秦洋 倪錦萍 康利 仲志棟 王立仁 尹述洲

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇州九龍醫(yī)院麻醉科,江蘇 蘇州 215021)

遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理(RIPC)是指對(duì)缺血耐受能力強(qiáng)的組織或臟器進(jìn)行短暫的缺血再灌注,以減輕遠(yuǎn)端組織或臟器隨后更嚴(yán)重的缺血損傷〔1〕。研究表明,使用此預(yù)處理的方式可以有效減輕缺血再灌注給大腦、心臟、肝臟及腎臟造成的損傷〔2〕。Przyklenk 等〔3〕發(fā)現(xiàn),當(dāng)發(fā)生冠狀動(dòng)脈缺血再灌注時(shí)對(duì)肢體進(jìn)行短暫、輕微的缺血再灌注處理后,心肌梗死面積顯著減小。RIPC主要通過(guò)改善和維持能量代謝、改善微循環(huán)、減少自由基產(chǎn)生、抑制炎性因子的激活、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)自噬、誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放等途徑對(duì)遠(yuǎn)隔器官起到保護(hù)作用〔4～7〕。

臨床上胸腹主動(dòng)脈瘤手術(shù)可導(dǎo)致暫時(shí)性或永久性的脊髓缺血再灌注(SCIRI) 損傷,其發(fā)生率為3%～20%〔8〕。SCIRI損傷的一個(gè)主要病理改變是血-脊髓屏障的破壞,該屏障系統(tǒng)的破壞導(dǎo)致了神經(jīng)功能的進(jìn)一步損傷。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) 是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員中的一種,主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá),可以起到加強(qiáng)突觸可塑性、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化和維持其正常生理功能起關(guān)鍵作用〔9〕。目前,RIPC 用于防治 SCIRI 的研究鮮有報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)觀察 RIPC 對(duì)兔SCIRI損傷的保護(hù)作用及BDNF表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 日本大耳白兔36只由鼠來(lái)寶實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物批號(hào):SYK2801212,動(dòng)物合格證號(hào):320730200100014125,雄性,3～4月齡,普通級(jí),體質(zhì)量2.2～2.5 kg,普通環(huán)境飼養(yǎng),健康狀況良好,常規(guī)喂養(yǎng)在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心,本實(shí)驗(yàn)所有環(huán)節(jié)均符合3R原則,給予動(dòng)物人道關(guān)懷,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行〔SYXK(蘇)-2017-0043,IACUC-20170706-05〕。

1.2主要試劑 戊巴比妥鈉、青霉素注射試劑(美國(guó)Sigma公司);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)-Px及丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物公司);BDNF、酶切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-9和Cleaved-caspase-3抗體(美國(guó)Abcam公司);BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3 mRNA引物(生工生物工程有限公司)。

1.3儀器 BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);小動(dòng)物專用呼吸機(jī)(DH40B,成都泰盟科技有限公司);常用手術(shù)器械:如手術(shù)剪、精細(xì)眼科剪、止血鉗、中號(hào)及小號(hào)鑷子、持針器、手術(shù)結(jié)扎線、1 ml注射器、眼科開瞼器、擴(kuò)胸器等(上海醫(yī)療器械有限公司)。

1.4動(dòng)物造模及分組 采取隨機(jī)雙盲法將大耳白兔分為假手術(shù)(S)組、SCIRI組及SCIRI+RIPC組各12只。具體方法:①麻醉方法:靜脈推注3%戊巴比妥鈉(1.0 ml/kg)及肌肉松弛劑維庫(kù)溴銨1.0 mg/kg,通過(guò)氣管插管接動(dòng)物呼吸機(jī),調(diào)節(jié)呼吸頻率 30 次/min,吸氣呼氣比為1∶2。維持麻醉采用間斷注射3%戊巴比妥鈉(0.5 ml/kg)和維庫(kù)溴銨(0.5 ml/kg)。其間注意監(jiān)測(cè)血壓和心電圖,注意保暖保持直腸溫度38 ℃。手術(shù)完畢待動(dòng)物清醒后拔除氣管導(dǎo)管,肌內(nèi)注射40萬(wàn)U青霉素,放回原籠飼養(yǎng);②S組僅手術(shù)分離腹主動(dòng)脈;③SCIRI模型建立:沿左豎肌旁縱行切開皮膚,分離腹主動(dòng)脈。在左腎動(dòng)脈下2 cm處用彈性硅膠管阻斷腹主動(dòng)脈血流30 min,使其近心端平均動(dòng)脈壓(MAP)稍有升高,遠(yuǎn)心端MAP降為0 mmHg,然后松開進(jìn)行再灌注。④RIPC組處理方法:用壓迫止血器阻斷右側(cè)股動(dòng)脈近心端5 min;然后松開止血器恢復(fù)血流5 min。重復(fù)以上操作4次(共40 min);SCIRI+RIPC組則需要在夾閉主動(dòng)脈前1 h實(shí)施RIPC。再灌注第5天后,將各組動(dòng)物處死。

