成永娟 張明月 曹雪璟 毛娟 陳佰鴻

摘要：【目的】明確葡萄查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）基因家族響應(yīng)外源激素和非生物脅迫的表達(dá)模式?！痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)方法對(duì)葡萄CHS基因家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化、共線(xiàn)性、順式作用元件等分析。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)VvCHS基因在外源激素和非生物脅迫下的表達(dá)情況，將篩選出的VvCHS3 基因構(gòu)建植物表達(dá)載體并進(jìn)行煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化以確定其表達(dá)位置?！窘Y(jié)果】在葡萄基因組中共鑒定出7個(gè)VvCHS基因成員，分布于5 條不同的染色體上，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主。系統(tǒng)進(jìn)化和基因?qū)x擇壓表明，CHS基因家族基因可分為三大亞族，葡萄CHS基因家族與其他物種之間主要進(jìn)行純化選擇。共線(xiàn)性分析表明，VvCHS3 與VvCHS4、VvCHS3 與VvCHS5、VvCHS4 與VvCHS5 之間存在共線(xiàn)性關(guān)系。順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，大部分VvCHS基因成員可能同時(shí)對(duì)多種逆境脅迫有響應(yīng)。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，VvCHS基因具有明顯的組織特異性，在根中表達(dá)水平最高，莖中表達(dá)水平最低。在5 mmol·L-1水楊酸（salicylic acid，SA）處理下，VvCHS3 基因在莖中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照，為對(duì)照的44.3 倍，在0.1 mmol·L-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）處理下，VvCHS3 基因在葉中顯著上調(diào)表達(dá)，為對(duì)照的36.1 倍。在400 mmol·L-1 NaCl 處理下，VvCHS5 基因在根中相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照，為對(duì)照的30.6 倍。在4 ℃和10%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）處理下，VvCHS4 基因在根中顯著上調(diào)表達(dá)。成功克隆得到VvCHS3 基因，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草下表皮細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡檢測(cè)表明VvCHS3 基因定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符?！窘Y(jié)論】葡萄CHS基因家族參與SA和MeJA等外源激素的調(diào)控，同時(shí)響應(yīng)低溫、干旱和高鹽脅迫。

關(guān)鍵詞：葡萄；查爾酮合酶；生物信息學(xué)；qRT-PCR；基因克隆

中圖分類(lèi)號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）05-0861-14

查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）屬于植物聚酮合酶超家族成員（polyketide synthase，PKS），PKS 可催化聚酮類(lèi)化合物形成芪類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、抗生素及真菌毒素等多種物質(zhì)[1]。根據(jù)蛋白的結(jié)構(gòu)可將PKS 分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，PKS- Ⅰ 、PKS- Ⅱ 型僅存在于微生物界，而PKS-Ⅲ型（CHS 超家族）則是由40～45 ku 的二聚體多肽形成，主要分布在植物界。Cys164、His303 和Asn336 是PKSs 家族高度保守的殘基，可催化生成一系列結(jié)構(gòu)各異、生理活性不同的植物次生代謝產(chǎn)物[2]。Thr132、Ser133、Thr194、Thr197、Gly256、Phe265 和Ser338 是在CHS 中高度保守的殘基，但在其他Ⅲ型PKSs 中被相應(yīng)的氨基酸替代，從而形成不同的產(chǎn)物[3]。

