張悅東 孫平平 李小燕 楊榮 王寶俠 張磊 李正男

摘要：【目的】明確通遼地區(qū)塞外紅蘋果（Malus pumila‘Saiwaihong）中蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）、蘋果莖痘病毒（ASPV）和蘋果莖溝病毒（ASGV）3 種蘋果潛隱病毒的普遍率和遺傳多樣性。【方法】從通遼市開魯縣8 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)隨機采集了96 份塞外紅蘋果枝條，采用RT-PCR法對樣品進(jìn)行3 種蘋果潛隱病毒檢測。對檢測為陽性的樣品進(jìn)行病毒基因克隆、測序，并進(jìn)行序列一致性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析?！窘Y(jié)果】檢測結(jié)果表明，被檢測的塞外紅蘋果中3 種蘋果潛隱病毒均有不同程度的發(fā)生，并且存在2 種或3 種病毒的復(fù)合侵染?；贑P基因?qū)Σ《疽恢滦院妥儺惽闆r進(jìn)行分析，結(jié)果表明，來源于塞外紅蘋果的29 個ACLSV分離物的核苷酸序列一致性為78.1%～99.9%，與其他15 個已知的ACLSV分離物的一致性為69.1%～93.6%；來源于塞外紅蘋果的12 個ASPV分離物的核苷酸序列一致性為83.6%～99.7%，與其他15個已知的ASPV 分離物的一致性為75.4%～91.5%；來源于塞外紅蘋果的21 個ASGV分離物的核苷酸序列一致性為96.4%～100.0%，與其他已知的40 個ASGV分離物的一致性為89.9%～98.9%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，44 個ACLSV分離物聚集在7 個主支，其中29 個塞外紅蘋果的ACLSV分離物分別位于JB 組、Balatonl 組、B6 組和一個獨立分支；27 個ASPV分離物聚集為6 支，其中12 個塞外紅蘋果的ASPV分離物分別位于Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ組；61 個ASGV分離物聚集為8 個支，其中塞外紅蘋果的21 個ASGV分離物聚集在一起，形成獨立分支?！窘Y(jié)論】ACLSV、ASGV、ASPV均能侵染塞外紅蘋果，并且發(fā)生率較高。與其他來源的病毒相比，塞外紅蘋果的3 種病毒分離物，各種內(nèi)各分離物彼此之間的序列一致性較好并且進(jìn)化關(guān)系較近。研究結(jié)果為塞外紅蘋果產(chǎn)業(yè)綠色、健康、持續(xù)發(fā)展提供基本理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：塞外紅蘋果；RT-PCR；蘋果褪綠葉斑病毒；蘋果莖痘病毒；蘋果莖溝病毒

中圖分類號：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）05-0978-10

塞外紅蘋果又名雞心果，是由通遼市林業(yè)和草原科學(xué)研究所王寶俠研究員團隊歷經(jīng)20多年自主選育出的小蘋果新品種，是內(nèi)蒙古自治區(qū)首個通過中國森林認(rèn)證的經(jīng)濟林樹種。因為塞外紅蘋果具有適應(yīng)性強、豐產(chǎn)性好、抗逆性強、果實色澤艷麗、口味香甜、耐貯藏等特性，已經(jīng)發(fā)展成為內(nèi)蒙古自治區(qū)種植面積最大的蘋果品種之一。目前，在內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市種植面積約為2 萬hm2，成為當(dāng)?shù)毓r(nóng)的主要收入來源。另外，在遼寧、河北、山東、甘肅等省也有引種。

