童克婷,王森林,李景然,蔡昭方,顏宇輝,朱健生(1.安徽醫(yī)科大學(xué)婦幼醫(yī)學(xué)中心,安徽省婦幼保健院,a.醫(yī)學(xué)遺傳中心,b.婦產(chǎn)科,合肥 30000;.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腎內(nèi)科,國家慢性腎病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,廣東省慢性腎病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,廣州510515)

頸項(xiàng)透明層(nuchal translucency,NT)是指妊娠11～13+6W時(shí)在胎兒的頸后部皮膚下的液體生理性積聚,是孕早期產(chǎn)前超聲篩查的重要指標(biāo)[1]。研究發(fā)現(xiàn),NT增厚與胎兒的結(jié)構(gòu)缺陷、染色體異常和遺傳疾病相關(guān),會(huì)導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[2]。染色體核型分析技術(shù)是產(chǎn)前診斷中首選的方法,可檢出與NT增厚相關(guān)的染色體異常等。然而,很多胎兒的遺傳性綜合征及結(jié)構(gòu)畸形是由于某些染色體微小的不平衡變異導(dǎo)致的,而傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)無法檢出。單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)(single nucleotide polymorphism array, SNP array)是一種高分辨率、高通量的全基因組DNA拷貝數(shù)變異檢測技術(shù),主要用于檢測染色體微缺失和微重復(fù),是產(chǎn)前診斷方法中的一線選擇[3]。本研究對(duì)516例NT增厚胎兒的羊水細(xì)胞進(jìn)行分析,旨在運(yùn)用SNP array技術(shù)聯(lián)合核型分析探討胎兒NT增厚與染色體異常相關(guān)性,以期為產(chǎn)前遺傳咨詢及胎兒預(yù)后評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 選擇2020年3月至2023年3月于我院超聲科經(jīng)產(chǎn)前超聲檢查診斷為胎兒NT增厚的孕婦516例為研究對(duì)象,年齡18～45歲,中位年齡29歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)單胎;(2)NT值≥2.5 mm;(3)孕周11～13+6W;(4)行侵入性產(chǎn)前診斷,包括核型分析和SNP array檢測。根據(jù)NT值分組為:2.5～2.9 mm組183例、3.0～3.9 mm組261例、4.0～4.9 mm組46例和≥5 mm組26例;根據(jù)是否合并其他超聲異常,分為單純性NT增厚組360例和合并其他異常指征組156例。本研究經(jīng)安徽省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào):YYLL2022-zd2022-1-2-FA-01),孕婦或其家屬均知情同意。

1.2儀器與試劑 LOGIQ E9彩色多普勒超聲診斷儀和配套三維超聲容積探頭(2～5 MHz)購自美國GE公司,原位載玻片培養(yǎng)盒(杭州寶榮公司),羊水培養(yǎng)基(美國Gibco公司),DNA提取試劑(QIAamp DNA Blood Mini Kit,德國Qiagen公司),全基因組擴(kuò)增試劑盒、Illumina Infinium HD試劑盒(美國Illumina公司),染色體分散儀(美國Thermotron公司),GLS-120全自動(dòng)染色體核型掃描捕獲系統(tǒng)(德國Leica公司),Nanodrop 2000分光光度計(jì)(美國Nanodrop公司),雜交爐、洗滌工作站和芯片掃描儀均購自美國Affymetrix公司。

1.3超聲檢查 由超聲醫(yī)師使用LOGIQ E9彩色多普勒超聲診斷儀,配套經(jīng)腹部三維超聲容積探頭,探頭頻率設(shè)置為2～5 MHz,檢查孕周為11～13+6W,嚴(yán)格按照國際婦產(chǎn)科超聲協(xié)會(huì)(International Society of Ultrasound in Obstetrics and Gynecology,ISUOG)發(fā)布的妊娠早期胎兒超聲檢查指南中的NT值質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀,以NT值≥2.5 mm納入研究。重復(fù)測量3次,取其最大值。

