蘇永峰 劉俐君 馬紅喜 袁引燕 張德恩 魯曉燕

摘要：【目的】探索新疆野蘋果組培苗谷胱甘肽代謝對(duì)凍害脅迫的響應(yīng)，篩選新疆野蘋果谷胱代謝相關(guān)應(yīng)答凍害基因，解析新疆野蘋果組培苗抗凍的可能作用方式?！痉椒ā恳詥沃晗档男陆疤O果組培苗為研究對(duì)象，在-3 ℃模擬凍害條件下，觀察及檢測(cè)CK、T6h、T12h、T36h、HF24h 處理新疆野蘋果組培苗的形態(tài)、熒光參數(shù)Fv/Fm值、相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛、過(guò)氧化氫、還原性谷胱甘肽含量，并對(duì)對(duì)照、T6h、T12h 3 個(gè)處理的幼苗葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析?！窘Y(jié)果】使用-3 ℃模擬凍害對(duì)新疆野蘋果組培苗進(jìn)行脅迫，處理12 h 時(shí)新疆野蘋果組培苗葉尖卷縮，處理36 h 時(shí)整個(gè)植株完全萎蔫，在HF24h 時(shí)萎蔫的植株完全恢復(fù)；與對(duì)照相比，隨著凍害處理時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛、過(guò)氧化氫、還原性谷胱甘肽含量顯著上升，熒光參數(shù)Fv/Fm值顯著下降。在HF24h，相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛、過(guò)氧化氫的含量相比T36h 呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，熒光參數(shù)恢復(fù)到與對(duì)照相當(dāng)，還原性谷胱甘肽含量相比T36h 沒有顯著變化。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選到18 個(gè)谷胱甘肽代謝途（map00480）差異基因，分別注釋為GGCT、GSS、GGT1_5、CARP、speE 和IDH1。它們參與GSH的降解與合成、GSH與GSSG的動(dòng)態(tài)平衡和GSH消除氧化電位高的物質(zhì)反應(yīng)中。【結(jié)論】新疆野蘋果組培苗在-3 ℃模擬凍害條件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，新疆野蘋果組培苗受到的傷害不斷加深，恢復(fù)處理24 h后，組培苗有顯著的恢復(fù)，在轉(zhuǎn)錄組水平，基因GST和GPX顯著上調(diào)表達(dá)，表明新疆野蘋果可以通過(guò)GSH代謝抵御低溫脅迫。

關(guān)鍵詞：新疆野蘋果組培苗；凍害脅迫；谷胱甘肽代謝；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）05-0829-12

中國(guó)是世界上最大的蘋果生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，蘋果種植面積和產(chǎn)量均超過(guò)世界總量的50%[1]。中國(guó)的自然地理、生態(tài)環(huán)境和氣候條件復(fù)雜多樣，且蘋果種植產(chǎn)區(qū)分布廣泛，每年都可能在不同地域發(fā)生霜凍、寒潮、低溫凍害、冰雹、雨澇、大風(fēng)、干旱等自然災(zāi)害，因此中國(guó)蘋果生產(chǎn)經(jīng)常面臨各種自然災(zāi)害的威脅[2]。新疆野蘋果（Malus sieversii）又稱塞威士蘋果，是現(xiàn)代栽培蘋果的祖先，種群遺傳多樣性豐富，具有抗寒、抗旱、抗鹽堿等優(yōu)良特性[3]。因此，研究新疆野蘋果抗寒性以及挖掘抗寒性相關(guān)的基因，對(duì)蘋果的抗寒育種和產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

谷胱甘肽（glutathione，GSH）在1929 年由Hopkins最早發(fā)現(xiàn)并予以命名[4-5]，為谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽[6]。植物細(xì)胞內(nèi)GSH 的合成通常發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中[7-8]。谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑，參與AsA-GSH 循環(huán)[9]。