CHS是植物類(lèi)黃酮合成途徑的第一個(gè)限速酶，可以催化底物4-香豆酰輔酶A（coenzyme A，CoA）與丙酚CoA 生成4，5，7-三羥基黃烷酮，產(chǎn)生各種黃酮類(lèi)化合物，也可以在查爾酮異構(gòu)酶（chalconeisomerase，CHI）的催化下，進(jìn)一步衍生轉(zhuǎn)化成各類(lèi)黃酮化合物[4]?；ㄇ嘬蘸铣赏緩绞穷?lèi)黃酮合成的一部分，花青苷物質(zhì)在植物的花、葉、果皮等組織的著色過(guò)程中起著重要作用，而CHS基因參與花青苷合成的第一步縮合反應(yīng)。同時(shí)，CHS基因也參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，對(duì)植物花色形成、生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫、激素調(diào)節(jié)和運(yùn)輸都會(huì)產(chǎn)生影響[5]。此外，CHS 基因的表達(dá)受多種外源激素和非生物脅迫的誘導(dǎo)，例如茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、干旱聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和低溫（4 ℃）等[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，EaCHS1 基因超表達(dá)提高了紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）對(duì)高鹽的耐受性[9]，桑葚（Fructus mori）CHS 基因能夠調(diào)控其耐鹽及耐旱性[10]，鈍鱗紫背苔（Plagiochasma Appendiculatum）PaCHS 基因顯著受SA 誘導(dǎo)[11]。CHS 超基因家族不同成員之間結(jié)構(gòu)的微小差異，導(dǎo)致其表達(dá)模式略有不同。

到目前為止，CHS 基因在擬南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）、蘋(píng)果（Malus domestica）等物種中得到鑒定[12-15]，在甜橙（Citrus sinensis）等部分物種中進(jìn)行了克隆和轉(zhuǎn)化研究[16]。CHS基因cDNA全長(zhǎng)在1000 bp左右，編碼區(qū)高度保守，一般由2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成；但是也有例外，如苔蘚（Physcomitrellapatens）PpCHS基因家族部分成員不含或含有2 個(gè)內(nèi)含子[17]，虎杖（Polygonum cuspidatum）CHS基因含有3 個(gè)內(nèi)含子[18]。

目前，葡萄CHS 基因家族雖有報(bào)道，但其在葡萄中響應(yīng)外源激素和非生物脅迫的機(jī)制研究甚少。

因此，筆者在本研究中利用葡萄和擬南芥等植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)的方法篩選和鑒定葡萄CHS基因家族成員，并對(duì)葡萄CHS基因家族各成員的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行分析，初步揭示了在不同外源激素和非生物脅迫下該家族基因在葡萄不同組織中的表達(dá)模式，同時(shí)進(jìn)行了VvCHS3 基因的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步揭示葡萄CHS 基因家族的功能與提高葡萄的抗逆性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本試驗(yàn)于2020—2021 年在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院進(jìn)行。以黑比諾葡萄（Vitis vinifera L.‘PinotNoir）試管苗為試驗(yàn)材料，將帶葉的單芽莖段轉(zhuǎn)接于裝有50 mL GS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，以搭建紙橋的方法對(duì)材料進(jìn)行固定培養(yǎng)，每瓶接種3 株，置于RDN型人工氣候箱（寧波東南儀器有限公司，中國(guó)）中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃，220 μmol·m-2 ·s-1光照16 h，22 ℃暗培養(yǎng)8 h，濕度為60%。繼代培養(yǎng)30 d 后，挑選生長(zhǎng)健壯、無(wú)污染的試管苗，將其轉(zhuǎn)移至分別含有0.2 mmol · L-1 ABA、50 mg · L-1 赤霉素（gibberellin，GA3）、0.05 mg ·mL-1 萘乙酸（1-naphthlcetic acid，NAA）、5 mmol · L- 1 SA、0.1 mmol · L- 1 MeJA、400 mmol · L- 1 NaCl、10% PEG 的GS 液體培養(yǎng)基中。4 ℃處理在低溫植物培養(yǎng)箱（PERCIVAL LT-36公司，美國(guó)）中進(jìn)行，處理時(shí)長(zhǎng)均為24 h，以正常生長(zhǎng)的試管苗作為對(duì)照（CK），每個(gè)處理5 瓶，3 次重復(fù)。

1.2 葡萄CHS基因家族的序列獲得和比對(duì)

從擬南芥基因組網(wǎng)站TAIR（https：//www.Arabidopsis.org/）下載CHS 基因的編碼序列（coding sequence，CDS），導(dǎo)入葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/entry_ggb.html）進(jìn)行BLAST搜索，下載葡萄CHS基因全長(zhǎng)、CDS 和蛋白序列。在植物基因組網(wǎng)站JGI（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）分別下載番茄和柑橘的CHS 基因成員序列。同時(shí)使用DNAMAN軟件對(duì)葡萄CHS基因成員的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，利用HMMER 在線(xiàn)軟件（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）對(duì)葡萄CHS 基因成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)域篩選，剔除不含特定結(jié)構(gòu)域的基因。

