王 贇,胡 雯,劉理禮,楊 靜,張 濤

（空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西 西安 710038）

肺癌是我國發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占80%[1]。雖然腫瘤的治療已經(jīng)取得了極大的進展，但是大多數(shù)NSCLC 患者在確診時就已經(jīng)處于中晚期，且腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移，導致患者預后較差，其中骨轉(zhuǎn)移在NSCLC 患者中的發(fā)生率約為40%，患者中位生存時間僅6 個月左右，且骨轉(zhuǎn)移帶來的劇烈疼痛以及運動能力受損，嚴重影響患者的生存質(zhì)量[2-3]，因此，探究更多NSCLC 骨轉(zhuǎn)移的機制以及治療方法非常有必要。腫瘤外泌體可調(diào)控腫瘤的多種病理進程，包括轉(zhuǎn)移、復發(fā)、耐藥等[4]。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）可影響腫瘤的生長、免疫逃逸及順鉑耐藥等[5-7]。外泌體miRNA 在腫瘤的診斷和治療中具有廣泛的應用前景，外泌體中多種miRNAs 都被證實具有調(diào)控NSCLC 發(fā)生發(fā)展的功能，Wang 等[8]研究表明，NSCLC 外泌體miR-17-5p 通過靶向PTEN 促進破骨細胞分化。miR-20a-5p 在NSCLC 中顯著高表達，并且可促進腫瘤血管新生[9]。但是關(guān)于miR-20a-5p 對NSCLC骨轉(zhuǎn)移的影響及機制目前尚不清楚，本文探究NSCLC外泌體中miR-20a-5p 的表達及其對骨轉(zhuǎn)移的影響及機制，以期為NSCLC骨轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人支氣管上皮細胞系16HBE 和人NSCLC 細胞系A(chǔ)549、PC9和H1299購自中科院上海細胞庫；小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自美國ATCC。TRIzol試劑盒和Lipofectamine 2000 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；PrimeScript? RT reagent Kit和SYBR?Prime Script? RTPCR Kit 購自日本TaKaRa 公司；6 周齡的雌性Balb/c裸鼠[動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（京）2022-0052]共25 只購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CD9、CD81、HSP70、SP1、CD147、GAPDH 抗體，山羊抗兔IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，將16HBE、A549、PC9 和H1299 細胞使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)，RAW264.7 細胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 外泌體的提取與鑒定

收集細胞培養(yǎng)上清液10 mL，3 000 r/min離心10 min去除細胞和凋亡碎片，取上清使用0.22 μm 的濾膜過濾，去除細胞碎片，然后100 000 r/min離心60 min后收集的白色沉淀即為外泌體。將所收集的外泌體用10 mL 無菌PBS 重懸，100 000 r/min 離心60 min 清洗外泌體，收集外泌體沉淀，通過透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)，Western blot 法檢測外泌體標志蛋白表達。16HBE、A549、PC9、H1299 以及轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimic Negative Control（miR-NC）和miR-20a-5p mimic 的A549細胞外泌體分別記為16HBE exo、A549 exo、PC9 exo、H1299 exo、miR-NC exo和miR-20a-5p exo。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染與分組

將A549 細胞接種于6 孔板中，待細胞生長至密度達60%時進行轉(zhuǎn)染，根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書，將125 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基與2 μg miR-20a-5p mimic（或miR NC）在1.5 mL 離心管中混勻，取5 μL Lipofectamine 2000 用Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋至125 μL，將上述兩種溶液混勻后室溫靜置15 min，6 孔板中更換為800 μL 培養(yǎng)基，然后將靜置后的混合溶液滴加至6 孔板中，混勻后于細胞培養(yǎng)箱中孵育8 h，然后更換為新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。

將A549 和RAW264.7 細胞分別與10 μg/mL 的16HBE exo、A549 exo、miR-NC exo、miR-20a-5p exo 以及等體積的PBS 共孵育24 h，設(shè)為16HBE exo 組、A549 exo組、miR-NC exo組、miR-20a-5p exo組和PBS組。

1.5 qRT-PCR檢測miR-20a-5p的表達

使用TRIzol 試劑提取各組細胞及外泌體中的總RNA，根據(jù)PrimeScript ? RT reagent Kit 說明書合成cDNA，根據(jù)SYBR?Prime Script ? RT-PCR Kit 進行qRT-PCR 反應，反應程序為95 ℃ 3 min，1 次循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40次循環(huán)。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算miR-20a-5p相對表達量，引物序列見表1。

