姜春玲，韓姝禎，張政雄,3*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院；3.科技廳產(chǎn)學(xué)研合作示范基地，福建 寧德 352100)

在我國(guó)，茶種植和相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)菄?guó)家所提倡的科技下鄉(xiāng)、精準(zhǔn)扶貧及鄉(xiāng)村振興等的重要產(chǎn)業(yè)之一[1,2]。但隨著我國(guó)各地的茶樹栽培面積隨年逐漸增加，茶樹種植品系過少，過度使用化學(xué)肥料和農(nóng)業(yè)等原因，造成各地茶園的各種霉菌病害日益嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了各種品系茶葉或茶油的產(chǎn)量和品質(zhì)，也同時(shí)限縮和制約茶葉相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和營(yíng)收，尤其以茶樹炭疽?。℅loeosporium sp.and Colletotrichum sp.）較為好發(fā)且嚴(yán)重的茶樹霉菌病害，在我國(guó)各地茶樹種植產(chǎn)區(qū)均有出現(xiàn)或暴發(fā)疾病，尤其在高溫潮濕的季節(jié)或年份，發(fā)病情況更為頻繁嚴(yán)重，影響茶農(nóng)收益和茶產(chǎn)業(yè)獲利甚巨[3,4]。

本研究擬找尋具有高抑制多種茶樹炭疽病原活性的耐高溫多功能溶磷生防微生物，其耐高溫生長(zhǎng)特性可應(yīng)用于生物肥料制作[5,6]，而中溫特性則可施放于茶園田間和幫助茶樹等植物的生長(zhǎng)和對(duì)抗多種茶樹炭疽病原的入侵和感染[7]。因此也擬應(yīng)用這些耐高溫多功能溶磷生防微生物于肥力豐富、高可溶性磷濃度及強(qiáng)抑制多種茶樹炭疽病原活性的多功能生防生物磷肥的制備、工業(yè)化量產(chǎn)及商品化，深具有機(jī)農(nóng)業(yè)、資源回收、環(huán)境保護(hù)、綠色有機(jī)茶業(yè)等永續(xù)經(jīng)營(yíng)發(fā)展的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試耐高溫多功能溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株

供試耐高溫多功能溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株為凝結(jié)芽孢桿菌分離株Bacillus coagulans isolate ppx-13，分離自福建省福鼎市福建品品香茶業(yè)有限公司管陽(yáng)河山茶園的福鼎白茶茶樹根際土壤，采樣日期為2021年01月23日[7]。

1.2 供試茶樹炭疽病原分離株

供試茶樹炭疽病原分離株為茶樹炭疽病霉菌病原分離株N425、茶樹炭疽病霉菌病原分離株ZN81及油茶炭疽病霉菌病原分離株DH9，均為本實(shí)驗(yàn)室于我國(guó)各地茶園中患茶樹炭疽病的茶樹病葉上所分離出。

1.3 中溫和耐高溫溶磷活性偵測(cè)

分別以PVK培養(yǎng)基、以磷礦石為唯一磷源的改良式PVK培養(yǎng)基及以植酸鈣為唯一磷源的改良式PVK培養(yǎng)基平板檢測(cè)法于25和50℃培養(yǎng)5天后偵測(cè)供試耐高溫微生物的中溫和耐高溫溶磷酸鈣、溶磷礦石及植酸酶活性[5]。

1.4 中溫和耐高溫酶活性偵測(cè)

分別以含可溶性淀粉為唯一碳源的改良式Mandels-Reese培養(yǎng)基、含羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的改良式Mandels-Reese培養(yǎng)基、含幾丁質(zhì)為唯一碳源的改良式Mandels-Reese培養(yǎng)基、含果膠質(zhì)為唯一碳源的改良式Mandels-Reese培養(yǎng)基、含木聚糖為唯一碳源的改良式Mandels-Reese培養(yǎng)基、三丁酸甘油酯培養(yǎng)基及脫脂奶粉培養(yǎng)基平板檢測(cè)法分別于25℃和50℃培養(yǎng)5天后偵測(cè)供試耐高溫微生物的中溫和耐高溫淀粉酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、果膠質(zhì)酶、木聚糖酶、脂肪酶及蛋白酶活性[5]。