1.4侵入性產(chǎn)前診斷 孕婦于妊娠18～26 W時(shí),由具有產(chǎn)前診斷資質(zhì)的醫(yī)師在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù),抽取羊水34 mL。其中24 mL羊水經(jīng)原位培養(yǎng)用于核型分析,10 mL用于SNP array檢測。

1.5實(shí)驗(yàn)室檢測

1.5.1核型分析 用原位培養(yǎng)法對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),收獲細(xì)胞后,制片染色,通過上機(jī)掃描可獲得核型信息。用Cytovision核型分析軟件計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞分裂中期染色體核型,并分析5個(gè)核型,如有異常核型,增加計(jì)數(shù)量。核型結(jié)果按照國際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名系統(tǒng)(ISCN2020)進(jìn)行描述。

1.5.2SNP array檢測 按照試劑盒說明書提取全基因組DNA,Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測DNA濃度后,-20 ℃保存。采用Affymetrix CytoScan 750K Array分析平臺(tái)對(duì)羊水細(xì)胞DNA進(jìn)行檢測,用Chromosome Analysis Suite(ChAS)2.0分析軟件對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)過程按照廠家的標(biāo)準(zhǔn)操作說明進(jìn)行。所得結(jié)果與國際基因組變異數(shù)據(jù)庫(the Database of Genomic Variants,http://dgv.tcag.ca/)對(duì)比剔除常見的多態(tài)性拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs),其余CNVs通過檢索DECIPHER(http://decipher.sanger.ac.uk/)、ISCA(http://dbsearch.clincalgenome.org/search/)、ClinGen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbvar/clingen/)、ClinVar(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、OMIM(http://omim.org/)和PubMed(http://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)等數(shù)據(jù)庫,綜合所得數(shù)據(jù)庫報(bào)道信息判讀CNVs的臨床意義。按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)指南判讀拷貝數(shù)變異的臨床意義[4],將CNVs分為3大類5級(jí):(1)致病性CNVs(pathogenic CNVs, pCNVs);(2)良性CNVs(benign CNVs);(3)臨床意義未明CNVs(variants of unknown significance CNVs, VUS-CNVs);(4)可能致病性CNVs(likely pathogenic CNVs, lpCNVs);(5)可能良性CNVs(likely benign CNVs)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用ROC曲線計(jì)算曲線下面積,通過敏感性和特異性得到約登指數(shù),從而確定侵入性檢查的最佳截?cái)嘀?。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NT增厚胎兒染色體核型分析結(jié)果 核型分析技術(shù)共檢出致病性染色體異常55例(表1),包括47例染色體非整倍體、3例染色體缺失綜合征、5例衍生染色體(2號(hào)、5號(hào)、9號(hào)、10號(hào)和18號(hào)),致病性染色體異常的檢出率為10.66%(55/516)。

表1 NT增厚胎兒核型分析致病性結(jié)果(n=516)

47例染色體非整倍體中,21-三體35例、18-三體6例和性染色體異常6例(克氏綜合征3例、特納綜合征1例、超雌綜合征2例);3例染色體缺失綜合征為貓叫綜合征46,XN,del(5)(p14) 1例、18p缺失綜合征46,XN,del(18)(p11.2) 1例和WAGR綜合征46,XN,del(11)(p12p14)1例;5例衍生染色體為46,XN,der(2) 1例、46,XN,der(5) 1例、46,XN,der(9) 1例、46,XN,der(10) 1例和46,XN,der(18) 1例。核型分析技術(shù)還檢出7例臂間倒位和8例染色體多態(tài)性改變。7例臂間倒位為46,XN,inv(9)(p12q13) 6例、46,XN,inv(18) 1例;8例染色體多態(tài)性改變包括46,XN,1qh+ 2例、46,XN,9qh+ 2例、46,XN,13pstk+ 1例、46,XN,15pstk+ 1例、46,XN,15ps+ 1例和46,XN,16qh+ 1例。