在AsA-GSH 循環(huán)中，抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）以抗壞血酸（AsA）為電子供體催化過(guò)氧化氫（H2O2）還原為水，脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）利用谷胱甘肽提供的電子將脫氫抗壞血酸（DHA）還原為AsA[10-11]，其次是GSH 調(diào)控酶促抗氧化劑，間接參與ROS清除[12]。當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，還原型谷胱甘肽與蛋白質(zhì)的半胱氨酸巰基形成二硫化物使得蛋白質(zhì)自身谷胱甘肽化[13]。蛋白質(zhì)谷胱甘肽化可保護(hù)蛋白免受其活性氧誘導(dǎo)的不可逆的氧化，從而調(diào)節(jié)蛋白的活性[14]，植物電子信號(hào)傳輸過(guò)程中GSH/GSSG 可以作為氧化形式和還原形式的電子載體以達(dá)到氧化還原平衡狀態(tài)，對(duì)水楊酸[1（5] SA）、茉莉酸[1（6] JA）、脫落酸[1（7] ABA）和乙烯[1（8] ET）信號(hào)分子參與的植物防御反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控。谷胱甘肽代謝中的3 個(gè)重要的酶類，即谷胱甘肽還原酶（glutathionereductase，GR）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathioneperoxidase，GPX）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（glutathioneS-transferase，GST）活性的變化與植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性密切相關(guān)[19]，植物中的谷胱甘肽還原酶（GR）催化氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathionedisulfide，GSSG）生成還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）；對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)高GSH/GSSG 比率有重要作用[20]。在低溫、高溫、干旱、高鹽脅迫過(guò)程中，油菜谷胱甘肽還原酶發(fā)揮重要作用。其中GR1和GR2 基因的轉(zhuǎn)錄以及GR 活性水平明顯上升[21]。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）是生物機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，它可以消除機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫及脂質(zhì)過(guò)氧化物，阻斷活性氧自由基對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷，是生物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除劑[22]，在毛竹抗低溫和強(qiáng)光中，毛竹葉片中PeGPXs 表達(dá)量發(fā)生明顯變化[23]。植物谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）的主要功能是解除外界以及內(nèi)源代謝有毒產(chǎn)物的傷害[24]，GST 過(guò)表達(dá)能提高煙草對(duì)ROS 以及重金屬Cd2+的清除能力，從而增強(qiáng)煙草對(duì)干旱、鎘、NaCl 的耐受能力[25]，在植物耐受不同環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要保護(hù)作用，這表明它們?cè)谥参飸?yīng)對(duì)脅迫過(guò)程中具有重要的作用。關(guān)于凍害條件下新疆野蘋果谷胱甘肽代謝機(jī)制的研究較少。筆者在本研究中以單株系的新疆野蘋果組培苗為材料，在筆者課題組前期研究的基礎(chǔ)上，篩選凍害與新疆野蘋果組培苗谷胱甘肽代謝相關(guān)的基因，以期為解析新疆野蘋果組培苗響應(yīng)凍害的分子機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

試驗(yàn)于2021 年1 月至2022 年3 月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料及處理

新疆野蘋果種子來(lái)自新疆伊犁哈薩克自治州霍城縣。種子經(jīng)過(guò)層積處理，種植在5 cm×10 cm的穴盤中，當(dāng)實(shí)生苗長(zhǎng)至6～8 片葉時(shí)，以頂端2～3 cm 莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。參考何晨晨等[26]的方法進(jìn)行培養(yǎng)基的配制，每隔1 個(gè)月繼代1 次，選取增殖較好的單株系叢生芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)60 d 后選擇生長(zhǎng)一致的組培苗進(jìn)行處理，組培苗均在人工氣候培養(yǎng)箱（RXZ 智能型，寧波江南儀器廠）中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均為：光照度5 000 lx、晝25 ℃/14 h、夜23 ℃/10 h，相對(duì)濕度75%。