表1 miR-20a-5p和U6引物序列

1.6 Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力

將各組A549細胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋至1×105/mL，取稀釋后的細胞溶液100 μL 接種于小室中，6 孔板中加入600 μL DMEM 完全培養(yǎng)基，小室放于板中，下層培養(yǎng)基沒過小室底部，培養(yǎng)24 h 后取出小室，清洗后底部用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，清洗晾干后，拍照并統(tǒng)計細胞遷移數(shù)。將上述小室更換為鋪有50 μL Matrigel 膠的小室，其余步驟同上，用于檢測細胞侵襲能力。

1.7 破骨細胞分化與TRAP染色

將RAW264.7 細胞接種于24 孔板中，調(diào)整濃度為1×105個/孔，細胞生長至匯合度達70%～80%時，將24孔板中每孔更換為含30 ng/mL 巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）和50 ng/mL核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）的α-MEM，并根據(jù)分組加入對應的外泌體，使培養(yǎng)液中的外泌體濃度為10 μg/mL，每2 天更換1 次培養(yǎng)基，共誘導4 d，然后去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，各孔用10%福爾馬林中性緩沖液固定5 min，清洗孔板3 次，采用TRAP 染色試劑盒染色，去離子水清洗3次，顯微鏡下觀察拍照。

1.8 小鼠體內(nèi)實驗

將6 周齡的雌性Balb/c 裸鼠隨機分為PBS 組(A組)、16HBE exo 組(B 組)、A549 exo 組(C 組)、miR-NC exo組(D 組)和miR-20a-5p exo 組(E 組)，每組5 只。各組小鼠分別注射10 μg 的PBS、16HBE exo、A549 exo、miR-NC exo 和miR-20a-5p exo，每周注射1 次，共注射4 周。注射外泌體4 周后，A549 細胞用無菌PBS 重懸并稀釋至1×106/mL，用1%戊巴比妥鈉溶液（10 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠，然后取100 μL A549 細胞接種于小鼠的左心室，28 d 后解剖，取小鼠的股骨和脛骨，制作病理切片觀察腫瘤細胞轉(zhuǎn)移情況。

1.9 HE染色

使用石蠟包埋各組小鼠的骨組織切片，用二甲苯脫蠟，經(jīng)100%、95%、90%、80%、75%乙醇水化，蘇木素染色5 min，伊紅室溫染色2 min，去除染色液，再于90%、95%、100%乙醇中浸泡1 min，二甲苯浸泡2 次，每次1 min，中性樹脂封片后于顯微鏡下觀察。

1.10 Western blot檢測Sp1/CD147信號通路變化

根據(jù)蛋白裂解液說明書提取各組細胞或外泌體總蛋白，BCA 蛋白定量后，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，穩(wěn)壓80 V，電泳40 min，待蛋白進入分離膠后調(diào)整電壓為120 V，分離90 min；分離后轉(zhuǎn)膜，穩(wěn)定電流300 mA，時間90 min；PVDF 膜與CD9、CD81、HSP70、SP1、CD147、GAPDH 抗體低溫孵育過夜，TBST 洗膜后，與山羊抗兔IgG 室溫孵育1 h，洗膜后ECL 試劑盒顯影，拍照。

1.11 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism7.0 軟件繪制圖形，采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定結(jié)果

透射電鏡下觀察到A549 exo、PC9 exo、H1299 exo、16HBE exo 為具有雙層膜的囊泡樣結(jié)構(gòu)，粒徑在30～100 nm（圖1a）。外泌體標志蛋白檢測結(jié)果顯示，A549 exo、PC9 exo、H1299 exo、16HBE exo 均表達CD9、CD81、HSP70（圖1b），說明A549 exo、PC9 exo、H1299 exo、16HBE exo均符合外泌體的形態(tài)和生物學特征。

2.2 miR-20a-5p在NSCLC及其外泌體中顯著高表達

NSCLC 細胞A549、PC9 和H1299 中miR-20a-5p 表達水平顯著高于其在支氣管上皮細胞系16HBE 中的表達（P＜0.001），且A549 exo、PC9 exo 和H1299 exo 中miR-20a-5p 的表達高于16HBE exo（P＜0.001），其中A549 細胞表達水平最高，所以選擇A549 細胞進行后續(xù)研究。與miR-NC exo 相比，miR-20a-5p exo 中miR-20a-5p 表達顯著上調(diào)（P＜0.001），見圖2，獲得的miR-20a-5p exo為高表達miR-20a-5p的外泌體。

