用〔2〕。miR-195-5p在甲狀腺癌中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的作用〔3〕,在骨肉瘤中,環(huán)狀RNA Circ001422通過miR-195-5p/成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)2/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)軸導(dǎo)致病情惡化〔4〕。妊娠相關(guān)血清蛋白(PAPP)A與細(xì)胞生長、分化密切相關(guān),并參與腫瘤形成。靶基因預(yù)測其可能是miR-195-5p的靶基因,但miR-195-5p與PAPPA在肺癌中的研究還未見報(bào)道,本研究探討miR-195-5p靶向PAPPA對肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺腺癌細(xì)胞A549、人支氣管黏膜上皮細(xì)胞BEAS-2B(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);Lipo-fectamine 3000(美國Invitrogen公司);miR-NC、miR-195-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-195-5p(上海生工生物工程有限公司);si-NC、si-PAPPA(美國San-ta Cruz公司);對照質(zhì)粒(pcDNA)、過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-PAPPA)、野生型(WT)及突變型(MUT)PAPPA基因3′UTR熒光素酶表達(dá)載體(上海漢恒生物科技有限公司);實(shí)時(shí)熒光量定-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、SYBR Green熒光染料試劑盒(大連TaKaRa公司);胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基(泰思騰生物技術(shù)有限公司);CCK-8試劑盒、PAPPA抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG二抗、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基分別培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞和人支氣管黏膜上皮細(xì)胞BEAS-2B。將細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種24孔板,培養(yǎng)至融合度為50%時(shí),更換為不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-NC組與miR-195-5p組通過Lipofectamine3000分別將miR-NC質(zhì)粒和miR-195-5p mimics轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6 h后更換為常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4 d,收集對數(shù)生長期細(xì)胞檢測細(xì)胞增殖。si-NC組、si-PAPPA組分別轉(zhuǎn)染si-NC質(zhì)粒與si-PAPPA質(zhì)粒至A549細(xì)胞,轉(zhuǎn)染及處理方法同上。為證實(shí)miR-195-5p是靶向PAPPA調(diào)控A549細(xì)胞增殖及凋亡,將miR-195-5p mimics分別與pcDNA及pcDNA-PAPPA共同轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞,檢測PAPPA能否逆轉(zhuǎn)miR-195-5p促進(jìn)凋亡及抑制增殖的生物學(xué)作用,后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為miR-195-5p+pcDNA組、miR-195-5p+pcDNA-PAPPA組,轉(zhuǎn)染方法同上。

1.3總RNA提取 槍頭、EP管均去酶處理,Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA。取2 μl RNA樣品于紫外分光光度計(jì)上測定純度及濃度。

1.4qRT-PCR 用qRT-PCR試劑盒檢測miRNA相對含量。按說明書步驟進(jìn)行操作,用基因特異性RT引物(U6:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′;miR-195-5p:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACGCCAATAT-3′)及通用型逆轉(zhuǎn)錄引物oligo dT prime將500 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。DEPC水將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA稀釋5倍,采用特異性引物(β-actin上游引物:5′-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3′,下游:5′-CTTCGCGG-GCG ACGAT-3′;PAPPA上游引物:5′-ACAAA-GACCCACGCTACTTTTT-3′,下游:5′-CATGAACTGCCC ATCATAGGTG-3′;miR-195-5p上游引物:5′-GATAGCAGCACAGAAATATTGGG-3′,下游:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′,下游:5′-AGAG-AAGATTAGCATGGCCCCTG-3′)進(jìn)行PCR,20 μl體系(PCR條件:95 ℃熱啟動3 min,95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s,40個(gè)循環(huán)),每孔均設(shè)2個(gè)復(fù)孔,采用2-ΔΔCt分析各組miRNA相對含量。

1.5CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml,以100 μl/孔接種于96孔板,空白孔加入100 μl完全培養(yǎng)基,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。分別在鋪板后1、2、3、4 d取出培養(yǎng)板,吸出培養(yǎng)基,每孔加入含10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基100 μl,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h;再取出培養(yǎng)板在酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測吸光度OD值。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn) 用無血清培養(yǎng)液重懸各組細(xì)胞,基質(zhì)膠平鋪覆蓋Transwell上室,取200 μl接種并培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)液,用4%多聚甲醛固定30 min,再加入結(jié)晶紫染色,漂洗干燥后用顯微鏡拍照并計(jì)數(shù),即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn) 用標(biāo)記筆在6孔板背后每隔0.5～1.0 cm劃一道橫線,從中間橫穿過孔,每孔至少穿過5條線,在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),第2天用10 μl槍頭比著直尺,與標(biāo)記線垂直的方向劃兩條平行線。用磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞洗滌3次,吸出劃下的細(xì)胞,再加入無血清培養(yǎng)基,放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱,分別在0、6、12、24 h倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.8Western印跡 收集各組細(xì)胞加入RIPA蛋白裂解液,提取細(xì)胞總蛋白并用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度,各組蛋白(樣品量60 μg)進(jìn)行凝膠電泳,再轉(zhuǎn)膜封閉,90 min后加入PAPPA(1∶500)蛋白一抗,用Tis-HCl緩沖液(TBST)洗滌后再加入二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,TBST緩沖液反復(fù)沖洗3次,每次10 min,然后顯影,置于凝膠成像系統(tǒng)觀察各條帶并用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-195-5p和PAPPA在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá) miR-195-5p在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)較BES-2B明顯降低,而PAPPA在肺癌A549細(xì)胞中表達(dá)明顯增高,PAPPA蛋白在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)也明顯增高(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 PAPPA蛋白在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)