-3 ℃模擬凍害試驗(yàn)處理參考范宗民等[27]的方法，在人工改造的冰箱（容聲BD/BC-310MS）中進(jìn)行處理，冰箱內(nèi)的條件為：光照度5 000 lx、晝25 ℃/14 h、夜23 ℃/10 h，相對(duì)濕度75%。以25 ℃下培養(yǎng)的材料為對(duì)照（CK），溫度從25 ℃開始以4 ℃?h-1降溫至-3 ℃，在-3 ℃模擬凍害條件下處理6 h、12 h、36 h（分別記為T6h、T12h、T36h），-3 ℃處理36 h 后立即放到25 ℃培養(yǎng)箱恢復(fù)24 h（HF24h），共5 個(gè)處理，每個(gè)處理6 株苗，3 次重復(fù)，觀察不同處理的形態(tài)變化及測(cè)定生理指標(biāo)，利用R語(yǔ)言與Excel 處理數(shù)據(jù)以及繪圖。

1.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

采用慢速熒光成像系統(tǒng)（MAX-Imaging-PAM，WALZ，德國(guó)）測(cè)定光系統(tǒng)Ⅱ的最大量子產(chǎn)量（Fv/Fm）；相對(duì)電導(dǎo)率參照李合生[28]的方法測(cè)定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；過(guò)氧化氫含量采用二甲基橙法測(cè)定；谷胱甘肽含量采用DTNB顯色法測(cè)定。

1.3 谷胱甘肽相關(guān)差異基因篩選

筆者課題組前期將溫度從25 ℃開始以4 ℃·h-1降溫至-3 ℃，在-3 ℃模擬凍害條件下處理6 h、12 h的新疆野蘋果組培苗和對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[29]，基于負(fù)二項(xiàng)分布原理的DEseq2 方法進(jìn)行DEGs 的檢測(cè)，將Q-value≤0.05（adjusted P-value≤0.05）的基因定義為顯著差異表達(dá)基因，將每個(gè)處理相對(duì)CK差異倍數(shù)絕對(duì)值為1.5 以上的DEGs 定義為極顯著差異表達(dá)基因。登錄KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取谷胱甘肽代謝通路基因，然后將在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的谷胱甘肽代謝相關(guān)基因與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)KEGG注釋文件進(jìn)行比對(duì)，從而篩選出轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中有顯著表達(dá)谷胱甘肽代謝的相關(guān)基因進(jìn)行分析。

1.4 谷胱甘肽相關(guān)差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

根據(jù)筆者課題組前期試驗(yàn)選擇UBQ為內(nèi)參基因[26]，利用Primer 3 設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，引物合成由上海生物工程公司完成（表1）。以不同處理的新疆野蘋果組培苗葉片RNA為模板，參照ABM公司反轉(zhuǎn)試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。qRT-PCR 按照Green Real time PCR Master MIX 試劑盒（TOYOBO，日本）進(jìn)行，基因表達(dá)量采用相對(duì)定量2-ΔΔCT法，即log2（T/CK）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍害對(duì)新疆野蘋果組培苗形態(tài)的影響

如圖1 所示，對(duì)-3 ℃低溫脅迫下新疆野蘋果組培苗的形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)與CK相比，在T6h，植株的葉形、葉色未見明顯變化；在T12h，新疆野蘋果組培苗頂部葉片邊緣出現(xiàn)反卷，葉色變暗，頂梢嫩葉可見萎蔫；在T36h，新疆野蘋果組培苗葉片萎蔫下垂，葉色進(jìn)一步變暗；在HF24h，萎蔫卷曲的葉片舒展，葉色也由暗變亮，恢復(fù)后葉片出現(xiàn)褐色小斑點(diǎn)。

2.2 凍害對(duì)新疆野蘋果組培苗葉綠素?zé)晒獾挠绊?/p>

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)能夠快速無(wú)損地檢測(cè)作物葉片對(duì)環(huán)境脅迫的敏感性。其顏色依次從粉紅、藍(lán)、綠、橙、黑色表示植物受到的脅迫越重，對(duì)應(yīng)的Fv/Fm數(shù)值范圍為1～0（圖2-A），當(dāng)Fv/Fm下降時(shí)，代表植物受到了脅迫。由圖2-A可見，與CK相比，新疆野蘋果組培苗在-3 ℃模擬凍害條件下處理不同時(shí)間段，再到室溫恢復(fù)24 h，幼苗葉片的熒光從深藍(lán)色逐漸變?yōu)辄S綠色又恢復(fù)到深藍(lán)色，表明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，新疆野蘋果組培苗受到的脅迫逐漸加深，室溫恢復(fù)24 h，新疆野蘋果組培苗熒光顏色恢復(fù)到與CK 相同。同時(shí)Fv/Fm 數(shù)值的變化趨勢(shì)與葉綠素?zé)晒忸伾兓恢?。與CK 相比，-3 ℃處理的Fv/Fm均發(fā)生顯著變化，T6h、T12h、T36h 的Fv/Fm 分別下降20%、30%、53%，HF24h 與CK 的Fv/Fm 無(wú)顯著差異（圖2-B）。

