宋洪寧 崔碩 雷印濤 劉敏

(山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔頜面外科,山東 泰安 271000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)在機(jī)體惡性腫瘤中排名第6,男女中發(fā)病率均較高,據(jù)統(tǒng)計(jì),每年新發(fā)病例超過50萬〔1〕,且病例數(shù)量有逐年增加的態(tài)勢(shì),發(fā)病年齡也更傾向青壯年,OSCC特點(diǎn)顯著,具備較強(qiáng)的周圍區(qū)域的侵犯性,相關(guān)引流區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也較高,短期愈合率較低,目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制及深層次干擾因素仍缺乏了解,因此進(jìn)一步研究其分子調(diào)控機(jī)制,尋找新的腫瘤標(biāo)志物,有利于腫瘤發(fā)生前期的確認(rèn),便于盡早醫(yī)學(xué)干涉,對(duì)于OSCC患者,大大提高其治愈率,對(duì)預(yù)后改進(jìn)意義重大。微小RNA(miRNA)被歸納為一類不可或缺的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,幾乎介入了細(xì)胞體所有生存活動(dòng),不論是細(xì)胞族群的壯大、細(xì)胞向不同方向的演化、細(xì)胞的湮滅,還是構(gòu)筑血管、腫瘤的變化演進(jìn)及遠(yuǎn)處播散等,近年均受到廣泛關(guān)注并成為研究熱點(diǎn),對(duì)其和OSCC間的研究也越來越多,從表達(dá)研究到對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,從醫(yī)療遴選探索到早期檢測(cè)〔2〕,進(jìn)一步揭示其內(nèi)涵機(jī)制,能為OSCC的鑒別甄選、極富針對(duì)性的靶向手段、疾病演化進(jìn)展等在學(xué)術(shù)上予以支持。miR-196a是miRNA中的重要成員,由同源異形盒基因家族(HOX)基因座轉(zhuǎn)錄而來,其在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)〔3〕,且這種高表達(dá)與淋巴結(jié)受侵犯范圍和相關(guān)疾病的分期存在密切關(guān)系,此外,瘤體細(xì)胞產(chǎn)生的對(duì)化療藥物的某些不敏感現(xiàn)象也與其有關(guān)系。本文通過分析HOK和SCC9細(xì)胞中miR-196a的表達(dá)情況、抑制miR-196a表達(dá)對(duì)SCC9細(xì)胞增殖、侵襲功能的影響,研究其與OSCC的關(guān)系,同時(shí)分析其是否通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路發(fā)揮作用,為了解miR-196a機(jī)制,開發(fā)安全有效的OSCC新型靶向針對(duì)性方法開拓新思路。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本、試劑和儀器 正常人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞(HOK)和OSCC細(xì)胞系(SCC)9由泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、蛋白裂解液放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、噻唑藍(lán)染色法(MTT)-8試劑盒均購自江蘇碧云天公司,胰蛋白酶、LipofectaminTM2000、DNA聚合酶和Trizol Reagent 來源于Invitrogen(美國),SYBR Premix Ex Taq、Prime Script RT相關(guān)產(chǎn)品Takara(日本),miR-196a、U6和miR-196a inhibitor、miR-196a inhibitor NC源自銳博(中國廣州),Transwell小室購自Corning(美國),PI3K抗體(cat.no.4257)、p-PI3K抗體(cat.no.17366)、AKT抗體(cat.no.9272)、p-AKT抗體(cat.no.9611)、FOXO1抗體(cat.no.2880)和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology(美國),Roche 480 Real-time PCR儀購自Thermo Fisher(美國),WB電泳裝置、轉(zhuǎn)膜儀和成像儀源自Bio-Rad(美國)。

1.2HOK、SCC9細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HOK和SCC9細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基(成分是10%胎牛血清)進(jìn)行繁育,相關(guān)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境設(shè)定為溫度37 ℃、CO2濃度5%,期間采用倒置顯微鏡進(jìn)行檢查,分析細(xì)胞狀態(tài),規(guī)定是1～2 d換液一次,以保證細(xì)胞的良好生存條件,當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)80%時(shí),滴入胰酶〔內(nèi)有乙二胺四乙酸(EDTA)〕進(jìn)行消化分解,并進(jìn)一步傳代繁育,在后續(xù)研究步驟需遴選情況良好的細(xì)胞進(jìn)行。將miR-196a inhibitor引入至SCC9,實(shí)驗(yàn)分為Control、Inhibitor NC、miR-196a inhibitor 3組,依據(jù)“LipofectamineTM2000”相關(guān)產(chǎn)品介紹執(zhí)行實(shí)驗(yàn)程序。