1.5后肢神經(jīng)功能評(píng)分 實(shí)驗(yàn)第5天后采用雙盲法由另一名不知道分組情況的人員利用 Tarlov 脊髓損傷改良評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔10〕,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行后肢神經(jīng)功能評(píng)分。分?jǐn)?shù)越高,后肢神經(jīng)功能越好,0～1分:無(wú)自主性活動(dòng),僅限于非反射性的膝、髖關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng);2分:膝、髖和踝關(guān)節(jié)肢體運(yùn)動(dòng);3分:行走時(shí)可主動(dòng)支持體質(zhì)量,不協(xié)調(diào)步態(tài)或偶見協(xié)調(diào)步態(tài),4分:行走時(shí)前后肢協(xié)調(diào)步態(tài),偶見趾關(guān)節(jié)的肢體運(yùn)動(dòng);5分:正常步態(tài)。

1.6脊髓組織病理學(xué)觀察 Tarlov 脊髓損傷改良評(píng)分后處死動(dòng)物,取部分脊髓組織(L4～L5 段),制作蘇木素-伊紅(HE)染色切片72 張(每個(gè)脊髓組織2張),采用雙盲法按Naslund分級(jí)病理?yè)p傷程度評(píng)估脊髓組織的損傷〔11〕。Ⅰ級(jí):正常脊髓或神經(jīng)元偶見少量胞質(zhì)內(nèi)顆粒變性或空泡;Ⅱ級(jí):中等程度核染神經(jīng)元與正常神經(jīng)細(xì)胞之間或缺血性神經(jīng)元可見胞質(zhì)尼氏體丟失、膠質(zhì)細(xì)胞核濃縮并增多;Ⅲ級(jí):大量神經(jīng)元細(xì)胞皺縮,核溶解,髓鞘消腫壞死,膠質(zhì)細(xì)胞增多。

1.7脊髓組織中SOD和GSH-Px活性及MDA含量 硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)脊髓組織中MDA水平,黃嘌呤氧化法檢測(cè)SOD活性,比色法檢測(cè)GSH-Px活性。取L3～L4 段脊髓組織約100 mg 進(jìn)行勻漿,離心后取上清,采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)的活性。

1.8脊髓組織BDNF、Caspase-9和Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平測(cè)定 取L3～L4 段脊髓組織利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測(cè)定BDNF、 Caspase-9和Caspase-3 mRNA 與 GAPDH的相對(duì)表達(dá)量。利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA后再利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度,參照cDNA合成試劑盒法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA再依次檢測(cè)BDNF、Caspase-9和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平,內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。程序:94 ℃、15 s (變性);58 ℃,15 s(退火);72 ℃,15 s(延伸);40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法計(jì)算各組mRNA表達(dá)量?；蛞镄蛄?5′-3′):Caspase-3正向:TAAGCCACGGTGATGA AG,反向:CGGCAAGCCTGAATAATG;Caspase-9正向:GAACTTCAGCAGCACCTC,反向:CATTTCCTTGGCGGTCAG;BDNF正向:GATGAGGACCAGAAGGTTCG,反向:GATTGGGTAGTTCGGCATTG;GAPDH正向:CTCCTGCGACTTCAACAGTG,反向:TGAGGG CTCTTACTCCTTGG。