蘋果褪綠葉斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）、蘋果莖痘病毒（apple stem pitting virus，ASPV）和蘋果莖溝病毒（apple stem grooving virus，ASGV）是蘋果上發(fā)生率最高的3 種病毒，在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生[1]。1959 年，Mink 等[2]等首次報道了蘋果上發(fā)生ACLSV。隨后發(fā)現(xiàn)ACLSV還侵染梨、桃、山楂等果樹[3-5]。1954 年，Smith[6]在出現(xiàn)莖痘斑和壞死癥狀的蘋果砧木上發(fā)現(xiàn)了ASPV，近年發(fā)現(xiàn)ASPV 在梨、山楂、櫻桃、枇杷等果樹上都會發(fā)生[7-9]。Lister 等[10]于1965 年最先在蘋果上發(fā)現(xiàn)ASGV，伴隨著RT-PCR和siRNA 高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，ASGV的寄主范圍從薔薇科果樹上擴展到百合、月季、竹等觀賞植物[11-14]。這3 種蘋果病毒單獨侵染時，在大多數(shù)商業(yè)蘋果品種上不引起明顯癥狀，但復(fù)合侵染時可以引起蘋果樹“高接病”、樹勢衰退、果實畸形、皺縮等，是蘋果無病毒苗木生產(chǎn)中需要脫除的對象。伴隨著塞外紅蘋果種植面積的不斷擴大，病毒侵染導(dǎo)致蘋果品質(zhì)下降已成為制約塞外紅蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，開展3 種病毒的檢測和分子變異研究，對塞外紅蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要意義，也將為無病毒苗木生產(chǎn)提供指導(dǎo)數(shù)據(jù)。

筆者在本研究中采用RT-PCR對采自內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市8 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的96份塞外紅蘋果樣品進(jìn)行了檢測及分析，明確了通遼市塞外紅蘋果中3 種蘋果潛隱病毒的發(fā)生情況和遺傳多樣性。

1 材料和方法

1.1 供試材料

2021 年2 月25 日在開魯縣的開魯鎮(zhèn)、大榆樹鎮(zhèn)、建華鎮(zhèn)、小街基鎮(zhèn)、東風(fēng)鎮(zhèn)、東來鎮(zhèn)、麥新鎮(zhèn)、吉日嘎郎吐鎮(zhèn)等8 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集了96 份塞外紅蘋果枝條樣品（每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)隨機采集12 份），選擇15～20 cm長的一年生枝條，用石蠟封口，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及實驗儀器

1.2.1 主要試劑 TaKaRa MiniBEST plant RNAExtraction Kit[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]、PrimeScript? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]、M5 超光速mix（北京聚合美生物科技有限公司）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]、零背景pTOPO-TA克隆試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）、E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]等；具體實驗操作步驟根據(jù)試劑盒說明書完成。

1.2.2 主要實驗儀器 生工Sangon Biotech 臺式高速微量離心機（Hico21）、電子天平、海爾醫(yī)用低溫保存箱、Scllogex sloloe 離心機、渦輪振蕩機、臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜、恒溫水浴鍋、微波爐、Allsheng 微量分光光度計（Nano-300）、微型渦旋混合儀、流水式制冰機、電熱恒溫培養(yǎng)箱、BIO-RAD Thermal Cycler、移液槍、DLAB數(shù)顯恒溫金屬浴。

1.3 方法

1.3.1 植物總RNA 提取 按照TaKaRa MiniBESTplant RNA Extraction Kit 說明書步驟，從植物枝條中提取總RNA。得到的總RNA使用Allsheng 微量分光光度計（Nano-300）進(jìn)行濃度和純度的測定。存放于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈 以提取的樣品總RNA 為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，過程如下：1 μL 隨機引物（50 μmoL · L- 1）、1 μL dNTP（10 mmoL·L-1）、1.5 μL模板RNA、6.5 μL無酶水，將反應(yīng)液放入PCR儀內(nèi)65 ℃ 5 min；冰上迅速冷卻后繼續(xù)加入4 μL 5 × PrimeScript Ⅱ Buffer、0.5 μLRNase Inhibitor（40 U · μL- 1）、1 μL PrimeScript Ⅱ RTase（200 U·μL-1）、4.5 μL無酶水。將上述20 μL反應(yīng)液輕輕混勻，放入PCR 儀內(nèi)42 ℃ 30 min、70 ℃15 min后，取出冷卻。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以在-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 病毒基因組克隆 （1）引物設(shè)計。根據(jù)NCBI的GenBank 數(shù)據(jù)庫中存儲的ACLSV、ASGV、ASPV基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計了3 對病毒檢測引物（表1）。ACLSV1-F/R 用于擴增ACLSV 的部分復(fù)制蛋白和部分移動蛋白基因；ASPV1-F/R用于擴增ASPV的部分外殼蛋白基因和3非編碼區(qū)；ASGV1-F/R 用于擴增ASGV的部分移動蛋白和外殼蛋白基因。