1.3qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析計(jì)算miR-196a的表達(dá)水平 嚴(yán)格遵循Triozol RNA分離試劑盒的產(chǎn)品使用介紹分離HOK、SCC9細(xì)胞的RNA,使用微量分光光度計(jì)度量RNA的濃度和純度,A260/A280數(shù)值大小作為RNA溶液是否符合相應(yīng)純度標(biāo)準(zhǔn)的參考,該數(shù)值限定于1.8～2.1之間較為理想。引物序列:miR-196a正義:5′-CTGGAGTAGGTAGTTTC-ATGTTG-3′,miR-196a反義:5′-GTGCAGGGTCCG-AGGT-3′,U6正義:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,U6反義:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采取“SYBR? Green策略”反轉(zhuǎn)錄,獲取cDNA,接著采用“SYBR ? Premix Ex Taq TMⅡ”完成后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)步驟,冰上配制PCR相關(guān)作用溶液,采用兩個(gè)階段的步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增,基本順序?yàn)?預(yù)變性:95 ℃,30 s(1個(gè)循環(huán)),PCR:95 ℃,5 s 60 ℃,30 s(40個(gè)循環(huán)),循環(huán)結(jié)束后,設(shè)置溫度從60 ℃升高到95 ℃獲取熔解曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析出兩種基因的相對(duì)表達(dá)量(miR-196a和內(nèi)參U6),最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果是通過2-△△Ct公式建立。

1.4MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況 用胰蛋白酶(濃度為0.25%)處理分解,每個(gè)孔中添入等體積量完全培養(yǎng)基(即不添加血清及抗生素),對(duì)胞體進(jìn)行再次懸浮,取0.1 ml到96孔板中,控制細(xì)胞密度約2 000個(gè)/孔,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔;測(cè)定時(shí)間點(diǎn)為轉(zhuǎn)染后0 h,12 h,24 h,48 h。將MTT試劑(10 μl)加入各孔中,并在 37 ℃下再孵育4 h。洗去上清液,用二甲基亞砜(DMSO)溶解晶體。接著將吸光度值標(biāo)定在490 nm條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力 將24孔板置入Transwell室內(nèi),牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行重懸操作,控制其密度大約為1×104個(gè)/ml,將300 μl細(xì)胞懸液加入遷移小室后接著在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)48 h,膜底以冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,再選4%甲醛進(jìn)行穩(wěn)態(tài),室溫0.5 h,而后滴入0.1%紫羅蘭作用10 min;對(duì)標(biāo)記出的圖像進(jìn)行采集,接著通過軟件統(tǒng)計(jì)分析其中穿過室膜細(xì)胞數(shù)量。

1.6Western印跡分析計(jì)算轉(zhuǎn)染后4種蛋白數(shù)值情況 細(xì)胞遴選處于對(duì)數(shù)繁殖狀態(tài),轉(zhuǎn)染操作經(jīng)歷24 h,混合RIPA、部分蛋白酶抑制劑、蛋白酶抑制劑(DMSF)并進(jìn)行消融,取50 μg蛋白提取物進(jìn)行10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)實(shí)驗(yàn),后續(xù)把蛋白遷移至硝酸纖維素膜,用三乙醇胺緩沖鹽溶液稀釋(TBS)配制5%脫脂奶粉,封閉處理60 min,然后將依固定百分比稀釋一抗(1∶500)和磷酸甘油醛脫氨酶(GAPDH)一抗(1∶1 000)混合其中,4 ℃孵育一晚,三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽液(TBST)處理3次再混合二抗(1∶10 000),室溫放置1 h,后續(xù)ECL顯影曝光拍照,用ImageJ測(cè)量灰度值,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),數(shù)值用蛋白/GAPDH計(jì)算,該比值即代表蛋白水平。

