李 苗,陳小勇

1 中國科學院大學,北京 100049 2 中國科學院昆明動物研究所遺傳資源與進化國家重點實驗室 &云南省高黎貢山生物多樣性與生態(tài)安全重點實驗室,昆明 650201 3 中國科學院東南亞生物多樣性研究中心,緬甸內(nèi)比都 05282 4 云南省東南亞生物多樣性保護國際聯(lián)合實驗室,勐臘 666303

在全球變化的大背景之下,生物多樣性銳減是21世紀人類面臨的重要挑戰(zhàn)之一[1]。水生生態(tài)系統(tǒng)作為一種重要的生態(tài)系統(tǒng),其不僅能夠為人類提供大量食物、工農(nóng)業(yè)以及生活用水,而且其還具有商業(yè)、航運交通以及休閑娛樂等其他諸多功能,是人類社會快速發(fā)展必不可少的條件[2—3]。然而,由于過度捕撈、生物入侵、水環(huán)境污染以及生態(tài)位的不斷喪失和改變,全球的水生生物多樣性一直在持續(xù)下降[4]。魚類作為水生生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分之一,其對于物質(zhì)循環(huán)、能量流動以及生態(tài)系統(tǒng)的自我調(diào)節(jié)與穩(wěn)定至關(guān)重要[5]。然而,在長期高強度的人為干擾下,全球魚類的很大一部分正在迅速地走向滅絕[6]。據(jù)《地球生命力報告2020》的結(jié)果顯示全球的地球生命力指數(shù)、物種生境指數(shù)以及生物多樣性完整指數(shù)均在持續(xù)下降[7],其中處于生物可持續(xù)水平的魚類種群占比已由1974年的90%下降至2017年的65.8%[8]。為了能夠有效的保護魚類多樣性,對水生生態(tài)系統(tǒng)進行長期持續(xù)的監(jiān)測至關(guān)重要。然而,由于傳統(tǒng)的魚類資源調(diào)查方法存在一定的局限性而無法滿足上述要求,因而尋求一種行之有效的魚類監(jiān)測方法迫在眉睫。

近年來,科研人員逐漸意識到環(huán)境DNA(eDNA)技術(shù)可作為傳統(tǒng)生物監(jiān)測方法的輔助手段之一,在未來甚至能夠完全取代傳統(tǒng)方法成為一種常規(guī)化的水生生物監(jiān)測方法。eDNA是指從水體、沉積物、土壤以及空氣等環(huán)境樣本中獲取到的沒有預(yù)先被分離的所有生物的總DNA[9—13]。對于魚類等大型生物而言,從環(huán)境中捕獲到的DNA主要來源于生物體與環(huán)境之間的相互作用,并通過皮膚細胞、毛發(fā)或鱗片的脫落以及代謝廢物排泄的方式將遺傳物質(zhì)釋放到環(huán)境中[12,14]?？蒲腥藛T可對eDNA進行采集,并將其作為物種監(jiān)測的證據(jù)[15]。相較于傳統(tǒng)的魚類監(jiān)測方法而言,eDNA技術(shù)具有靈敏度高、經(jīng)濟高效、省時省力、采樣受限小以及對生態(tài)系統(tǒng)無干擾等諸多優(yōu)點[16],因而倍受廣大生態(tài)學研究領(lǐng)域科研人員的青睞。目前,eDNA技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于國內(nèi)外魚類生態(tài)學的研究領(lǐng)域之中,且表現(xiàn)出極大的潛力[17—20]。然而,隨著eDNA技術(shù)在魚類生態(tài)學研究應(yīng)用中的不斷深入,也暴露出其所存在的一些問題與缺陷,例如:(1)eDNA技術(shù)在實際應(yīng)用中操作流程的不規(guī)范導致不同研究之間的結(jié)果無法進行對比[21];(2)基因參考數(shù)據(jù)庫的缺乏導致大量生境中實際存在的物種無法被進行有效的注釋[22];(3)eDNA被釋放后的生態(tài)學過程尚未明確,致使研究結(jié)果中產(chǎn)生假陽性與假陰性錯誤[23]。上述問題的存在不僅揭露了eDNA技術(shù)目前在魚類生態(tài)學研究領(lǐng)域內(nèi)的不足之處,同時也在一定程度指明了eDNA技術(shù)未來發(fā)展的方向以及科研工作者應(yīng)該關(guān)注的焦點。