（2）病毒基因片段擴增。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，使用2×M5 Hiper 超光速mix 分別擴增ACLSV、ASPV、ASGV 基因片段。擴增體系如下：10 μL 2×M5 Hipor 超光速mix、1 μL 上游引物、1 μL下游引物、5 μL cDNA、3 μL 無酶水。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，35 次循環(huán)：94 ℃變性25 s、退火25 s（ACLSV 61 ℃ ，ASPV 58 ℃ ，ASGV 58 ℃）、72 ℃延伸（ACLSV 60 s，ASPV 30 s，ASGV 30 s），72 ℃補平5 min。

（3）PCR 產(chǎn)物的純化、克隆及序列測定。將檢測到的ACLSV、ASGV、ASPV 目標(biāo)片段純化回收，純化后的PCR產(chǎn)物用pTOPO-TA試劑盒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞并涂板。對培養(yǎng)出來的單個菌落進(jìn)行PCR 菌液鑒定。每個樣品隨機挑選3 個陽性克隆菌液送華大基因公司進(jìn)行測序。

1.3.4 序列一致性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析。運用軟件Vector NTI Advance 11（Invitrogen Corporation，CA，USA）對測序結(jié)果進(jìn)行分析和拼接；使用SDT 軟件CLE序列比對程序?qū)y序基因序列與參考基因序列進(jìn)行兩兩比對，參考序列均從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫下載[15]。用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，處理序列采用ClustalW 算法進(jìn)行比對，選用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展校正值為1000，其他均為軟件默認(rèn)值[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的檢出率

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，96 份塞外紅蘋果枝條樣品中，有29 份樣品攜帶ACLSV，檢出率為30.2%；有12 份樣品攜帶ASPV，檢出率為12.5%；有21 份樣品攜帶ASGV，檢出率為22.0%。通過對每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的病毒檢出率比較，ACLSV檢出率最高的地區(qū)在開魯縣開魯鎮(zhèn)，為66.7%；ASPV 檢出率最高的地區(qū)在開魯縣東風(fēng)鎮(zhèn)，為41.7%；ASGV檢出率最高的地區(qū)在開魯縣開魯鎮(zhèn)，為58.3%（表2）。在所采集的96份塞外紅蘋果枝條樣品中，有4份樣品同時攜帶ACLSV、ASPV 和ASGV，檢出率為4.2%；有4 份樣品同時攜帶ACLSV和ASPV，檢出率為4.2%；有13 份樣品同時攜帶ACLSV和ASGV，檢出率為13.5%；有3 份樣品同時攜帶ASPV和ASGV，檢出率為3.1%（表3）。

2.2 序列一致性分析

筆者在本研究中共獲得29 個來源于塞外紅蘋果的ACLSV 分離物（GenBank 登錄號：ON001687～ON001715），核苷酸序列一致性為78.1%～99.9%，其中ACLSV Kailu4-8（ON001702）與Kailu5-1（ON001704）的核苷酸序列一致性最高，為99.9%；Kailu3- 12（ON001699）與Kailu7-10（ON001713）之間的核苷酸序列一致性最低，為78.1%。該29個分離物與其他15個已知的ACLSV分離物的核苷酸序列一致性為69.1%～93.6%，其中分離物Kailu7-10（ON001713）與來源于中國蘋果的分離物XC-HF（MF678819）核苷酸序列一致性最高（93.6%）；分離物Kailu1-5（ON001689）與美國桃分離物Ta Tao 5（EU223295）核苷酸序列一致性最低（69.1%）（圖1）。根據(jù)擴增得到的部分復(fù)制蛋白和移動蛋白基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，44 個ACLSV 分離物聚集在7 個分支，即JB、MO-5、Balatonl、P863、組1、B6、Ta Tao 5（圖2）。來源于塞外紅蘋果的部分ACLSV分離物（ON001687～689、ON001692、ON001700～704、ON001706～708、ON001713～715）位于JB 組，與中國山楂分離物SY03 （KU870525） 、蘋果分離物XC- HF（MF678819）、梨分離物KMS、YH、JB（KC935954、KC935955、KC935956）聚為一支；分離物Kailu3-12（ON001699）與法國櫻桃分離物Balaton1（X99752）聚為一支，位于Balatonl 組；分離物Kailu6-9、Kailu5-11（ON001709、ON001705）單獨形成一個分支，位于1 組；其他的分離物（ON001690～691、ON001693～698、ON001710～712）位于B6 組，與日本蘋果分離物QD- 13（KJ522693）、中國蘋果分離物MS（KC847061）聚為一支。外參為櫻桃斑駁葉病毒（cherry mottle leaf virus，CMLV）（NC-002500）。