2.2NT增厚胎兒SNP array結(jié)果 SNP array技術(shù)共檢出致病性染色體異常70例(表2),包括47例染色體非整倍體(21-三體35例、18-三體6例和性染色體異常6例)和23例pCNVs,檢出率為13.57%(70/516)。其中47例染色體非整倍體和3例染色體缺失綜合征的SNP array檢出結(jié)果與核型分析結(jié)果基本一致。核型分析檢出的5例衍生染色體(2號(hào)、5號(hào)、9號(hào)、10號(hào)和18號(hào)),經(jīng)SNP array技術(shù)驗(yàn)證,2號(hào)衍生染色體是由于2q37.3區(qū)域斷裂缺失后與18q21.1q23區(qū)域重排形成,5號(hào)衍生染色體是由于5p15.33p15.31區(qū)域斷裂缺失后與5p15.31p11區(qū)域重排形成,9號(hào)衍生染色體是由于9p24.3p23區(qū)域斷裂缺失后與13q31.1q34區(qū)域重排形成,10號(hào)衍生染色體是由于10q26.3區(qū)域斷裂缺失后與4q32.2q35.2區(qū)域重排形成,18號(hào)衍生染色體是由于18p11.32p11.31區(qū)域斷裂缺失后與7q34q36.3區(qū)域重排形成。另外,SNP array技術(shù)還檢出48例核型正常的CNVs,包括15例pCNVs(2.91%,15/516)、2例lpCNVs(0.39%,2/516)和31例VUS-CNVs(6.01%,31/516)。核型分析技術(shù)額外檢出的7例臂間倒位和8例染色體多態(tài)性改變,而SNP array未能檢出。

表2 NT增厚胎兒SNP array致病性結(jié)果

2.3NT增厚胎兒染色體核型分析與SNP array致病性染色體異常的比較 根據(jù)不同的檢測技術(shù),將516例NT增厚胎兒分成核型分析組和SNP array組。核型分析技術(shù)檢出致病性染色體異常55例,檢出率為10.66%(55/516);SNP array技術(shù)檢出致病性染色體異常70例,檢出率為13.57%(70/516)。對(duì)兩組致病性染色體異常的檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.048,P=0.152),但與核型分析技術(shù)相比較,SNP array技術(shù)對(duì)致病性染色體異常的檢出率要額外多出2.91%(15/516)。

2.4不同NT值分組中胎兒致病性染色體異常的比較 根據(jù)NT值,將516例胎兒分成4組:2.5～2.9 mm組、3.0～3.9 mm組、4.0～4.9 mm組和≥5 mm組。2.5～2.9 mm組胎兒183例,致病性染色體異常的檢出率為7.10%(13/183);3.0～3.9 mm組胎兒261例,致病性染色體異常的檢出率為13.79%(36/261);4.0～4.9 mm組胎兒46例,致病性染色體異常的檢出率為23.91%(11/46);≥5 mm組胎兒26例,致病性染色體異常的檢出率為38.46%(10/26)。對(duì)4組致病性染色體異常的檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.472,P=0.000),即隨著NT厚度增加,胎兒染色體異常的發(fā)生率隨之增加。

2.5NT增厚是否合并其他異常指征分組中胎兒致病性染色體異常的比較 根據(jù)是否合并其他異常指征(包括高齡、超聲異常、血清學(xué)異常和不良妊娠史),將516例NT增厚胎兒分為單純NT增厚組和合并其他異常指征組。單純性NT增厚組胎兒360例,致病性染色體異常的檢出率為8.33%(30/360);NT增厚合并其他異常指征胎兒156例,致病性染色體異常的檢出率為25.64%(40/156)。對(duì)兩組異常染色體的檢出率進(jìn)行比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.805,P=0.000),即NT增厚合并其他異常指征時(shí),其染色體異常的發(fā)生率增加(表3)。