1.3 葡萄CHS基因家族理化性質(zhì)分析

利用ExPASy 在線(xiàn)軟件（https：//web.expasy.org/protparam/）分析VvCHS 基因的理化性質(zhì)。運(yùn)用在線(xiàn)軟件WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）和Prabi 工具（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分別預(yù)測(cè)VvCHS 基因家族成員的亞細(xì)胞定位和a-螺旋、b-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例。

1.4 葡萄與其他物種CHS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化和共線(xiàn)性分析

將葡萄、擬南芥、柑橘和番茄4 個(gè)物種的CHS蛋白的氨基酸序列用ClustalX 2.1 比對(duì)，利用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap 值為1000。利用在線(xiàn)軟件GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制CHS 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)圖。根據(jù)CHS 基因fasta 格式的總CDS 序列，利用DNAsp 軟件計(jì)算葡萄、柑橘、番茄和擬南芥CHS 基因的非同義突變率（Ka）和同義突變率（Ks），分析基因?qū)χg的選擇壓。利用BAT（http：//www.infspire.org/）工具繪制葡萄、柑橘、番茄和擬南芥四者間的共線(xiàn)性關(guān)系。

1.5 葡萄CHS基因家族順式作用元件預(yù)測(cè)

下載VvCHS 基因成員起始密碼子上游2 kb 的序列作為啟動(dòng)子區(qū)域，使用PlantCARE 軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析，并用TBtools統(tǒng)計(jì)作圖。

1.6 葡萄CHS基因家族的實(shí)時(shí)熒光定量分析

VvCHS 基因引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司在線(xiàn)設(shè)計(jì)（表1）并合成。TaKaRaMiniBEST Plant RNA Extraction Kit 和Primer-ScriptTM Ⅱ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit [TaKaRa，寶生物工程（大連）有限公司]試劑盒分別用于葡萄試管苗根、莖、葉RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄。使用TaKa-Ra TB Green Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa Biotechnology）試劑盒和LightCycle? 96（Roche，瑞士）PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real- time PCR，qRT-PCR），反應(yīng)體系總體積為20 mL，包括10 mL的2 × SYBR，1 mL cDNA，2 mL 上、下游引物，7 mL 的ddH2O。以VvGAPDH 基因（登錄號(hào)：CB973647）作為葡萄定量表達(dá)內(nèi)部參照基因[19]，試驗(yàn)3 次重復(fù)。采用2-DDCT[20]法對(duì)葡萄CHS基因家族的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.7 VvCHS3 基因克隆與煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

1.7.1 VvCHS3 基因克隆 通過(guò)基因家族定量數(shù)據(jù)分析，篩選表達(dá)差異顯著的VvCHS3（GSVIVG01010590001），使用SnapGene 軟件設(shè)計(jì)帶有BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的特異性引物，VvCHS3-F：5-GAGCTCGGTACCCGGGGATCCATGGCTTCAAT -TGAGGAAATTAGAA-3，VvCHS3-R：5-GGTGTCGACTCTAGAGGATCCATTAGAAACCATAGGAA-TGCTATGCA-3。以黑比諾葡萄cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將回收產(chǎn)物與pCAMBIA1300-GFP 質(zhì)粒進(jìn)行連接，隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α 大腸感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR 檢測(cè)后送上海生工測(cè)序，測(cè)序合適后，提取VvCHS3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并鑒定陽(yáng)性農(nóng)桿菌重組子用于后續(xù)的植物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.7.2 煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化 將含有目的基因已培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液5000 ×g 離心10 min，收集菌體。使用緩沖液（50 mL 滅菌蒸餾水+500 μL MES+200 μLMgCl2+75 μL As）將菌體重懸至OD600為0.7～0.8。使用2 mL一次性注射器將重懸的菌液從生長(zhǎng)25 d左右的本氏煙草葉背打入，以空載體作為對(duì)照，并于25 ℃黑暗培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)入正常光照下培養(yǎng)1 d。在注射有菌液的葉片上用手術(shù)刀切取0.2 mm × 0.2 mm鏡檢樣本，置于AX10 熒光倒置顯微鏡（ZEISS 公司，德國(guó)）下觀察拍照。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 軟件統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，處理間用單因素ANOVA檢驗(yàn)下的鄧肯法（Duncun）進(jìn)行顯著性差異分析，p＜0.05 代表顯著差異，并用Origin 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄CHS基因家族成員理化性質(zhì)分析