本文將系統(tǒng)的對eDNA技術(shù)的發(fā)展歷程、分析流程、在魚類生態(tài)學研究領(lǐng)域中的研究進展以及eDNA技術(shù)目前所面臨的問題與挑戰(zhàn)進行闡述,并對eDNA技術(shù)未來的發(fā)展方向與應(yīng)用前景做出了展望。通過本文,以期能夠?qū)鴥?nèi)eDNA技術(shù)在魚類生態(tài)學研究中的規(guī)范使用具有指導意義,同時能夠推動eDNA技術(shù)在國內(nèi)的快速發(fā)展。

1 eDNA技術(shù)簡介

eDNA這一詞匯最早于1987年被提出,其最初被應(yīng)用于沉積物中環(huán)境微生物學的研究[24],而其真正得到研究人員的認可并被正式應(yīng)用于生態(tài)學研究領(lǐng)域卻是在2000年之后[25]。自Ficetola等首次應(yīng)用eDNA技術(shù)對入侵物種美國牛蛙Ranacatesbeiana進行監(jiān)測之后[26],eDNA技術(shù)開始在水生生態(tài)系統(tǒng)這一研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,其研究對象幾乎囊括了所有水生生物類群,包括魚類[27—29]、兩棲類[30—31]、哺乳類[32—33]、甲殼類[34—35]、水生昆蟲[36—37]、微生物[38—39]以及浮游動植物[40—42]等。同時,隨著測序技術(shù)與聚合本酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)的發(fā)展,eDNA技術(shù)的應(yīng)用由最初的單物種監(jiān)測[26]發(fā)展到對整個生物群落的監(jiān)測[43],也由定性監(jiān)測[26](目標種有無的監(jiān)測)發(fā)展到了定量監(jiān)測(生物量評估與豐度監(jiān)測)[44]?？偠灾?eDNA技術(shù)在水生生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用為水生生物資源的生態(tài)調(diào)查開辟了一條新的道路。

2 eDNA技術(shù)的分析流程

eDNA技術(shù)的操作流程主要包括eDNA樣品采集、eDNA提取、PCR擴增、測序以及結(jié)果分析等主要步驟,具體如圖1所示:

圖1 eDNA技術(shù)的操作流程Fig.1 Operation procedure of eDNA technology eDNA:環(huán)境DNA Environmental DNA;PCR:聚合酶鏈式反應(yīng) Polymerase Chain Reaction;NGS:二代測序 Next Generation Sequencing

2.1 eDNA樣品采集

在魚類生態(tài)學研究領(lǐng)域中eDNA樣品的采集方式分為主動采集與被動采集兩種,其中主動采集方式包括水樣采集與沉積物樣品采集,而被動采集則是在自然水域中尋找那些能夠富集eDNA的生物作為天然的eDNA采樣器。

2.1.1水樣采集與eDNA富集

據(jù)現(xiàn)有的研究表明,eDNA水樣的采集量一般集中在15 ml—10 L,以1 L與2 L最為常見[45],而在具體研究中水樣的采集量通常會根據(jù)實驗的需求有所差異。與組織DNA相比,水環(huán)境中的DNA屬于微量,甚至是痕量,所以在水樣采集之后首先要對水體中的DNA進行富集以提高物種的檢出率。關(guān)于eDNA的富集方式,當前主要的方法有酒精沉淀法和過濾法[46],前者主要用于小體積水樣的DNA富集,對于人造生態(tài)系統(tǒng)的水樣采集較為適合,而后者則主要用于大體積水樣的DNA富集,適合用來對河流與海洋等水域開闊的自然生態(tài)系統(tǒng)進行DNA富集。酒精沉淀法主要是用3 mol/L的醋酸鈉溶液以及無水乙醇與水樣混合來進行DNA富集[47],而過濾法則是利用過濾裝置對水樣進行過濾將DNA截留在濾膜上以達到富集的效果[46],在過濾過程中濾膜的合理選用至關(guān)重要。然而,由于不同研究人員具有不同的研究目的與研究對象,在利用過濾法進行DNA富集時所選取的濾膜也不盡相同。就目前現(xiàn)有的研究可知,在進行eDNA富集時研究人員最為常用的濾膜為玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、聚碳酸酯膜、混合纖維膜以及尼龍膜,而最為常見的濾膜孔徑則為0.45 μm與1.2 μm兩種[48]。為了能夠使研究結(jié)果更加精確,作者建議在具體的研究中研究人員應(yīng)該針對自己的研究對象對水樣的采集量以及eDNA富集方法進行篩選,以達到最佳的效果。