表3 NT增厚組是否合并其他異常指征分組中胎兒致病性染色體異常的比較

2.6不同分組中NT增厚胎兒行侵入性檢查的截?cái)嘀?根據(jù)是否合并其他異常指征,將516例NT增厚胎兒分為單純NT增厚組和合并其他異常指征組。采用ROC曲線計(jì)算曲線下面積,單純NT增厚組為0.649(95%置信區(qū)間:0.539～0.759,P=0.007),敏感性為0.533,特異性為0.761,約登指數(shù)為0.294,最佳截?cái)嘀禐?.46 mm;合并其他異常指征組為0.657(95%置信區(qū)間:0.562～0.752,P=0.003),敏感性為0.850,特異性為0.388,約登指數(shù)為0.238,最佳截?cái)嘀禐?.95 mm。

3 討論

本研究運(yùn)用SNP array技術(shù)聯(lián)合核型分析對(duì)516例NT增厚胎兒進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示染色體致病性異常70例,發(fā)生率約為13.57%,小于楊培峰等[5]報(bào)道的19.3%,這可能是由于地區(qū)、樣本量大小或入選標(biāo)準(zhǔn)不同而引起的偏差。同時(shí),在各類型的異常結(jié)果中以21-三體為最常見,占比6.78%,提示NT增厚對(duì)21-三體具有重要的預(yù)測價(jià)值,這與以往大多數(shù)的研究結(jié)果相符[6]。黃婷婷等[7]研究表明,隨著NT增厚,胎兒染色體異常的發(fā)生率逐漸增加。本研究以不同NT值分組為2.5～2.9 mm組、3.0～3.9 mm組、4.0～4.9 mm組和≥5 mm組,胎兒染色體異常的檢出率分別為7.10%、13.79%、23.91%和38.46%,與上述研究一致。周林等[8]研究表明,當(dāng)NT增厚合并其他異常指征時(shí),胎兒染色體異常的發(fā)生率明顯高于單純NT增厚。本研究中兩組的染色體異常檢出率分別為25.64%和8.33%,亦與上述研究相符合。

本研究中核型分析檢出致病性異常55例,其中47例染色體非整倍體異常和3例染色體缺失綜合征的檢出情況與SNP array結(jié)果一致。核型分析檢出5例衍生染色體,但其分辨率較低,無法識(shí)別片段的來源。而SNP array技術(shù)可以明確衍生染色體重復(fù)或缺失片段的臨床意義,是由于相應(yīng)染色體斷裂發(fā)生結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)生的。核型分析還檢出7例染色體臂間倒位與8例染色體多態(tài)性改變,而SNP array技術(shù)不能識(shí)別染色體平衡性變異(如易位和倒位等),同時(shí)由于探針的分布情況,其無法檢出染色質(zhì)區(qū)、次縊痕、隨體以及隨體柄等多態(tài)性改變。核型分析可以檢出染色體數(shù)目和形態(tài)異常,但無法發(fā)現(xiàn)染色體微缺失和微重復(fù)[9]。SNP array技術(shù)在核型正常的病例中檢出2.91% 的pCNVs、0.39%的lpCNVs和6.01%的VUS-CNVs,可以彌補(bǔ)核型分析技術(shù)的不足。

目前關(guān)于NT增厚截?cái)嘀档难芯可胁唤y(tǒng)一,國內(nèi)外大多數(shù)以3.0 mm或3.5 mm為NT增厚的截?cái)嘀礫10-11]。但又有相關(guān)研究報(bào)道,NT值在2.5～2.9 mm范圍時(shí),胎兒染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)增加[12]。本研究以≥2.5 mm為NT增厚納入研究,對(duì)不同產(chǎn)前指征的NT增厚胎兒進(jìn)行ROC曲線分析,單純NT增厚組和合并其他異常指征組行侵入性產(chǎn)前診斷的最佳截?cái)嘀捣謩e為3.46 mm和2.95 mm。故建議單純NT增厚胎兒行侵入性檢查的截?cái)嘀禐?.5 mm,而當(dāng)NT增厚合并其他異常指征時(shí),建議其行侵入性產(chǎn)前診斷的截?cái)嘀禐?.0 mm。由于本研究樣本量有限,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在一定的偏倚,今后會(huì)進(jìn)一步收集樣本進(jìn)行研究,以期為NT增厚胎兒的產(chǎn)前遺傳咨詢及預(yù)后評(píng)估提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。