從葡萄基因組中共鑒定出7 個(gè)CHS基因家族基因，根據(jù)其在染色體上的先后位置分別將其命名為VvCHS1～VvCHS7。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，VvCHS 蛋白序列相似性為29.77% ，7 個(gè)VvCHS 均含CHS 基因家族特征氨基酸序列WGVLFGFGPGL和4 個(gè)保守活性位點(diǎn)氨基酸殘基。由表2 可知，葡萄CHS基因家族成員分布在12、14、16、17和18 號(hào)染色體上，其中16 號(hào)染色體上分布最多。

VvCHS1 是編碼序列最長(zhǎng)、氨基酸殘基數(shù)目最多、分子質(zhì)量最大、等電點(diǎn)最小的成員，而VvCHS2 是全長(zhǎng)序列和編碼序列最短、氨基酸殘基數(shù)目和分子質(zhì)量最小的成員。葡萄CHS 基因家族成員理論等電點(diǎn)為5.61（VvCHS1）～8.86（VvCHS7），7 個(gè)成員中有4 個(gè)編碼酸性氨基酸。不穩(wěn)定指數(shù)介于36.64（VvCHS7）～43.50（VvCHS2）之間，其中有5 個(gè)成員為穩(wěn)定性蛋白。總平均親水性指數(shù)分布在-0.36（VvCHS1）～0.05（VvCHS2）之間，其中有6 個(gè)成員為親水性蛋白。

2.2 葡萄CHS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與基因結(jié)構(gòu)分析

利用葡萄與擬南芥、柑橘和番茄CHS蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)物種26 個(gè)蛋白可聚類(lèi)為3 個(gè)亞族。GroupⅠ由7 個(gè)CitCHS 蛋白、4 個(gè)SlCHS 蛋白、4 個(gè)VvCHS 蛋白和1 個(gè)AtCHS 蛋白聚為1 個(gè)亞族。Group Ⅱ有2 個(gè)VvCHS 蛋白和2 個(gè)AtCHS 蛋白。Group Ⅲ由VvCHS1 蛋白和5 個(gè)AtCHS 蛋白組成，表明VvCHS1、VvCHS6 和VvCHS7 蛋白與擬南芥AtCHS 蛋白有較高的同源性（圖2）。26 個(gè)CHS基因家族成員中，除AtCHS2 和AtCHS5 基因只有1個(gè)外顯子、AtCHS8 基因有13 個(gè)外顯子外，其余CHS基因外顯子數(shù)在2～6 個(gè)之間，其中有12 個(gè)基因包含2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子。結(jié)果表明，同一亞族不同基因之間基因結(jié)構(gòu)相似，親緣關(guān)系較近。

進(jìn)化選擇壓主要通過(guò)非同義突變率和同義突變率的比值（Ka/Ks）進(jìn)行分析。本研究結(jié)果顯示，VvCHS1、VvCHS3、VvCHS4、VvCHS5 與AtCHS3 基因之間，VvCHS3、VvCHS4、VvCHS5 與AtCHS6 基因之間，VvCHS6 與AtCHS8、CitCHS7 基因之間，VvCHS1與SlCHS1、SlCHS2、SlCHS4 基因之間的Ka/Ks 值大于1，進(jìn)行正向選擇，其余基因?qū)χg均為純化選擇關(guān)系，所有成員之間均不存在中性進(jìn)化關(guān)系（表3）。