表1 miR-195-5p、PAPPA mRNA及蛋白相對表達(dá)量在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)

2.2過表達(dá)miR-195-5p對A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響 miR-195-5p組24、48、72、96 h細(xì)胞增殖能力顯著低于miR-NC組(P<0.05);miR-195-5p組A549細(xì)胞侵襲及遷移個(gè)數(shù)顯著低于miR-NC組(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 過表達(dá)miR-195-5p對A549細(xì)胞侵襲及遷移的影響(結(jié)晶紫染色,×100)

表2 過表達(dá)miR-195-5p對A549細(xì)胞增殖侵襲、遷移的影響

2.3沉默PAPPA對A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響 沉默PAPPA后A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力均顯著低于si-NC組(均P<0.05)。見表3。

表3 抑制PAPPA對A549細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響

2.4miR-195-5p靶向調(diào)控PAPPA表達(dá) 通過targetscan網(wǎng)站預(yù)測,miR-195-5p在靶基因PAPPA的3′UTR第833-840、848-854個(gè)堿基序列上具有相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PAPPA,再轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimics后A549細(xì)胞的熒光素酶活性(0.71±0.06)較miR-NC組(1.00±0.04)明顯降低(t=6.96,P=0.002);轉(zhuǎn)染MUT-PAPPA后再轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimics,A549細(xì)胞的熒光素酶活性(0.99±0.03)較miR-NC組(1.01±0.03)無明顯變化(t=0.82,P=0.460)。miR-195-5p組A549細(xì)胞中PAPPA蛋白表達(dá)(0.42±0.05)較miR-NC組(1.02±0.04)明顯降低(t=-16.32,P<0.05),轉(zhuǎn)染anti-miR-195-5p后A549細(xì)胞中PAPPA蛋白表達(dá)(1.11±0.05)明顯高于anti-NC組(0.99±0.04;t=-3.24,P=0.030)。見圖4。

圖3 PAPPA的3′UTR中含有與miR-195-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

圖4 各組PAPPA蛋白表達(dá)

2.5過表達(dá)PAPPA逆轉(zhuǎn)了miR-195-5p對A549細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移作用 miR-195-5p+pcDNA-PAPPA組A549細(xì)胞的增殖活性較miR-195-5p+pcDNA組明顯增強(qiáng)(P<0.05),侵襲及遷移能力明顯增加(P<0.05)。見表4。

表4 過表達(dá)PAPPA能逆轉(zhuǎn)miR-195-5p對A549細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響

3 討 論

肺癌因發(fā)病率高、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移早,早期診斷困難,很多病例確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期,導(dǎo)致臨床治療效果不理想,亟待尋找新的治療方法。癌癥擴(kuò)散轉(zhuǎn)移是病情惡化及預(yù)后不良的標(biāo)志,也是治療失敗和臨床死亡的首要原因。因此,肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究表明,miRNA影響癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)從而影響疾病轉(zhuǎn)化〔5〕。本研究結(jié)果提示,miR-195-5p具有調(diào)控肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的作用,miR-195-5p表達(dá)水平降低可能是非小細(xì)胞肺癌的潛在危險(xiǎn)因素,可作為肺癌預(yù)后判斷的潛在生物標(biāo)志物〔6〕。

A549細(xì)胞中PAPPA表達(dá)水平明顯升高,通過RNA干擾技術(shù)降低PAPPA的表達(dá)來證實(shí)PAPPA的生物學(xué)作用,本研究結(jié)果說明,抑制PAPPA與過表達(dá)miR-195-5p對A549細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的作用相似,miR-195-5p對PAPPA具有負(fù)向調(diào)控作用。PAPPA通過誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)侵襲和遷移從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞倍增及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),miR-195-5p靶向調(diào)節(jié)PAPPA,抑制其表達(dá)。既往研究表明,PAPPA是一種新的間質(zhì)分泌因子,PAPPA高表達(dá)與晚期肝癌密切相關(guān),提示預(yù)后不良〔7〕,miR-599/PAPPA軸還能減弱氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔8〕。與上述報(bào)道相似,本研究結(jié)果提示,PAPPA在肺癌中高表達(dá),并具有促進(jìn)A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)作用,而癌癥轉(zhuǎn)移與細(xì)胞增殖、侵襲及遷移密切相關(guān)〔9〕,是腫瘤預(yù)后較差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔10〕。Targetscan軟件預(yù)測結(jié)果暗示PAPPA與miR-195-5p存在調(diào)控關(guān)系和結(jié)合位點(diǎn),本研究證實(shí)了在肺癌中miR-195-5p和PAPPA之間的調(diào)控關(guān)系。

綜上,miR-195-5p在肺癌中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)miR-195-5p通過抑制PAPPA的表達(dá)從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。