1.7采用生物信息學(xué)、Western印跡方法預(yù)測(cè)分析靶標(biāo)蛋白FOXO1 采用最常用的生物信息學(xué)在線軟件TargetScan,版本7.1,通過聯(lián)網(wǎng)(www.targetscan.org/vert_71)查詢miR-196a與FOXO1之間可能存在的靶標(biāo)關(guān)系結(jié)合位點(diǎn);Western印跡方法分析轉(zhuǎn)染后FOXO1、p-FOXO1蛋白表達(dá)情況,步驟同前。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行配對(duì)樣本t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-196a在HOK和SCC9細(xì)胞中的表達(dá) 應(yīng)用qRT-PCR分析計(jì)算miR-196a于兩種細(xì)胞內(nèi)情況,熔解曲線呈單峰,擴(kuò)增產(chǎn)物純度佳,無二聚體形成,與HOK(1.015±0.041)相比,SCC9 miR-196a 相對(duì)表達(dá)量(1.729±0.085)顯著升高,說明在SCC9內(nèi)其數(shù)值水平顯著大于HOK(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-196a及U6基因qRT-PCR擴(kuò)增、熔解曲線

2.2qRT-PCR分析計(jì)算轉(zhuǎn)染后miR-196a的表達(dá)量 與control組、inhibitor-NC組相比,miR-196a inhibitor組miR-196a表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 3組轉(zhuǎn)染后miR-196a表達(dá)及MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力

2.3MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況 與control組和inhibitor-NC組相比,miR-196a inhibitor組在轉(zhuǎn)染0 h、12 h、24 h細(xì)胞增殖能力無明顯改變(P>0.05);轉(zhuǎn)染后48 h,miR-196a inhibitor組細(xì)胞增殖能力顯著下降,提示抑制miR-196a的表達(dá)能顯著降低SCC9細(xì)胞的增殖能力,且在轉(zhuǎn)染48 h后較為顯著(P<0.05)。見表1。

2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力 24 h后,與control組、inhibitor-NC組比較,miR-196a inhibitor組SCC9細(xì)胞侵襲能力顯著下降(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 3組細(xì)胞中4種蛋白、24 h后SCC9細(xì)胞侵入下室數(shù)目

圖2 3組Transwell 24 h細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色,×100)

2.5Western印跡分析計(jì)算轉(zhuǎn)染后蛋白數(shù)值 與control組、inhibitor-NC組相比,miR-196a inhibitor組p-AKT、p-PI3K明顯下降(P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)3組細(xì)胞AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)

2.6采用生物信息學(xué)、Western印跡預(yù)測(cè)分析靶標(biāo)蛋白FOXO1 根據(jù)TargetScan7.1給出的數(shù)據(jù)結(jié)果,經(jīng)過分析,可知在FOXO1的3′UTR處存在與miR-196a相結(jié)合的位點(diǎn),miR-196a inhibitor組FOXO1、p-FOXO1相對(duì)表達(dá)量(2.560±0.009、0.407±0.046)與inhibitor-NC組(0.622±0.013、2.137±0.366)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

(A)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)FOXO1為miR-196a的靶基因;(B)3組細(xì)胞中FOXO1、p-FOXO1蛋白電泳

3 討 論

OSCC在我國的口腔惡性腫瘤中的發(fā)生可能性高,該疾病初期就表現(xiàn)較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力,容易導(dǎo)致術(shù)后瘤體的再生長,意味著疾病治療的失敗,且對(duì)OSCC晚期患者,外科的介入和放化療都很難有效改良生存曲線,對(duì)其以后生活影響頗大。因此,早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高病人預(yù)后最好的手段,臨床中迫切需要尋找一種合適的腫瘤標(biāo)志物,這對(duì)于該種疾病的甄別、醫(yī)治、預(yù)后及能否最大程度恢復(fù)生活水平均有影響。