2.3 葡萄CHS蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有5 個(gè)VvCHS蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核中表達(dá)，在線(xiàn)粒體和葉綠體中只有4 個(gè)蛋白表達(dá)（表4）。在過(guò)氧化物酶體中表達(dá)的有VvCHS3、VvCHS4 和VvCHS5 蛋白。在液泡中表達(dá)的只有VvCHS2 和VvCHS3 蛋白。VvCHS6 蛋白只在葉綠體和線(xiàn)粒體中表達(dá)，VvCHS7蛋白只在細(xì)胞膜中表達(dá)。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，葡萄CHS基因家族編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋結(jié)構(gòu)（占比44.13% ～51.33%）和不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（ 占比30.62%～37.40%）為主，β- 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占比（3.73～7.49%）較?。ū?）。

2.4 葡萄CHS基因啟動(dòng)子上游2 kb 順式作用元件分析

為進(jìn)一步了解葡萄CHS 基因家族的生物學(xué)功能，對(duì)其進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因家族主要包含與激素調(diào)節(jié)和逆境脅迫相關(guān)的順式作用調(diào)控元件，包括MeJA 響應(yīng)元件（TGACG-motif）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、SA 響應(yīng)元件（TCA-element）、干旱響應(yīng)元件（MBS）和低溫響應(yīng)元件（LTR）等多種調(diào)控元件。這表明葡萄CHS 基因家族大部分成員可能同時(shí)響應(yīng)多種逆境脅迫和激素調(diào)控（圖3）。另外，葡萄CHS 基因家族部分基因還包含生長(zhǎng)素、GA3、光反應(yīng)和厭氧誘導(dǎo)相關(guān)調(diào)控元件，可能與其相應(yīng)的調(diào)控相關(guān)。

2.5 葡萄與柑橘、番茄、擬南芥共線(xiàn)性基因分析

共線(xiàn)性關(guān)系分析結(jié)果顯示，葡萄與柑橘、番茄和擬南芥CHS 基因家族基因之間都不存在共線(xiàn)性關(guān)系（圖4）。葡萄7 個(gè)CHS 成員中只有3 對(duì)基因之間（VvCHS3 與VvCHS4、VvCHS3 與VvCHS5、VvCHS4與VvCHS5）存在共線(xiàn)性關(guān)系，柑橘8 個(gè)CHS 成員中只有4 對(duì)基因（CitCHS3 與CitCHS7、CitCHS3 與CitCHS5、CitCHS4 與CitCHS5、CitCHS5 與CitCHS7）之間存在共線(xiàn)性關(guān)系。經(jīng)推測(cè)，這7個(gè)基因VvCHS3、VvCHS4、VvCHS5 以及CitCHS3、CitCHS4、CitCHS5、CitCHS7 可能是由基因復(fù)制產(chǎn)生的，且CHS 基因家族的基因復(fù)制事件只發(fā)生在物種基因組內(nèi)部，在不同的物種之間未發(fā)生。

2.6 葡萄CHS基因家族的qRT-PCR分析

2.6.1 葡萄不同組織中VvCHS 基因的表達(dá)分析 qRT-PCR 分析結(jié)果顯示，VvCHS1 基因在葉中表達(dá)水平最高，相對(duì)表達(dá)量是根的1.2 倍。VvCHS6 在根中表達(dá)水平最高，在葉中表達(dá)水平最低。其余5 個(gè)VvCHS 基因在根中相對(duì)表達(dá)量最高，葉中次之，莖中相對(duì)表達(dá)量最低，具有明顯的組織特異性（圖5）。

2.6.2 激素誘導(dǎo)下葡萄CHS 基因家族在葡萄根、莖、葉中的表達(dá) 在不同激素處理下，對(duì)葡萄CHS基因家族進(jìn)行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)葡萄根、莖、葉經(jīng)MeJA 和SA 誘導(dǎo)后，VvCHS 基因上調(diào)表達(dá)，其中以VvCHS3 上調(diào)表達(dá)最為顯著，在根、莖和葉中相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的16.4、31.2、36.1 倍和40.3、44.3、25 倍（圖6）。