2.3 凍害對(duì)新疆野蘋果組培苗生理指標(biāo)的影響

由圖3 可見，與CK相比，新疆野蘋果組培苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率在T6h 無(wú)顯著差異，在T12h 和T36h相對(duì)電導(dǎo)率分別顯著上升50%和175%，HF24h 與T36h 相比，新疆野蘋果組培苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率顯著下降48%；與CK 相比，新疆野蘋果組培苗葉片MDA 含量在T6h 沒有顯著變化，在T12h 和T36h，新疆野蘋果組培苗葉片MDA 含量分別顯著上升57%和86%，HF24h 相比T36h，MDA含量顯著下降23%；與CK相比，新疆野蘋果組培苗葉片過(guò)氧化氫含量在T6h 沒有顯著變化，在T12h 和T36h 新疆野蘋果組培苗葉片過(guò)氧化氫含量分別上升171%和291%，HF24h 與T36h 相比下降30%；與CK相比，新疆野蘋果組培苗葉片還原性谷胱甘肽含量在T6h、T12h 和T36h 分別顯著上升40%、89%和110% ，HF24h 與T36h 相比，新疆野蘋果組培苗葉片差異不顯著。

2.4 新疆野蘋果響應(yīng)凍害的谷胱甘肽代謝差異表達(dá)基因篩選

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中差異表達(dá)基因注釋分析，篩選到谷胱甘肽代謝途徑的差異基因。由圖4-A可見，與CK相比在T6h 和T12h，BGI_novel_G000969、Msi_11B024060、Msi_11B002610、Msi_15B018350、Msi_11A024060 下調(diào)表達(dá)，在T6h 和T12h 處理，Msi_08B010370、Msi_11B013970、Msi_17B006200、Msi_12A020080、Msi_14A011470、Msi_14B010870、Msi_09B008290、Msi_06A008160、Msi_03A025150、Msi_10A018630、BGI_novel_G001892、Msi_09A009290、Msi_07A023660 上調(diào)表達(dá)。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)18 個(gè)差異基因進(jìn)行注釋，1 個(gè)基因被注釋為γ-谷氨酰環(huán)轉(zhuǎn)移酶[EC：4.3.2.9]GGCT，1 個(gè)基因被注釋為谷胱甘肽合酶[EC：6.3.2.3]GSS；1 個(gè)基因被注釋為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶[EC：1.11.1.9]GPX；1 個(gè)基因被注釋?duì)?谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶[EC：2.3.2.2、3.4.19.13、3.4.19.14] K18592 GGT1_5；4 個(gè)基因注釋為亮氨肽酶K01255 CARP；4 個(gè)基因注釋為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶[EC：2.5.1.18] K00799 GST；1 個(gè)基因注釋為亞精胺合酶[EC：2.5.1.16] K00797 speE；3 個(gè)基因注釋為6- 磷酸葡萄糖酸脫氫酶[EC：1.1.1.441.1.1.343] K00033 PGD；2 個(gè)基因注釋為異檸檬酸脫氫酶[EC：1.1.1.42] K00031 IDH1。

如圖4-B 所示，Msi_06A008160（DPX）、Msi_14A011470（PDG）、Msi_14B010870（PDG）、Msi_17B006200（PDG）、Msi_11A024060（IDH1）、Msi_11B024060（IDH1）參與GSH 與GSSG 的動(dòng)態(tài)平衡，Msi_03A025150（GST）、Msi_10A018630（GST）、Msi_11B013970（GST）、BGI_novel_G001892（GST）參與到GSH 氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中；Msi_15B018350（GGT1_5）、BGI_novel_G000969（CARP）、Msi_11B002610（CARP）、Msi_09A009610（CARP）、Msi_09B008290（CARP）、Msi_12A020080（GSS）參與到GSH降解和合成過(guò)程中。