2.1.2沉積物樣品采集

eDNA沉積物樣品的采集方案應(yīng)該根據(jù)水深、底質(zhì)類型以及目標生物類群而定[49]。對于以魚類為目標類群的研究而言,表層沉積物樣品的采樣量一般集中在0.25—10 g[50],采樣設(shè)備的選用則根據(jù)生態(tài)系統(tǒng)的類型有所不同,其中對于大型河流和深度為幾百米以內(nèi)淺海的沉積物樣品一般選用抓斗進行采樣[51—52],而對于湖泊和深海等底質(zhì)較為松軟的沉積物樣品則利用巖芯進行采樣[53—54]。此外,由于沉積物中DNA的混合不均勻,通常還需要在采樣點所在的區(qū)域內(nèi)進行子樣本的采集[55]。

2.1.3eDNA的被動采集

由于eDNA的主動采集方式往往需要科研人員在野外花費大量的時間采集樣品,為了能夠節(jié)省野外調(diào)查的時間,相關(guān)研究人員開始嘗試從自然界中尋找天然的eDNA富集器或者設(shè)計富集能力很強的特殊材料來完成eDNA的被動采樣,諸如在海洋生態(tài)系統(tǒng)中以海綿作為純天然的海水過濾器,通過采集海綿來進行魚類生態(tài)調(diào)查[56—58],更有甚者是利用3D打印的羥基磷灰石作為DNA富集器將其置于采樣點處來完成eDNA的被動采樣[59]。然而,上述被動采樣的方式雖然在一定程度上節(jié)省了時間與經(jīng)濟成本,但關(guān)于其在具體科學問題的解決方面是否合理有效還有待進一步的證實。

2.2 eDNA的提取

鑒于eDNA樣品成分復(fù)雜且含有較多的雜質(zhì),為了能夠提高后續(xù)實驗中目標物種的檢出率,如何從樣品中提取出高質(zhì)量的DNA至關(guān)重要。在eDNA技術(shù)應(yīng)用到水生生態(tài)系統(tǒng)研究領(lǐng)域的初期,傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇法以及各種商業(yè)化的試劑盒均被應(yīng)用于eDNA的提取,但提取效果參差不齊,而后有研究人員專門對常用的幾種商業(yè)化試劑盒與酚-氯仿-異戊醇法提取水環(huán)境中eDNA的效果做了對比,發(fā)現(xiàn)使用商業(yè)化的試劑盒能夠提取更高質(zhì)量的eDNA[46]。目前最新的研究中基本上采用商業(yè)化的試劑盒來進行eDNA的提取,其中提取水樣eDNA使用較多的試劑盒為DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN)與Mo Bio Power Water DNA Extraction Kit兩種[46,60],而提取沉積物樣品eDNA使用較多的試劑盒主要為DNeasy PowerSoil DNA Isolation Kit (QIAGEN)與DNeasy PowerMax Soil Kit (QIAGEN)兩種[49,50]。