在MeJA 處理下，VvCHS2 和VvCHS4 基因在根中的表達(dá)水平高于莖和葉，其余基因在葡萄葉中的表達(dá)水平高于根和莖。在SA誘導(dǎo)后，VvCHS3 基因在莖中的表達(dá)水平高于根和葉，VvCHS4 基因在根和葉中的表達(dá)水平較高，在莖中表達(dá)水平較低，其余基因在根中的表達(dá)水平最高。NAA 誘導(dǎo)后，VvCHS2 基因在根和葉中的表達(dá)水平較低，在莖中表達(dá)水平較高。GA3誘導(dǎo)后，VvCHS1 和VvCHS3 基因在葉片中的表達(dá)水平顯著高于根和莖。VvCHS6基因只在葡萄根組織經(jīng)SA 誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)，為對(duì)照的1.23 倍。這表明在不同激素誘導(dǎo)下，VvCHS 基因在葡萄不同組織中的表達(dá)水平不同，VvCHS 基因可能參與MeJA和SA的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，響應(yīng)激素調(diào)控。

2.6.3 非生物脅迫下葡萄CHS基因家族在葡萄根、莖、葉中的表達(dá) 在非生物脅迫處理下，對(duì)VvCHS基因在葡萄不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在4 ℃ 處理下，VvCHS1、VvCHS3、VvCHS4 和VvCHS7 基因在根中的表達(dá)水平最高，在莖中的表達(dá)水平最低。以VvCHS4 基因在葡萄根中上調(diào)表達(dá)最為顯著，相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的53.4 倍。VvCHS6基因在葡萄葉片中的相對(duì)表達(dá)量高于根，VvCHS3和VvCHS5 基因在葉片中的表達(dá)水平低于莖（圖7）。

在NaCl 處理下，VvCHS1、VvCHS4、VvCHS5 和VvCHS6 基因在根中的表達(dá)水平最高，其中VvCHS1和VvCHS6 基因在莖中的表達(dá)水平最低，VvCHS4 和VvCHS5 基因在葉片中的表達(dá)水平最低。VvCHS5基因在根中上調(diào)表達(dá)最為顯著，相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的30.6 倍。在PEG 處理下，VvCHS4 基因在根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量最高，分別為對(duì)照的24.4、11.7 和13.3 倍。VvCHS1、VvCHS2 和VvCHS3 基因在莖中的表達(dá)水平高于根和葉。

葡萄根、莖、葉在NaCl、4 ℃和PEG 處理下，除VvCHS2 和VvCHS6 基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)表達(dá)外，其余基因均上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明在不同非生物脅迫下，不同組織器官中VvCHS 基因的表達(dá)水平有差異，VvCHS基因響應(yīng)葡萄高鹽、低溫和干旱脅迫。

2.7 VvCHS3 煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將35S：：VvCHS3：：GFP 導(dǎo)入本氏煙草葉片下表皮細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析，結(jié)果顯示注射空載35S：：GFP 的整個(gè)細(xì)胞發(fā)綠色熒光，而注射35S：：VvCHS3：：GFP 的本氏煙草葉片在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上有綠色熒光。試驗(yàn)證明VvCHS3 基因定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中（圖8），該結(jié)果與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