2.5 新疆野蘋果響應(yīng)凍害谷胱甘肽代謝相關(guān)基因GO功能分析

對(duì)18 個(gè)參與谷胱甘肽代謝的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，由圖5 可知，同一基因具有多個(gè)不同功能。在生物過(guò)程中發(fā)現(xiàn)Msi_06A008160、Msi_11B013970、Msi_12A020080 參與刺激反應(yīng)；Msi_07A023660、Msi_08B010370、Msi_11B013970、Msi_14A011470、Msi_14B010870、Msi_15B018350、Msi_17B006200 參與細(xì)胞過(guò)程；Msi_07A023660、Msi_08B010370、Msi_14A011470、Msi_14B010870、Msi_15B018350、Msi_17B006200 參與代謝過(guò)程；Msi_09A009610、Msi_09B008290、Msi_11B013970 參與生物調(diào)節(jié)。在細(xì)胞組成中發(fā)現(xiàn)Msi_11B013970 參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；Msi_06A008160、Msi_09A009610、Msi_09B008290、Msi_11B013970、Msi_12A020080、Msi_15B018350 參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)體構(gòu)建；Msi_11B013970、Msi_12A020080參與內(nèi)細(xì)胞構(gòu)建。在分子功能中發(fā)現(xiàn)，Msi_03A025150、Msi_06A008160、Msi_07A023660、Msi_08B010370、Msi_10A018630、Msi_11A024060、Msi_11B013970、Msi_11B024060、Msi_12A020080、Msi_14A011470 參與催化活性激發(fā)；Msi_06A008160 參與抗氧化活性激發(fā)；Msi_09A009610、Msi_09B008290、Msi_11A024060、Msi_11B013970、Msi_11B024060、Msi_12A020080、Msi_14A011470、Msi_14B010870、Msi_17B006200 參與結(jié)合功能發(fā)揮。

2.6 qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

如圖6 所示，在谷胱甘肽代謝途徑差異基因中選取6 個(gè)差異顯著基因進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CK相比，在T6h Msi_11B013970、Msi_06A008160、Msi_09B008290、BGI_novel_G001892、Msi_17B006200 上調(diào)表達(dá)，Msi_11A024060 下調(diào)表達(dá)。在T12h Msi_11B013970、Msi_06A008160、Msi_09B008290、BGI_novel_G001892、Msi_17B006200上調(diào)表達(dá)，Msi_11A024060 下調(diào)表達(dá)。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致。

2.7 GPX和GST在新疆野蘋果凍害處理與凍害恢復(fù)中的表達(dá)

如圖7 所示，利用qPCR 對(duì)在T36h 和HF24h，Msi_06A008160（GPX）、BGI_novel_G001892（GST）、Msi_03A025150（GST）、Msi_10A018630（GST）、Msi_11B013970（GST）的表達(dá)量水平進(jìn)行分析，與CK相比，在T36h 處理下，Msi_06A008160（GPX）、Msi_11B013970（GST）上調(diào)表達(dá)，BGI_novel_G001892（GST）、Msi_03A025150（GST）、Msi_10A018630（GST）下調(diào)表達(dá)；在HF24h 處理下，Msi_06A008160（GPX）、Msi_11B013970（GST）、Msi_03A025150（GST）、Msi_10A018630（GST）上調(diào)表達(dá)，BGI_novel_G001892（GST）下調(diào)表達(dá)。HF24h 相比于T36h，Msi_06A008160（GPX）、Msi_03A025150（GST）、Msi_10A018630（GST）、Msi_11B013970（GST）都是上調(diào)表達(dá)，BGI_novel_G001892（GST）沒有顯著變化。

