延 青,楊花榮,王娜娜

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院鼻咽喉科，陜西 延安 716000）

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，主要病理類型為喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）。由于該病早期通常無明顯臨床癥狀，大多數(shù)LSCC 患者就診時已處于具有高侵襲性的晚期階段[1]。盡管手術(shù)和放療可以延長LSCC 患者的生存期，但仍有約30%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致LSCC 患者生存率低的主要原因[2-3]。因此，迫切需要尋找更有效的治療策略。迷迭香酸（rosmarinic acid,RA）是一種常見于唇形科植物中的酚類化合物[4]，具有抗癌活性，能有效抑制肝癌[5]、乳腺癌[6]細(xì)胞的增殖和遷移，還可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)的信號通路。據(jù)報道，RA 可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[7]。但RA 是否能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制LSCC細(xì)胞惡性進展仍不清楚。因此，本研究主要通過觀察RA對LSCC細(xì)胞增殖和遷移的影響，分析其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 藥物及細(xì)胞

RA（批號：M-024）購自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度≥98%。人LSCC細(xì)胞系Hep-2（批號：CCL-23）購自美國ATCC 細(xì)胞庫；人LSCC 細(xì)胞系TU686（批號：A3079）購自上海酶研生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

CCK-8 試劑盒（批號：210508）購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（批號：20200815）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；BCA試劑盒（批號：210317）購自上海碧云天生物公司；Ki-67、MMP-2、MMP-9、GAPDH 兔多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（批號：20210506、20210814、20210913、20210425、20211004）均購自英國Abcam 公司；PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR（批號：210807、210705、210413、210610、210920、210924）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；PI3K/AKT/mTOR 信號通路激活劑胰島素生長因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）重組蛋白（批號：211104）購自美國Med Chem Express公司。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號：LW-80A-Ⅲ）購自上海利聞科學(xué)儀器有限公司，酶標(biāo)儀（型號：BIO-RAD-550）購自北京京科瑞達科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與形態(tài)觀察

將Hep-2 和TU686 細(xì)胞置于含有10% FBS 與90%DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，每3 d 更換1 次培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的Hep-2和TU686 細(xì)胞，于添加20 μmol/L RA、50 μmol/L RA、100 μmol/L RA、10 nmol/mL IGF-1、10 nmol/mL IGF-1+100 μmol/L RA 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h[7]，分別作為低劑量組、中劑量組、高劑量組、IGF-1 組、IGF-1+RA 組，另設(shè)置對照組（正常培養(yǎng)的對數(shù)生長期的Hep-2 和TU686細(xì)胞）。培養(yǎng)48 h后，使用倒置顯微鏡觀察各組Hep-2和TU686細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

1.4 檢測細(xì)胞增殖能力

將各組Hep-2 和TU686 細(xì)胞以2×105個/孔接種到24 孔板中，每組分別設(shè)置6 個復(fù)孔，按照1.3 項下方法分組處理48 h，然后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，5% CO2、37 ℃孵育2 h，利用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度。

1.5 檢測細(xì)胞遷移能力

取對數(shù)生長期的各組Hep-2 和TU686 細(xì)胞，消化重懸。細(xì)胞以2×105個/孔的密度培養(yǎng)于24 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，每孔劃出相等距離線條，于37 ℃、5% CO2的條件下持續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍照，測量劃痕距離，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h的劃痕距離-48 h的劃痕距離）/0 h的劃痕距離×100%。

1.6 檢測蛋白表達水平

使用RIPA 裂解緩沖液提取細(xì)胞中總蛋白。通過BCA 試劑盒測定蛋白濃度，平衡蛋白濃度后，使用10% SDS-PAGE 進行電泳分離獲得蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h。隨后，加入一抗PI3K（1∶3 000）、AKT（1∶3 000）、mTOR（1∶1 000）、p-PI3K（1∶3 000）、p-AKT（1∶3 000）、p-mTOR（1∶1 000）、Ki-67（1∶1 000）、MMP-2（1∶2 500）、MMP-9（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃下孵育過夜，再加入羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000）在室溫下孵育2 h。使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒將蛋白可視化，通過Image J軟件對目標(biāo)條帶的灰度值進行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0 軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Hep-2和TU686細(xì)胞形態(tài)