2.3 引物設(shè)計與PCR擴增

PCR引物的設(shè)計和DNA條形碼區(qū)段的選擇在eDNA技術(shù)的應(yīng)用中也是至關(guān)重要的一環(huán),這對后續(xù)實驗結(jié)果的精確性具有決定性的作用。根據(jù)實驗?zāi)康牡牟煌?通?？梢苑譃槟繕宋锓N的特異性監(jiān)測和某特定生物類群的多樣性監(jiān)測。特異性監(jiān)測主要是針對某一特定的物種設(shè)計特異性極強的引物從而能夠在PCR過程中只擴增該物種的基因序列而不會擴增其他親緣物種的基因序列,多樣性監(jiān)測則是針對某特定的生物類群設(shè)計通用性引物,要求能夠盡可能多的覆蓋該生物類群的基因序列。目前常用的引物設(shè)計軟件主要有Primer Premier、Oligo、Beacon Designer、PrimerHunter以及Primer Express等[61—62],引物設(shè)計在線網(wǎng)站主要有NCBI Primer-Blast、Primer3 Plus、Bath Primer、The PCR Suit、Primerbank 以及PrimerX等。

目前研究人員選取的條形碼區(qū)段主要集中在線粒體上,主要原因在于與細胞核DNA(nDNA)相比,線粒體DNA(mtDNA)具有以下三個優(yōu)點[63]:(1)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中含有大量的mtDNA基因序列數(shù)據(jù),有利于進行eDNA的序列比對;(2)細胞中mtDNA的拷貝數(shù)要遠高于nDNA的拷貝數(shù);(3)mtDNA相對保守,含有更多的能夠進行物種鑒定的高變區(qū)以及易于設(shè)計通用引物的保守區(qū)。關(guān)于mtDNA目的基因的選擇最常見的主要有(表1)細胞色素c氧化酶亞基I (COI) 基因[80—81]、細胞色素b (Cytb) 基因[82—83]、12s核糖體RNA(12s rRNA)基因[22,84]以及16s核糖體RNA(16s rRNA)基因[85—86]等,而具體在研究中該選擇哪個基因作為目標基因則取決于研究所選取生物類群的特征。同時,引物的選擇對eDNA監(jiān)測的結(jié)果也具有一定的影響,例如Zhang等通過Silico PCR的方法比較了22對硬骨魚類的通用引物并將其用于北京市的河流水樣中進行PCR擴增,發(fā)現(xiàn)12s rRNA區(qū)段的引物能夠監(jiān)測到的魚類多樣性要優(yōu)于其他基因區(qū)段的引物[87]。此外,Shu等類似的研究也證實了上述觀點[88]。因此,在選擇PCR擴增所用的引物時要遵循以下3個原則:(1)由于eDNA降解嚴重,因而引物擴增的片段不宜過長,要保證能夠盡可能多的回收樣品中的DNA[89—90];(2)所選擇的引物要保證具有良好的擴增效果,既要能準確地擴增目標類群,同時又不會發(fā)生非特異性擴增[91—92];(3)所選擇引物擴增的目標區(qū)域最好能夠具有完善的基因參考數(shù)據(jù)庫,能夠使盡可能多的測序數(shù)據(jù)被注釋到種的水平[93]。

表1 環(huán)境DNA技術(shù)在魚類監(jiān)測中常用的通用引物Table 1 Universal primers commonly used in environmental DNA technology for fish monitoring

2.4 測序與數(shù)據(jù)分析

在應(yīng)用eDNA技術(shù)進行單物種監(jiān)測時,PCR產(chǎn)物用傳統(tǒng)的一代測序即可,而在用宏條形碼進行物種多樣性監(jiān)測時,往往用高通量測序(NGS)更為合適,主要原因在于高通量測序速度快、數(shù)據(jù)量大且準確性高。目前,eDNA研究領(lǐng)域中應(yīng)用的高通量測序主要為擴增子測序,應(yīng)用較多的測序平臺主要為Illumina Miseq、Illumina Hiseq、Illumina NextSeq以及Roche GS FLX 454等[47,94—96]。