3 討論

植物活性氧的積累激活了植物防御基因的表達(dá)[30]，GSH庫(kù)的大小以及氧化和還原狀態(tài)與植物對(duì)脅迫環(huán)境的抵抗力高度相關(guān)[19]。GSH可以消除過(guò)氧化物來(lái)保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化脅迫[31]。雷陽(yáng)等[32]在探究辣椒對(duì)鉛脅迫抗性中發(fā)現(xiàn)，GSH可有效緩解鉛脅迫對(duì)辣椒造成的生理?yè)p害，進(jìn)而提高辣椒抵抗鉛脅迫的能力。韓敏等[33]在研究番茄嫁接苗抗寒性中發(fā)現(xiàn)，低溫處理后的番茄葉片還原性谷胱甘肽含量高于對(duì)照，草莓在0 ℃低溫馴化72 h，草莓葉片中GSH 含量達(dá)到最大值后下降，但明顯高于對(duì)照[34]。

各種逆境脅迫均可誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度的增加而導(dǎo)致氧化脅迫[35]，而植物在脅迫應(yīng)答過(guò)程中主要調(diào)動(dòng)抗氧化酶類和抗氧化物質(zhì)來(lái)清除活性氧，從而減緩逆境對(duì)植物自身的傷害[36]。本研究結(jié)果顯示，在T6h、T12h、T36h 還原性谷胱甘肽含量都顯著高于對(duì)照，新疆野蘋果組培苗恢復(fù)處理24 h，相較T36h GSH 含量沒有顯著差異，這表明GSH 在新疆野蘋果抗凍害中起到重要作用。