筆者在本研究中共獲得12 個來源于塞外紅蘋果的ASPV 分離物（GenBank 登錄號：OL953372～OL953383），這12 個分離物間核苷酸序列一致性為83.6%～99.7%，其中來源于塞外紅的ASPV 分離物Kailu2-9（OL953373）與Kailu7-12（OL953382）的核苷酸序列一致性最高（99.7%）；分離物Kailu2- 9（OL953373）、Kailu7- 6（OL953380）與Kailu8- 1（OL953383）之間的核苷酸序列一致性最低（83.6%）。該12 個ASPV分離物與其他15 個已知的ASPV分離物的核苷酸序列一致性為75.4%～91.5%，其中ASPV 分離物Kailu7-12（OL953382）與加拿大蘋果分離物Aurora-1（HE963831）的核苷酸序列一致性最高（91.5% ）；ASPV 分離物Kailu7- 6（OL953380）與中國梨ASPV 分離物PR1（EU095327）的核苷酸序列一致性最低（75.4%）（圖3）。根據(jù)部分外殼蛋白基因和3非編碼區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，27 個ASPV分離物聚集為6 支，塞外紅蘋果的ASPV 分離物分別位于組Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ（圖4）。部分塞外紅蘋果的ASPV 分離物（OL953372～75、OL953379、OL953381～83）與加拿大蘋果分離物Aurora-1（HE963831）聚集在同一個分支上形成組Ⅰ ；部分塞外紅蘋果的ASPV 分離物（OL953379、OL953380）與德國蘋果的ASPV 分離物PM8（KF319056）、印度蘋果的ASPV 分離物Palampur（FR694186）、日本蘋果的ASPV 分離物IF38（AB045371）聚為一支，位于組Ⅳ；其余塞外紅蘋果的ASPV分離物（OL953378、OL953377）形成單獨的一個分支Ⅴ。外參為沙地葡萄莖痘病毒（grapevinerupestris stem pitting- associated virus，GRSPaV）（JX559646）。

筆者在本研究中共獲得21個來源于塞外紅的ASGV分離物（GenBank登錄號OL960733～OL960753），核苷酸序列一致性為96.4%～100.0%，來自塞外紅蘋果的ASGV 分離物Kailu1-1（OL960733）與Kailu1-12（OL960739）核苷酸序列一致性最高（100.0%）；ASGV 分離物（OL960734～735、OL960745～747、OL960749～750）與分離物Kailu8-1（OL960753）之間的核苷酸序列一致性最低（96.4%）。來自塞外紅蘋果的21 個ASGV 分離物與其他已知的38 個ASGV分離物核苷酸序列一致性為89.9%～98.9%，其中塞外紅蘋果的ASGV 分離物Kailu7- 5、Kailu7- 10（OL960751、OL960752）與加拿大蘋果的ASGV 分離物13TF163B（MZ126539）的核苷酸序列一致性最高（98.9%）；分離物Kailu1-7（OL960738）與中國滇黃精ASGV分離物PG（MK427058）核苷酸序列一致性最低（89.9%）（圖5）。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示59 個ASGV分離物聚集成8 個大的分支。塞外紅蘋果的ASGV分離物獨自聚集形成一支，記為組Ⅰ（圖6）。外參為櫻桃病毒A（Cherry Virus A，CVA）（AB181355）。