1.9脊髓組織中BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3蛋白檢測(cè) 取部分脊髓組織(L3～L5段)制作組織勻漿,按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取各組總蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)定量,通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、再濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3(稀釋比例:1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,次日加入二抗稀釋液稀釋后的二抗(稀釋比例:1∶5 000),并在室溫孵育搖床1 h,按照高敏感度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書滴加發(fā)光工作液顯色后,以GAPDH為內(nèi)參,采用ImageJ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組動(dòng)物后肢神經(jīng)功能評(píng)分 實(shí)驗(yàn)于第5天結(jié)束時(shí),SCIRI組后肢神經(jīng)功能評(píng)分(0分2只、1分6只、2分4只)與S組(4分12只)相比明顯降低(Z=1.508、P=0.021);SCIRI+RIPC組的后肢神經(jīng)功能評(píng)分(3分2只、4分10只)與SCIRI組相比增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.916、P=0.055);SCIRI+RIPC組與S組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.360、P=0.999)。

2.2各組脊髓組織病理學(xué)變化 S組脊髓組織表現(xiàn)正常,神經(jīng)元為多角形結(jié)構(gòu),胞核結(jié)構(gòu)清晰,胞質(zhì)中尼氏體存在,分布均勻;與S組相比,SCIRI 組脊髓損傷嚴(yán)重,表現(xiàn)為胞核固縮或溶解,胞質(zhì)呈嗜伊紅染色,胞質(zhì)中尼氏體消失,有的細(xì)胞固縮紅染明顯,可見紅色神經(jīng)元;與SCIRI 組比較,SCIRI+RIPC組脊髓組織病理學(xué)改變明顯改善。見圖1。與S組(Ⅰ級(jí)12只)比較,SCIRI+RIPC組第5天病理切片Naslund分級(jí)結(jié)果(Ⅰ級(jí)11只、Ⅱ級(jí)1只)均無(wú)明顯變化(Z=1.063、P=0.208),而SCIRI組(Ⅱ級(jí)2只、Ⅲ級(jí)10只)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=2.047、P<0.001);與SCIRI組比較,SCIRI+RIPC組顯著改善(Z=1.921、P=0.001)。

圖1 各組脊髓組織病理學(xué)變化(HE染色,×200)

2.3各組脊髓組織中MDA水平及SOD和GSH-Px活性 與S組比較,SCIRI組MDA水平明顯升高,SOD和GSH-Px活性明顯降低(P<0.05);與SCIRI組比較,SCIRI+RIPC組MDA水平明顯降低,SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 3組脊髓組織中SOD、MDA 和 GSH-Px活性比較

2.4各組脊髓組織中BDNF、Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平 與SCIRI組相比,SCIRI+RIPC組脊髓中Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平顯著下降,而BDNF mRNA水平顯著增加(P<0.05);與S組比,SCIRI組脊髓組織中Caspase-9和Caspase-3 mRNA水平顯著升高,而BDNF mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組脊髓組織中BDNF、 Caspase-9和 Caspase-3 mRNA 水平比較

2.5各組脊髓組織中BDNF、Cleaved-caspase-9,Cleaved-caspase-3蛋白水平 與S 組相比,SCIRI組脊髓組織中Cleaved-caspase-9 和 Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),BDNF蛋白水平顯著降低(P<0.05);與SCIRI組相比,SCIRI+RIPC組Cleaved-caspase 9 和 Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)明顯降低,BDNF蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 3組脊髓組織中BDNF、Cleaved-caspase-9,Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

圖2 各組脊髓組織中BDNF、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

在臨床工作中,如實(shí)施主動(dòng)脈縮窄、胸腹主動(dòng)脈瘤、脊柱和骨盆腫瘤等外科手術(shù),為了獲得有利的手術(shù)視野及控制術(shù)中出血,常需阻斷主動(dòng)脈血流。然而阻斷主動(dòng)脈血流超過(guò)一定范圍會(huì)出現(xiàn)SCIRI等并發(fā)癥〔12〕。既往國(guó)內(nèi)外大量醫(yī)務(wù)及科研人員針對(duì)如何有效減少圍術(shù)期SCIRI的發(fā)生開展了許多研究〔13〕,而SCIRI發(fā)病率仍較高〔14〕。因此,研究出新的有效的SCIRI防治手段具有十分重要臨床意義。本研究結(jié)果表明,SCIRI+RIPC組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后肢神經(jīng)功能評(píng)分有改善,而脊髓損傷的病理學(xué)表型明顯減輕;說(shuō)明在日本大耳白兔中,RIPC法對(duì)SCIRI的防治具有明顯作用,提示RIPC的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用具有重要前景。