圖2 各種細胞及外泌體中miR-20a-5p表達水平比較

2.3 miR-20a-5p促進NSCLC細胞的遷移及侵襲

與PBS 組相比，A549 exo 組A549 細胞遷移和侵襲數(shù)顯著增加（P＜0.001），而16HBE exo組細胞遷移和侵襲數(shù)量無顯著變化（圖3a）；與miR-NC exo 組相比，miR-20a-5p exo組A549細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著增加（P＜0.001），見圖3b，說明外泌體miR-20a-5p可促進A549細胞的遷移和侵襲。

圖3 各組細胞遷移和侵襲細胞數(shù)目比較

2.4 NSCLC 外泌體轉(zhuǎn)移miR-20a-5p 促進破骨細胞分化

qRT-PCR 檢測顯示，A549 exo 組RAW264.7 細胞中miR-20a-5p 表達顯著高于PBS 組（P＜0.001），而16HBE exo 組和PBS 組miR-20a-5p 比較無顯著差異（圖4a）。miR-20a-5p exo 組RAW264.7 細胞中miR-20a-5p 表達顯著高于miR-NC exo 組（P＜0.001），說明外泌體可向RAW264.7 細胞轉(zhuǎn)移miR-20a-5p（圖4b）。TRAP 染色結(jié)果顯示，A549 exo 組破骨細胞形成數(shù)顯著多于PBS 組（P＜0.001），16HBE exo 組和PBS 組破骨細胞形成數(shù)無顯著差異（圖4c）。與miR-NC exo 組相比，miR-20a-5p exo 組破骨細胞形成顯著增加（P＜0.001），說明外泌體miR-20a-5p 可促進破骨細胞的分化（圖4d）。

圖4 外泌體轉(zhuǎn)移miR-20a-5p促進破骨細胞分化

2.5 外泌體miR-20a-5p 促進NSCLC 細胞在小鼠體內(nèi)的骨轉(zhuǎn)移

HE 染色結(jié)果顯示，A 組和B 組骨組織骨小梁結(jié)構(gòu)完整，組織中有少量腫瘤細胞，骨髓腔相對完整，病變較少；C組小鼠骨組織附近出現(xiàn)大量腫瘤細胞，腫瘤細胞緊密排列，骨小梁顯著破壞，核漿比例嚴重失調(diào)，病變顯著。E 組小鼠骨組織中腫瘤細胞面積更大，骨小梁破壞更加嚴重，病變較D 組更加顯著（圖5）。說明NSCLC 外泌體以及外泌體miR-20a-5p 可顯著促進腫瘤在小鼠體內(nèi)的骨轉(zhuǎn)移。

圖5 各組小鼠腫瘤骨轉(zhuǎn)移水平比較（×200）

2.6 外泌體miR-20a-5p激活Sp1/CD147信號通路

Western blot 結(jié)果顯示，A549 exo 組RAW264.7細胞中Sp1 和CD147 表達顯著高于16HBE exo 組和PBS 組（P＜0.001），說明A549 exo 可促進破骨細胞中Sp1/CD147 信號通路的激活。與miR-NC exo組相比，miR-20a-5p exo 組RAW264.7 細胞中Sp1 和CD147 表達亦顯著上調(diào)（P＜0.001），說明外泌體通過轉(zhuǎn)移miR-20a-5p 促進Sp1/CD147 信號通路的激活（圖6）。

圖6 各組細胞Sp1和CD147表達水平比較

3 討論

NSCLC 是高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病機制尚不明確，但有研究指出，NSCLC 的發(fā)病與吸煙、二手煙、不良飲食習慣、生活環(huán)境等密切相關(guān)[10]。NSCLC 惡性程度高，患者在確診時往往已經(jīng)處于中晚期，其5年生存率不足5%，預后差[11]。大部分患者在癌癥晚期出現(xiàn)腫瘤骨轉(zhuǎn)移，嚴重影響生活質(zhì)量，因此探究NSCLC 骨轉(zhuǎn)移的機制，對其治療至關(guān)重要。外泌體是由大多數(shù)細胞分泌的胞外囊泡，由于攜帶多種遺傳物質(zhì)，如DNA、miRNA、circRNA 等，可從基因?qū)用婊蜣D(zhuǎn)錄層面調(diào)控腫瘤細胞的惡性生物學行為[12-13]，其中外泌體miRNA 具有廣泛的臨床應用前景，因此越來越多的研究定位于外泌體miRNA。