miRNA作為一種具有18～22個(gè)長度值核苷酸的RNA,現(xiàn)被劃為小內(nèi)源性非編碼,主要是借助于調(diào)控對(duì)應(yīng)靶向基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。采集原發(fā)于胃的惡性腫瘤病例中發(fā)現(xiàn),miR-196a和轉(zhuǎn)移存在正相關(guān),提示其在該疾病的原位進(jìn)展及遠(yuǎn)處播散中或許是角色關(guān)鍵原因〔4～6〕,通過對(duì)血液中miR-196a分析檢測(cè)得出結(jié)論,其可能影響胃部惡性腫瘤患者的后期輔助性藥物治療效果,并且與預(yù)后聯(lián)系緊密,miR-196a極有希望被定義為一種分子層面的標(biāo)志物,發(fā)揮胃癌的早期甄別及預(yù)后提示作用〔7〕;另據(jù)在食管癌的調(diào)查取樣分析,miR-196a表達(dá)異常升高出現(xiàn)于多個(gè)該類腫瘤分型中,不但限于腺癌,甚至體現(xiàn)在Barrett食管病灶中,非正常發(fā)育的病例中亦有體現(xiàn),且這種升高水平和非正常程度存在某種正相關(guān)性,更深層次揭示miR-196a成為關(guān)鍵原因的可能,指示相關(guān)疾病衍化成食管類惡性腫瘤的時(shí)間節(jié)點(diǎn),為監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)程提供可靠依據(jù)〔8〕,且miR-196a基于此介入食管癌進(jìn)程,從早期指示到后期愈合,其檢測(cè)指標(biāo)聯(lián)結(jié)疾病預(yù)后,在食管癌生存曲線中成為新的評(píng)價(jià)信號(hào)〔9〕;在結(jié)直腸癌病種分析發(fā)現(xiàn),miR-196a同樣出現(xiàn)表達(dá)數(shù)值的異常性,較周圍正常組織,其數(shù)值量明顯提升,且這種提升和腫瘤的多種臨床特征呈現(xiàn)相關(guān)性,如引流區(qū)域的淋巴結(jié)是否侵及,外圍器官是否受累,對(duì)于正確劃分其分期意義重大,miR-196a亦定義為結(jié)腸癌重要的篩選早期病例及判定遠(yuǎn)期治療效果的標(biāo)志物,為該種疾病基因?qū)用娴姆治鲋委熖峁┛煽堪悬c(diǎn)〔10〕;Liu等〔3〕通過研究宮頸惡性腫瘤,對(duì)選取的病例進(jìn)行相關(guān)血液分析,發(fā)現(xiàn)miR-196a數(shù)值異常上調(diào),這種上調(diào)并非無序性,而是緊緊圍繞該型腫瘤的相關(guān)醫(yī)學(xué)分期,惡性程度層次、周圍淋巴結(jié)浸潤與否展開,最終得出其能誘導(dǎo)相關(guān)腫瘤進(jìn)展,并刺激癌轉(zhuǎn)移〔11〕,整體起到促癌效應(yīng)。

miR-196a與口腔惡性腫瘤的關(guān)系同樣密切,其在頭頸部鱗癌中可能發(fā)揮促癌作用,影響腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和黏附力,頭頸部鱗癌初期的病例中,其miR-196a整體數(shù)值明顯升高,這種升高程度在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LNM)的病例中尤為顯著,miR-196a這種數(shù)值的異常情況,跟病例的臨床生命周期緊密聯(lián)系,并且miR-196a表達(dá)量與患者生存率相關(guān)〔12〕,通過分析血液并提取miR-196a進(jìn)行檢測(cè),使其可以作為有效腫瘤標(biāo)志物,用于早期診斷〔13〕。這些研究揭示,miR-196a在口腔腫瘤發(fā)揮的促癌作用,并與細(xì)胞行為存在聯(lián)系,參與影響腫瘤轉(zhuǎn)移,并能側(cè)面反映預(yù)后情況,與口腔腫瘤分期密切相關(guān),但對(duì)于其如何發(fā)揮作用仍需要不斷探究。總體而言,miR-196a數(shù)值的升高表現(xiàn)在不同類別的惡性瘤體中,主要發(fā)揮誘導(dǎo)癌發(fā)生發(fā)展的效能,借助血清檢測(cè)手段,提取分析miR-196a數(shù)值,以捕獲相關(guān)疾病初期的窗口,并能協(xié)助分析疾病的轉(zhuǎn)歸并判定預(yù)后,目前關(guān)于miR-196a的關(guān)系脈絡(luò)挖掘還處于初期階段,不論是基本生命活動(dòng)特性還是相關(guān)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系內(nèi)容仍需深入探索。