此外,本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),在SCIRI期間,受損的脊髓組織有明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),產(chǎn)生了過(guò)量的活性氧(ROS),從而導(dǎo)致ROS自由基的大量出現(xiàn)。正常機(jī)體內(nèi)需要適量的ROS,然而過(guò)量的ROS可以引發(fā)一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng)與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),破壞正常DNA結(jié)構(gòu),導(dǎo)致受損區(qū)域出現(xiàn)凋亡或壞死〔15〕。SOD和GSH可以催化組織中ROS,將ROS轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)毒的氧化物或氧氣。彭金亮等〔16〕在探究大鼠腦缺血再灌注時(shí)發(fā)生,模型組大鼠SOD和GSH水平顯著降低,MDA含量顯著升高,從而對(duì)大腦造成氧化應(yīng)激損傷。劉溪等〔17〕對(duì)缺血性腦卒中大鼠腦組織研究發(fā)現(xiàn),腦卒中大鼠腦內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)和SOD活性顯著降低。因此,增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中SOD和GSH的活性,減少M(fèi)DA產(chǎn)生可達(dá)到防治神經(jīng)元受損,起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。本研究說(shuō)明,RIPC可以減輕腦組織內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生,從而發(fā)揮對(duì)大腦的保護(hù)作用。

BDNF是一類廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)與功能調(diào)節(jié)發(fā)揮著巨大的作用〔18〕。在腦缺血模型中,BDNF可通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、提高蛋白激酶活性、減輕自由基損傷等作用延緩神經(jīng)元壞死和凋亡,從而發(fā)揮保護(hù)作用〔19〕。Ziemlińska等〔20〕在脊髓橫斷的大鼠模型中發(fā)現(xiàn),BDNF可通過(guò)增加谷氨酸能和氨基丁酸能的神經(jīng)傳遞促進(jìn)早期運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,RIPC可減輕SCIRI所導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙,有利于運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。相關(guān)研究顯示,細(xì)胞凋亡在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著重要作用,如阿爾茨海默病和帕金森病、腦缺血再灌注等細(xì)胞凋亡主要受Caspase家族蛋白調(diào)節(jié)。Caspase-3和Caspase-9均為促凋亡基因,正常情況下,無(wú)活性的Caspase-3、Caspase-9受到凋亡信號(hào)激活,導(dǎo)致DNA裂解,誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔21〕。李曉楠等〔22〕探究血管性癡呆大鼠發(fā)病機(jī)制中發(fā)現(xiàn),BDNF水平的降低導(dǎo)致Caspase-3、Caspase-9激活,從而導(dǎo)致腦組織發(fā)生凋亡,提示BDNF可介導(dǎo)Caspase家族蛋白。李雪蓮〔23〕對(duì)小鼠黑紋狀體系統(tǒng)損傷實(shí)驗(yàn)中也有相似的發(fā)現(xiàn),即BDNF可介導(dǎo)Caspase家族蛋白。本研究表明,SCIRI兔脊髓內(nèi)存在損傷,凋亡細(xì)胞增加,但RIPC后,兔SCIRI脊髓組織中Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9表達(dá)顯著降低,提示RIPC可以減輕脊髓損傷,起到相應(yīng)的保護(hù)作用。

本研究說(shuō)明,RIPC對(duì)SCIRI起到一定的保護(hù)作用,其可能原因是通過(guò)激活內(nèi)源性BDNF表達(dá)水平的增加,降低凋亡因子的產(chǎn)生從而抑制神經(jīng)元凋亡發(fā)揮相關(guān)保護(hù)作用。本研究主要在動(dòng)物模型上對(duì)BDNF的表達(dá)量進(jìn)行研究,但BDNF在基因及mRNA水平的表達(dá)量變化有待進(jìn)一步研究。另外,本實(shí)驗(yàn)可能為SCIRI的治療提供一種新的治療思路,而BDNF在其中如何發(fā)揮作用,其具體作用的靶點(diǎn)及通路尚需進(jìn)一步深入研究。