與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組Hep-2 和TU686 細(xì)胞數(shù)量均減少，細(xì)胞嚴(yán)重皺縮，并有大量細(xì)胞碎片出現(xiàn)，且RA 濃度越高，Hep-2 和TU686細(xì)胞數(shù)量越少；而IGF-1組Hep-2和TU686細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變；與高劑量組比較，IGF-1+RA組Hep-2 和TU686 細(xì)胞數(shù)量增多，貼壁細(xì)胞數(shù)更多，見圖1。

圖1 各組Hep-2和TU686細(xì)胞形態(tài)（×400）

2.2 各組Hep-2和TU686細(xì)胞增殖能力

與對照組比較，在48 h 時低劑量組、中劑量組、高劑量組Hep-2和TU686細(xì)胞OD450值顯著降低（P＜0.05），而IGF-1 組Hep-2 和TU686 細(xì)胞OD450值顯著升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，在48 h 時IGF-1+RA 組Hep-2和TU686細(xì)胞OD450值顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組Hep-2和TU686細(xì)胞的增殖活性

2.3 各組Hep-2和TU686細(xì)胞遷移能力

與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組Hep-2和TU686細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05），而IGF-1 組Hep-2 和TU686 細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，IGF-1+RA 組Hep-2 和TU686細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組Hep-2和TU686細(xì)胞愈合率比較

2.4 各組Hep-2 和TU686 細(xì)胞中增殖、遷移相關(guān)蛋白表達情況

與對照組比較，中劑量組、高劑量組Hep-2 和TU686 細(xì)胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），而IGF-1 組Hep-2 和TU686 細(xì)胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，IGF-1+RA 組Hep-2 和TU686 細(xì)胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖4～5。

圖4 各組Hep-2細(xì)胞中增殖、遷移蛋白表達

圖5 各組TU686細(xì)胞中增殖、遷移蛋白表達

2.5 各組Hep-2 和TU686 細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白表達情況

與對照組比較，中劑量組、高劑量組Hep-2 和TU686細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平顯著降低（P＜0.05），而IGF-1 組Hep-2 和TU686 細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 水平顯著升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，IGF-1+RA組Hep-2和TU686 細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平顯著升高（P＜0.05），見圖6～7。

圖6 各組Hep-2細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白

圖7 各組TU686細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白

3 討論

LSCC發(fā)展到晚期時，較差的預(yù)后和有限的治療方式對患者生命造成嚴(yán)重威脅[8-10]。因此，尋找安全、有效、低毒的治療藥物具有重要意義。RA 作為一種天然活性成分，具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗炎、抗氧化、抗感染和保肝[11-12]。此外，RA 對多種惡性腫瘤（如乳腺癌[6]、肝癌[7]、結(jié)直腸癌[13]和黑色素瘤[14]）的惡性進展具有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，RA 可抑制Hep-2和TU686 細(xì)胞增殖、遷移，這與上述研究一致。有研究證實Ki-67 在癌組織中高表達，參與癌癥的發(fā)展進程[15]；MMP-2、MMP-9 在癌細(xì)胞中高表達，能有效促進癌細(xì)胞的遷移和侵襲，導(dǎo)致癌癥惡化[16]。本研究結(jié)果顯示，RA能降低Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平，表明RA 能夠有效抑制LSCC 細(xì)胞的增殖和遷移，提示RA可能是LSCC的潛在治療藥物。

PI3K/AKT/mTOR 信號通路在癌癥進展中具有關(guān)鍵作用，可調(diào)控多種過程，包括新陳代謝、細(xì)胞生長、存活、遷移和分化[17-18]。研究顯示，PI3K/AKT/mTOR 信號通路的過度激活，參與多種癌癥進展[19-20]。因此，PI3K/AKT/mTOR 信號通路被認(rèn)為是治療癌癥的重要靶點。有研究報道，RA 在體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和腫瘤生長的作用與抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活密切相關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的RA可顯著降低Hep-2和TU686細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 的蛋白表達水平，表明RA 可抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活。因此，可以推測RA 對LSCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用可能與抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路有關(guān)。為了驗證這一機制，本研究在RA 處理的基礎(chǔ)上，使用PI3K/AKT/mTOR 激活劑IGF-1 進行干預(yù)，結(jié)果顯示，IGF-1 可以有效減輕RA 對LSCC 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用。提示RA 對LSCC 細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，RA 可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路，從而抑制LSCC 細(xì)胞增殖、遷移。本研究進一步明確了RA 發(fā)揮抗LSCC 作用的分子機制，為RA 的應(yīng)用提供理論依據(jù)，表明RA 有望成為LSCC 的潛在治療藥物。但需要進一步的體內(nèi)實驗研究來驗證RA 對LSCC的抗癌作用。