3 討論

CHS是植物體類(lèi)黃酮合成路徑中的關(guān)鍵酶，也是與苯丙酮代謝有關(guān)的基因。筆者在本研究中從葡萄基因組中鑒定出7 個(gè)CHS基因，與擬南芥、柑橘和番茄CHS基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化和選擇壓力分析，運(yùn)用qRT-PCR分析不同激素誘導(dǎo)和非生物脅迫下該基因家族成員的組織表達(dá)特異性和不同處理下的表達(dá)情況，明確該家族基因在響應(yīng)激素和非生物脅迫時(shí)的分子機(jī)制。到目前為止，已從矮牽牛（Petunia hybridaVilm.）、白木香（Aquilaria sinensis）等物種中分離鑒定出了CHS基因[21-22]。雙子葉植物中CHS基因家族數(shù)目較多，其中番茄中有8 個(gè)CHS基因[14]，辣椒（Capsicum annuum）中有7 個(gè)CHS 基因[23]。大多數(shù)單子葉植物含有2 個(gè)或3 個(gè)CHS基因。而在葡萄中鑒定到7 個(gè)VvCHS 基因。由此可見(jiàn)，不同物種中的CHS基因在數(shù)量上存在差異，這可能與基因組大小和物種的進(jìn)化有關(guān)。VvCHS基因不均勻分布于5 條不同的染色體上，其中有3 個(gè)基因均分布于第16 條染色體上。VvCHS 基因家族等電點(diǎn)值表明，該基因家族只有1 種中性蛋白質(zhì)（VvCHS5），有2 種堿性蛋白質(zhì)（VvCHS6 和VvCHS7）。根據(jù)遺傳距離筆者將CHS 蛋白劃分為3 大亞族，其中Group Ⅱ和GroupⅢ均由葡萄VvCHS蛋白和擬南芥AtCHS 蛋白聚類(lèi)為一族，說(shuō)明葡萄與擬南芥CHS 之間同源關(guān)系較近。葡萄CHS 基因與其他3 個(gè)物種CHS 基因之間主要進(jìn)行純化選擇，葡萄中僅VvCHS3 與VvCHS4、VvCHS3 與VvCHS5、VvCHS4 與VvCHS5 之間具有共線(xiàn)性關(guān)系，柑橘中僅CitCHS3 與CitCHS7、CitCHS3與CitCHS5、CitCHS4 與CitCHS5、CitCHS5 與CitCHS7 之間具有共線(xiàn)性關(guān)系。通過(guò)共線(xiàn)性分析結(jié)合基因的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，VvCHS3、VvCHS4、VvCHS5、CitCHS3、CitCHS4、CitCHS5、CitCHS7 的基因結(jié)構(gòu)高度相似，這7 個(gè)基因分布在同一個(gè)亞家族，基因之間親緣關(guān)系相近，說(shuō)明這些基因是在同一物種內(nèi)由于基因復(fù)制而分離的同源基因。因此推測(cè)這幾個(gè)基因可能是由基因復(fù)制產(chǎn)生的。

趙偉等[24] 發(fā)現(xiàn)紅仁核桃（Juglans regia L.）JrCHS 蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)。章妮等[25]研究表明毛竹（Phyllostachys edulis）CHS 蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)。何夢(mèng)媛等[26]通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)甘草（Glycyrrhiza uralensis）GuCHS蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。本研究亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，葡萄CHS 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化顯示VvCHS3 基因定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符，表明CHS基因可能大多在細(xì)胞質(zhì)中起作用，但是不同物種CHS 基因家族成員在細(xì)胞器中的分布也存在一定差異。對(duì)葡萄CHS 基因家族進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，VvCHS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主，β-轉(zhuǎn)角則相對(duì)較少，這一結(jié)果與趙偉等[24]分析紅仁核桃CHS蛋白的研究結(jié)果一致。