miR-20a-5p 是近年腫瘤研究的miRNA 之一，有研究表明，miR-20a-5p 可通過誘導血管新生從而促進NSCLC的生長和轉(zhuǎn)移[9]。Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a-5p可通過抑制NR4A3 表達而促進膀胱癌轉(zhuǎn)移。Cheng等[15]研究表明，miR-20a-5p 亦可通過抑制Smad4 表達而促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移，提示miR-20a-5p 可能是調(diào)控NSCLC 發(fā)生發(fā)展的重要分子。此外，相關(guān)研究報道，miRNAs 失調(diào)可導致肺癌的發(fā)生及骨轉(zhuǎn)移[16]。肺腺癌細胞和破骨細胞中發(fā)現(xiàn)部分miRNAs 可選擇性納入外泌體，并將其釋放到細胞外空間，是骨轉(zhuǎn)移“惡性循環(huán)”的潛在媒介[17]。然而有關(guān)外泌體miR-20a-5p 與肺癌相關(guān)的報道有限，因此本研究探究了外泌體miR-20a-5p 調(diào)控NSCLC 骨轉(zhuǎn)移的可能作用機制，發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p 在NSCLC 細胞以及外泌體中均顯著高表達，提示miR-20a-5p 或外泌體miR-20a-5p 可能具有調(diào)控NSCLC 發(fā)生發(fā)展的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與NSCLC外泌體共孵育后，A549細胞中miR-20a-5p表達顯著上調(diào)；與高表達miR-20a-5p 的外泌體共孵育后，A549 細胞中miR-20a-5p 表達會進一步上調(diào)，說明NSCLC 外泌體可向腫瘤細胞轉(zhuǎn)移miR-20a-5p。且與高表達miR-20a-5p的外泌體共孵育后，A549細胞的遷移和侵襲能力均顯著增加。NSCLC 外泌體通過轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移已得到證實，Ma 等[18]研究表明，腫瘤外泌體可傳遞miR-3157-3p 而促進NSCLC 的血管新生和轉(zhuǎn)移；Kim 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-1260b 可通過抑制HIPK2 從而促進NSCLC 的轉(zhuǎn)移。因此，本研究推測，NSCLC 外泌體可通過轉(zhuǎn)移miR-20a-5p進而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。

為了探究外泌體miR-20a-5p 是否對NSCLC 骨轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用，本研究將NSCLC 外泌體以及高表達miR-20a-5p 的外泌體與RAW264.7 細胞共孵育，發(fā)現(xiàn)NSCLC 外泌體作用后，RAW264.7 細胞向破骨細胞分化顯著增加，高表達miR-20a-5p 的外泌體可進一步促進破骨細胞的分化。研究表明，腫瘤的骨轉(zhuǎn)移是腫瘤細胞先通過分泌細胞因子促進破骨細胞成熟[20]。破骨細胞可破壞骨骼基質(zhì)，從骨基質(zhì)中釋放出大量促進腫瘤生長的細胞因子，進而實現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[21]。本研究在小鼠體內(nèi)進行了驗證，發(fā)現(xiàn)接受NSCLC 外泌體的小鼠腫瘤骨轉(zhuǎn)移顯著增加，給予高表達miR-20a-5p 的外泌體小鼠腫瘤骨轉(zhuǎn)移進一步形成，說明外泌體miR-20a-5p可促進NSCLC 的骨轉(zhuǎn)移。在機制上，本研究初步探究發(fā)現(xiàn)，NSCLC 外泌體誘導后破骨細胞中Sp1/CD147 信號通路被顯著激活，外泌體miR-20a-5p 亦可進一步促進破骨細胞中Sp1/CD147 信號通路的激活。Sp1/CD147 信號通路是調(diào)控腫瘤骨轉(zhuǎn)移的重要通路。Kong 等[22]研究指出，特異性Sp1 結(jié)合位點位于CD147啟動子的CpG 區(qū)，Sp1 表達增加，CD147 表達上調(diào)。Wang 等[23]研究表明，在肺癌中，CD147 的表達可誘導IL-8 的分泌而促進破骨細胞的生成。因此，本研究得出，NSCLC 外泌體miR-20a-5p 可通過誘導Sp1/CD147信號通路激活進而促進破骨細胞的分化。

綜上所述，NSCLC 外泌體可通過轉(zhuǎn)移miR-20a-5p而激活Sp1/CD147 信號通路誘導破骨細胞的生成，進而促進腫瘤的骨轉(zhuǎn)移，但外泌體miR-20a-5p 的臨床應用還需進一步探究。