對(duì)差異基因所參與的通路分析表明，相比于對(duì)照，在T6h 和T12h，Msi_12A020080（GSS）上調(diào)表達(dá)，Msi_15B018350（GGT1_5）下調(diào)表達(dá)，Msi_15B018350（GGT1_5）、BGI_novel_G000969（CARP）、Msi_11B002610（CARP）、Msi_A009610（CARP）、Msi_09B008290（CARP）、Msi_12A020080（GSS）參與到GSH降解和合成過(guò)程中。這就解釋了新疆野蘋果組培苗在凍害脅迫下GSH的積累可能的途徑之一為抑制GSH降解和促進(jìn)GSH合成。相比于對(duì)照，在T6h 和T12h，Msi_06A008160（GPX）、Msi_14A011470（PDG）、Msi_14B010870（PDG）、Msi_17B006200（PDG）上調(diào)表達(dá)，Msi_06A008160（DPX）、Msi_14A011470（PDG）、Msi_14B010870（PDG）、Msi_17B006200（PDG）參與GSH 與GSSG的動(dòng)態(tài)平衡通路；谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）是GSH 與GSSG 動(dòng)態(tài)平衡中的關(guān)鍵酶，谷胱甘肽還原酶（GR）是真核和原核生物中都存在的一類黃素蛋白氧化還原酶，主要分布于葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，是AsA-GSH循環(huán)過(guò)程中重要的酶類，在氧化脅迫過(guò)程中能夠有效清除ROS[37-40]。在脅迫條件下油菜抗性品種具有比敏感型品種更高的GR活性[21]，在Cd 脅迫下S 元素過(guò)剩的根中發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽合成酶（MsGS）和植物螯合素合成酶（MsPCS1）基因的上調(diào)以及谷胱甘肽和植物螯合素濃度的增加，谷胱甘肽含量升高使植物螯合素能夠與過(guò)量的Cd 結(jié)合[41]。高溫脅迫下耐熱性強(qiáng)的蘆葦GR 活性顯著高于耐熱性弱的蘆葦（Phragmitesaustralis）[42]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，-3 ℃條件下，在T6h 和T12h 基因GR表達(dá)量與對(duì)照相比沒有顯著差異，這可能是在新疆野蘋果中存在能夠代替GR功能的其他酶。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）是含有疏基的過(guò)氧化物酶類，它們利用GSH來(lái)減少過(guò)氧化物從而保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化脅迫[31]，木薯細(xì)菌性枯萎病侵染后MeGPX1、MeGPX5 和MeGPX6 的表達(dá)量呈顯著上調(diào)趨勢(shì)[43]。凍害脅迫下新疆野蘋果組培苗基因Msi_06A008160（GPX）上調(diào)表達(dá)，這表明凍害脅迫下新疆野蘋果組培苗可能通過(guò)GSHGSSG動(dòng)態(tài)平衡消除對(duì)其有害的H2O2 和超氧陰離子等物質(zhì)。相比于對(duì)照，在T6h 和T12h，Msi_03A025150（GST）、Msi_10A018630（GST）、Msi_11B013970（GST）、BGI_novel_G001892（GST）上調(diào)表達(dá)，攜帶棉花GST的轉(zhuǎn)基因煙草也增強(qiáng)了對(duì)氧化脅迫的抗性[44]。GST轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對(duì)低溫脅迫的抗性顯著提高，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將鹽地堿蓬的GST基因轉(zhuǎn)入低溫敏感水稻品種中花11 號(hào)中，并對(duì)T4代轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的抗低溫特性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，低溫處理后轉(zhuǎn)基因植株的GST活性比未轉(zhuǎn)入這2 種基因的對(duì)照高[45]。在探究細(xì)長(zhǎng)聚球藻對(duì)Cd2+脅迫的耐受性時(shí)發(fā)現(xiàn)，GST 轉(zhuǎn)基因細(xì)長(zhǎng)聚球藻對(duì)Cd2 +脅迫的抗性顯著提高[46]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）最早被發(fā)現(xiàn)的功能是它能催化GSH 與細(xì)胞廢物形成中間體，這個(gè)過(guò)程是細(xì)胞廢物代謝解毒的關(guān)鍵步驟[47]。植物細(xì)胞廢物來(lái)源于細(xì)胞膜碎片或植物次生代謝物，例如，高粱[48]和小麥[49]細(xì)胞膜氧化損害釋放的4 羥基壬烯酸（4-hydroxynonenal）以及植物在受到食草動(dòng)物傷害或病原物侵染后產(chǎn)生的有毒次生代謝物[50]，如美迪紫檀素（medicarpin）或異類黃酮類，它們被谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）催化GSH化后通過(guò)液泡排出體外。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，GST 具有GSH依賴的過(guò)氧化物酶功能（GSH-dependent peroxidaseactivity，GPOX），GPOX 以GSH 作為電子供體，還原脂肪酸和核酸的過(guò)氧化產(chǎn)物。也有研究發(fā)現(xiàn)雜草的GST具有相同的抗氧化功能[51-52]。在毛根復(fù)合大豆中GST 的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)葉片的抗氧化能力，以及提高葉綠素含量和葉綠素?zé)晒獾牧孔有蔥53]，這表明凍害脅迫下新疆野蘋果組培苗可能通過(guò)GSH消除對(duì)其有害的物質(zhì)。

通過(guò)qPCR檢測(cè)，表明與CK相比在T36h時(shí)，基因BGI_novel_G001892（GST）、Msi_03A025150（GST）、Msi_10A018630（GST）下調(diào)表達(dá)，基因Msi_06A008160（GPX）、Msi_11B013970（GST）上調(diào)表達(dá)；在HF24h的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，除了BGI_nov- el_G001892（GST）下調(diào)表達(dá)，Msi_06A008160（GPX）、Msi_03A025150（GST）、Msi_10A018630（GST）、Msi_11B013970（GST）上調(diào)表達(dá)，這表明GSH 不僅通過(guò)自身與自由基以及有毒物質(zhì)反應(yīng)增強(qiáng)新疆野蘋果組培苗抗寒性，同時(shí)GSH 代謝在修復(fù)凍害損傷的過(guò)程中也起著重要作用，然而GSH和GSSG分別可以作為還原形式和氧化形式的電子載體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)，而細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)是否可以作為一種信號(hào)響應(yīng)凍害脅迫還需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

在-3 ℃模擬凍害條件下，新疆野蘋果組培苗形態(tài)和生理指標(biāo)顯示受到的傷害隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷加深，新疆野蘋果組培苗谷胱甘肽代謝途徑中關(guān)鍵基因GPX和GST上調(diào)表達(dá)能夠響應(yīng)凍害脅迫。

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