CHS 基因的表達(dá)與器官形態(tài)建成、功能分化有著密切關(guān)系，由于表達(dá)模式的差異，使其表達(dá)具有組織特異性。張變玲等[7]研究結(jié)果表明人參（Panax ginseng C.）CHS 基因主要在葉片中表達(dá)。梅志棟等[27]研究表明杧果（Mangifera indica）CHS1基因的相對(duì)表達(dá)量在葉和花中較高。而本研究表明，葡萄CHS 基因主要在根中表達(dá)，也有個(gè)別基因在葉片中表達(dá)水平最高，如VvCHS1 基因在葉片中的相對(duì)表達(dá)量是根的1.2 倍。除VvCHS6 基因在莖中的相對(duì)表達(dá)量高于葉片外，該基因家族其余成員在莖中的表達(dá)水平最低。這與前人的研究結(jié)果有相似之處，但是也存在一定的差異，表明不同物種CHS基因家族成員在不同組織中的表達(dá)水平不盡相同。順式作用元件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，葡萄CHS基因家族成員的啟動(dòng)子序列中含有與激素、非生物脅迫相關(guān)的調(diào)控元件，這與趙偉等[24]的研究結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，泡核桃（Juglans sigillata）JsCHS1 基因在低溫處理6 h 后上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明JsCHS1 基因可響應(yīng)低溫脅迫[28]。秋茄（Kandelia candel）KcCHS 基因的相對(duì)表達(dá)量隨著鹽脅迫的增強(qiáng)呈極顯著上升趨勢(shì)，這與秋茄抵抗鹽脅迫的能力有關(guān)[29]。馬立功等[8]研究向日葵（Helianthus annuus）HaCHS基因的逆境應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)經(jīng)SA 和ABA 誘導(dǎo)后，HaCHS 基因的相對(duì)表達(dá)量變化不顯著。王海波等[30]通過(guò)半定量RTPCR分析說(shuō)明JcCHS 基因在小桐子（Jatropha curcas）中響應(yīng)低溫。本研究通過(guò)qRT-PCR 分析表明，在不同外源激素誘導(dǎo)和非生物脅迫條件下，VvCHS基因家族成員在葡萄根、莖、葉中均有表達(dá)。在5mmol · L-1 SA 誘導(dǎo)下，VvCHS1 和VvCHS7 基因在葡萄根中顯著上調(diào)表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的21 倍和15.3 倍；VvCHS3 在葡萄莖中的相對(duì)表達(dá)量最高，為對(duì)照的44.3 倍。這與張變玲等[7]的研究結(jié)果一致，與馬立功等[8]的研究結(jié)果不符，說(shuō)明CHS基因在不同植物中可能具有不同的表達(dá)模式，存在不同的調(diào)控機(jī)制。在0.2 mmol · L- 1 ABA 誘導(dǎo)下，VvCHS 基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照并無(wú)顯著差異，且該處理下VvCHS基因的表達(dá)水平最低，說(shuō)明VvCHS基因?qū)BA誘導(dǎo)不敏感，可能沒(méi)有參與ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控。在0.1 mmol · L- 1 MeJA 誘導(dǎo)下，VvCHS 基因家族成員除VvCHS6 呈下調(diào)表達(dá)外，其余基因均上調(diào)表達(dá)，在葡萄葉片中，VvCHS3 的相對(duì)表達(dá)量最高，為對(duì)照的36.1 倍，說(shuō)明VvCHS 基因受MeJA誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，這與前人的研究結(jié)果一致。葡萄在400 mmol·L-1 NaCl、4 ℃和10% PEG脅迫下，VvCHS1、VvCHS3、VvCHS4、VvCHS5 和VvCHS7 基因均上調(diào)表達(dá)，其中以VvCHS4 基因上調(diào)表達(dá)最為顯著，說(shuō)明VvCHS 基因參與鹽脅迫、低溫誘導(dǎo)和干旱脅迫，這與前人研究結(jié)果一致。以上結(jié)果表明VvCHS 基因家族的大多數(shù)成員受MeJA、SA、ABA和各種非生物脅迫調(diào)節(jié)的影響，說(shuō)明VvCHS基因家族在葡萄逆境脅迫應(yīng)答中起作用。

4 結(jié)論

本研究基于葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)共鑒定出7 個(gè)VvCHS 基因家族成員，分布于5 條不同染色體上。分析發(fā)現(xiàn)VvCHS基因家族有4 個(gè)成員為酸性蛋白，5個(gè)成員為穩(wěn)定性蛋白，6 個(gè)成員為親水性蛋白。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主。該基因家族啟動(dòng)子區(qū)域包括低溫、干旱及激素響應(yīng)元件。煙草瞬時(shí)表達(dá)證明VvCHS3 基因定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜。qRT-PCR結(jié)果表明，該基因家族參與水楊酸和茉莉酸甲酯等外源激素的調(diào)控，同時(shí)響應(yīng)低溫、干旱和高鹽脅迫。

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