1.5 中溫抑制茶葉炭疽病病原菌活性測(cè)試

以本實(shí)驗(yàn)室所分離茶葉炭疽病病原菌-膠孢炭疽菌N425、茶樹炭疽病霉菌病原分離株ZN81及油茶炭疽病霉菌病原分離株DH9為靶標(biāo)菌株。其菌絲體液態(tài)發(fā)酵液以馬鈴薯葡萄糖液態(tài)培養(yǎng)基于25℃和200rpm培養(yǎng)5天后收獲得，并以無(wú)菌操作方式進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)操作。于4℃及10,000rpm離心20分鐘下，傾倒上清液取得濕菌絲體細(xì)胞沈淀固型物。濕菌絲體細(xì)胞沈淀固型物使用2倍重量的無(wú)菌生理食鹽水進(jìn)行重新懸浮，以制備菌絲體懸浮液。取適量約200克的菌絲體懸浮液以組織粉碎機(jī)經(jīng)約10秒-15秒的粉碎后，再以顯微鏡檢計(jì)數(shù)經(jīng)此適當(dāng)粉碎條件的菌絲體懸浮液的菌絲片段數(shù)，之后以無(wú)菌生理食鹽水進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋以制備成每mL約有1×106菌絲片段的菌絲懸浮液。之后在分別涂抹100μL的每mL約有1×106菌絲片段的菌絲懸浮液至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（NA）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板（PDA）上，再以平板檢測(cè)法于25℃培養(yǎng)5天后，進(jìn)行供試耐高溫微生物的中溫抑制茶葉炭疽病病原菌活性偵測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（means±SD）表示。以The Independent-Sample T-Test比較平均值之間差異。以Statistical Analysis System Software在Tukey's Honestly Significant Difference（P=0.05、0.01及0.001）條件下用the General Linear Model using type II sum of squares模式進(jìn)行the variance homogeneity determination（ANOVA）分析[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 多樣性溶磷活性

如表1所示，耐高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13于25℃和50℃培養(yǎng)時(shí)，于3種不同溶磷活性偵測(cè)培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)和表現(xiàn)多樣性溶磷活性，而于50℃培養(yǎng)時(shí)優(yōu)于25℃，指出此菌于高溫時(shí)較容易生長(zhǎng)和表現(xiàn)多樣性溶磷活性。耐高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13也有植酸酶活性，因此同時(shí)可溶解無(wú)機(jī)和有機(jī)磷源。

表1 耐高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13于25和50℃培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)多樣性溶磷活性

2.2 多樣性酶活性

如表2所示，耐高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13于25℃和50℃培養(yǎng)時(shí)，可表現(xiàn)7種分解有機(jī)物活性，且于50℃培養(yǎng)時(shí)優(yōu)于25℃，指出此菌于高溫時(shí)較容易生長(zhǎng)和表現(xiàn)多樣性酶活性。應(yīng)用耐高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13于茶園土壤，可期有加速有機(jī)質(zhì)分解與碳氮磷循環(huán)的功能，有助于土壤養(yǎng)分的流動(dòng)及提供營(yíng)養(yǎng)給植物和土壤微生物，進(jìn)而優(yōu)化土壤環(huán)境和增進(jìn)土壤生態(tài)系的多樣性[7]。接種耐高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13于堆肥或生物肥料中，其所表現(xiàn)的耐高溫生長(zhǎng)和多樣性酶活性將可加速堆肥或生物肥料的腐熟，以縮短其工業(yè)化量產(chǎn)時(shí)間，并可促進(jìn)養(yǎng)分流動(dòng)和微生物族群的生長(zhǎng)，以提升其肥力和品質(zhì)[5,6]。

表2 耐高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13于25和50℃培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)多樣性酶活

2.3 抑制多種茶樹炭疽病原活性

如表3所示，耐高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13于25℃培養(yǎng)時(shí)，于NA或PDA上均可表現(xiàn)抑制3種茶樹炭疽病原活性，且PDA平板檢測(cè)法所得的結(jié)果優(yōu)于NA。此結(jié)果指出，在霉菌生長(zhǎng)代謝較佳的PDA，高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13仍可表現(xiàn)較佳抑制3種茶樹炭疽病原活性，因可推知在茶園土壤環(huán)境適合茶樹炭疽病原生長(zhǎng)時(shí)，高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13應(yīng)可對(duì)其維持高抑制活性，以保護(hù)茶樹不受其侵染。

表3 耐高溫多功能性溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13于25℃培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)抑制茶樹炭疽病原分離株活性

3 結(jié)論

本研究成功從白茶茶樹根際土壤中分離開發(fā)一株耐高溫多功能溶磷生防凝結(jié)芽孢桿菌分離株ppx-13，有多樣性中溫和耐高溫溶磷和酶活活性及中溫抑制多種茶樹炭疽病原活性，多種未來可應(yīng)用于各類非糧農(nóng)業(yè)、食品或禽畜糞等廢棄物以進(jìn)行茶樹多功能生防生物肥料、生物農(nóng)藥或各式微生物制劑的開發(fā)制備、工業(yè)化量產(chǎn)及商品化。