3 討論

對病毒的種群多樣性和遺傳特性進(jìn)一步深入分析，能夠更好地掌握病毒的流行特點，筆者在本研究中對在開魯縣塞外紅蘋果上發(fā)生的3 種蘋果潛隱病毒病進(jìn)行了報道。通過RT-PCR獲得了29 個塞外紅蘋果ACLSV 分離物，GenBank 登錄號：ON001687～ON001715；12個塞外紅蘋果ASPV分離物，GenBank登錄號：OL953372～OL953383；21個塞外紅蘋果ASGV分離物，GenBank登錄號：OL960733～OL960753。

根據(jù)第九次國際病毒分類會議的建議標(biāo)準(zhǔn)可知，凹陷病毒屬不同種的RdRp 基因或者CP 基因的核苷酸序列一致性應(yīng)高于72%或者氨基酸序列一致性高于80%。塞外紅蘋果的ACLSV分離物之間核苷酸序列一致性為78.1%～99.9%，與其他15 個ACLSV分離物之間核苷酸序列一致性為69.1%～93.6%，其中塞外紅蘋果的ACLSV分離物（ON001689）與美國桃分離物Ta Tao 5（EU223295）核苷酸序列一致性最低（69.1%），基因組序列一致性低于國際病毒分類委員會第九次會議中給出的范圍。但通過與其他已經(jīng)報道過的ACLSV核苷酸序列一致性比對分析均大于分類標(biāo)準(zhǔn)，本研究認(rèn)為來自塞外紅蘋果的ACLSV分離物Kailu1-5（ON001689）仍屬于ACLSV。通過對ACLSV 進(jìn)化樹分析，ACLSV 未表現(xiàn)地理位置相關(guān)性和寄主相關(guān)性。通過核苷酸序列一致性分析可以發(fā)現(xiàn)塞外紅蘋果的ASPV分離物之間核苷酸序列一致性為83.6%～99.7%，與其他15 個ASPV 分離物之間的核苷酸序列一致性為75.4%～91.5%，塞外紅蘋果的ASPV分離物與已經(jīng)報道的ASPV分離物具有較高的核苷酸一致性，這些數(shù)據(jù)可以說明該分離物屬于ASPV。根據(jù)Ma 等[17]的研究結(jié)果，ASPV 分離物與地理位置和寄主有相關(guān)性，但筆者在本研究中構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹不支持ASPV分離物間呈現(xiàn)地理位置相關(guān)性和寄主相關(guān)性，這可能與樣本量較少有關(guān)。本研究結(jié)果表明，塞外紅蘋果的ASGV分離物之間核苷酸序列一致性為96.4%～100.0%，與其他38 個ASGV分離物之間核苷酸序列一致性為89.9%～98.9%。塞外紅蘋果的ASGV分離物與已經(jīng)報道的ASGV 分離物具有較高的核苷酸序列一致性，這些數(shù)據(jù)表明該分離物屬于ASGV。基于基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這些ASGV分離物在地理來源特異性或寄主專一性方面沒有明確的歸類。

筆者在本研究中對開魯縣塞外紅上3 種蘋果潛隱性病毒的分子變異情況進(jìn)行分析，進(jìn)一步明確了各個病毒分子變異規(guī)律及相應(yīng)株系的分類情況，以及開魯不同塞外紅蘋果產(chǎn)區(qū)的病毒分離物系統(tǒng)發(fā)育的親緣關(guān)系，本研究對更好地了解塞外紅蘋果潛隱性病毒的發(fā)生規(guī)律及制定有效的防治措施具有重要的理論指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

ACLSV、ASPV和ASGV均能侵染塞外紅蘋果，雙重復(fù)合侵染和三重復(fù)合侵染也有發(fā)生。與ASPV和ASGV相比，ACLSV的發(fā)生率較高，達(dá)30%。對比于其他已經(jīng)報道的病毒分離物之間的一致性，來自于塞外紅蘋果的3種病毒種內(nèi)分離物的核苷酸序列一致性均較高，并且進(jìn)化關(guān)系較近。研究結(jié)果為塞外紅蘋果產(chǎn)業(yè)綠色、健康、持續(xù)發(fā)展提供基本理論依據(jù)。

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