PI3K/AKT信號(hào)通路介入?yún)⑴c大量復(fù)雜的生理活動(dòng),影響包括細(xì)胞族群的壯大生存、不同方向的演變、相關(guān)血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、更新?lián)Q代等,在腫瘤中PI3K/AKT可能起到控制器的作用,進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)展,其異常激活在腫瘤的演變及化學(xué)藥物抵抗方面十分重要,PI3K/AKT信號(hào)途徑的異常失調(diào)性在腫瘤中可以說是普遍存在,與腫瘤的圖譜均有關(guān)聯(lián)〔14,15〕。通過研究小腸腺癌〔16〕,發(fā)現(xiàn)其中PI3K/AKT信號(hào)途徑有明顯被激活的跡象,該信號(hào)或許能被定義成另一種醫(yī)學(xué)解決手段。通過對(duì)膽管上皮癌患者進(jìn)行分析〔17〕,發(fā)現(xiàn)其中PI3K/AKT信號(hào)同樣存在異常表現(xiàn),加入該相關(guān)通路的減活成分可以有效阻礙此類疾病上皮癌細(xì)胞繁殖和遷演。研究分析子宮內(nèi)膜癌患者〔18〕,得出AKT磷酸水平、磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)的沉默,都與該疾病的出現(xiàn)相關(guān),該疾病患者在伴有PTEN非陽性變化、AKT磷酸程度加深情況下,其恢復(fù)愈合更加困難,生命周期明顯縮短,PTEN/AKT兩者比值大小可以成為標(biāo)定子宮內(nèi)膜癌愈合恢復(fù)程度的關(guān)鍵指標(biāo),相應(yīng)磷酸化程度高低和該類腫瘤臨床發(fā)展級(jí)別、組織層面類別、鄰近肌肉受侵犯程度、遠(yuǎn)位引流區(qū)淋巴結(jié)浸潤聯(lián)系廣泛。除上述腫瘤,其在白血病〔19〕、胃癌〔20〕、肝癌〔21〕等各種腫瘤內(nèi)都出現(xiàn)異常活化,PI3K/AKT主要通過誘使激活A(yù)KT的活化進(jìn)而作用于下游分子發(fā)揮作用,活化后AKT具備同時(shí)節(jié)制大量參加細(xì)胞凋亡進(jìn)程的分子。

FOXO是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子大家族最重要的一個(gè)亞群,Forkhead廣泛存在于真核細(xì)胞生物中,在哺乳動(dòng)物中FOXO有4種亞型:FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6〔22〕,其中FOXO1是最早發(fā)現(xiàn)的成員,分布廣泛,幾乎遍布各組織器官,許多關(guān)鍵細(xì)胞功能均受其調(diào)控,影響細(xì)胞基本生命過程,是一種明確的抑癌基因,表達(dá)缺失或下降將激活啟動(dòng)腫瘤惡性進(jìn)程,其在多種惡性腫瘤中低表達(dá),并與腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)〔23〕,FOXO1與口腔腫瘤的關(guān)系亦十分密切,Chan等〔24〕分析30例口腔癌組織標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)FOXO1表達(dá)相比于正常組織明顯下降,并發(fā)現(xiàn)HMG盒轉(zhuǎn)錄因子(HBP)1是FOXO1的直接下游轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。Huang等〔25〕發(fā)現(xiàn),槲皮素是一種有效的抗腫瘤因子,而在表皮生長因子受體(EGFR)過表達(dá)的口腔癌中,槲皮素通過FOXO1發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。FOXO1又是PI3K/AKT的下游信號(hào),PI3K/AKT通路的激活具有促癌作用,FOXO1是這條通路中的關(guān)鍵一環(huán),FOXO1受其負(fù)性調(diào)控〔26〕,若PI3K/AKT通路上調(diào),相關(guān)蛋白量和磷酸化水平均上調(diào),其磷酸化FOXO1能力增強(qiáng),磷酸化FOXO1的量越高,與血管生成存在聯(lián)系的分子含量亦越高,pFOXO1可利于癌血管網(wǎng)構(gòu)建,AKT通路的激活及FOXO1的磷酸化可以作為癌變傾向的早期生物學(xué)標(biāo)志物〔27〕。