測序之后就是對數(shù)據(jù)進行分析,一代測序的數(shù)據(jù)在NCBI上進行比對即可確定目標種的有無,高通量測序的原始下機數(shù)據(jù)處理則較為復(fù)雜,其主要流程包括質(zhì)量控制、過濾、分子可操作分類單元(MOTU)聚類以及對代表性MOTU序列進行BLAST比對和物種注釋(圖2)。目前測序數(shù)據(jù)處理的主流軟件主要有Mothur[97]、OBITools[87]、Usearch[98]、Vsearch[99]、PhyloPythia[100]、Cutadapt[95]、QIIME[101]以及QIIME 2[102]等。通常來說,對高通量測序數(shù)據(jù)的分析要求科研人員具有一定的編程基礎(chǔ),但為了方便那些無編程背景的科研人員,生物公司通常開發(fā)了高通量測序數(shù)據(jù)處理的生物信息云計算平臺,例如MiFish Pipeline (http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/)魚類多樣性在線數(shù)據(jù)分析平臺等[103]。

圖2 測序數(shù)據(jù)的分析流程Fig.2 Analysis process of sequencing dataMOTU:分子可操作分類單元Molecular Operational Taxonomic Units

3 eDNA技術(shù)在魚類生態(tài)學研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

自eDNA技術(shù)被引入水生生態(tài)系統(tǒng)的研究領(lǐng)域以來,在魚類生態(tài)學研究中得到了廣泛的應(yīng)用。目前,eDNA技術(shù)主要被用來進行魚類的目標物種監(jiān)測、生物量評估、多樣性監(jiān)測與評價、繁殖活動監(jiān)測、種群遺傳分析以及攝食生態(tài)等方面的研究[23,104]。在本部分,將以eDNA技術(shù)在魚類生態(tài)學研究中應(yīng)用最為廣泛的4個方向展開論述。

3.1 目標物種監(jiān)測

精確地掌握目標物種的空間分布與豐度情況對研究物種的生態(tài)習性與制定相關(guān)的保護政策至關(guān)重要[105]。對于魚類等水生生物而言,其所生存的環(huán)境在一定程度上增加了物種監(jiān)測的困難性[48],尤其是針對那些種群密度極小物種的調(diào)查,諸如隱存種、瀕危種、稀有種以及處于入侵早期的入侵種。同時,由于傳統(tǒng)方法往往很難捕獲到密度極小的種群,從而無法精確地掌握其種群動態(tài)。鑒于上述原因,科研人員嘗試利用eDNA技術(shù)進行極小密度種群的監(jiān)測。目前,eDNA技術(shù)在極小密度種群監(jiān)測應(yīng)用中的成功案例主要有入侵魚類與珍惜瀕危魚類的監(jiān)測兩個方面。

生物入侵是生物多樣性喪失和全球同質(zhì)化的主要原因之一[106—107]。一旦入侵成功,入侵種會對當?shù)氐霓r(nóng)業(yè)、林業(yè)、漁業(yè)、電力生產(chǎn)以及貿(mào)易產(chǎn)生嚴重的影響,進而造成當?shù)亟?jīng)濟的大量損失[108]。為了能夠有效地遏制生物入侵,最佳的解決辦法便是在入侵種尚未形成較大種群時就將其消除[107]。Nakao等利用eDNA技術(shù)對5個大壩庫區(qū)的大口黑鱸Micropterussalmoides、小口黑鱸Micropterusdolomieu以及藍鰓太陽魚Lepomismacrochirus這3種入侵魚類進行了監(jiān)測,結(jié)果表明eDNA技術(shù)可以被作為一種生物入侵監(jiān)測的工具,但同時也發(fā)現(xiàn)了一些問題,例如該技術(shù)在一些eDNA濃度較低的采樣點靈敏度較低[19]。因此,未來在用eDNA技術(shù)進行入侵種的監(jiān)測時,尚有許多難題需要攻克。

珍稀瀕危魚類通常因其極小的種群密度而難以用傳統(tǒng)的調(diào)查方法對其種群動態(tài)進行監(jiān)測[107],而掌握其種群的分布與豐度狀況對于保護策略的制定至關(guān)重要[109]。許多珍稀瀕危物種自種群數(shù)量急劇下降之后便很難用傳統(tǒng)的方法對其進行監(jiān)測,這為科研人員的工作帶來了極大的困難,eDNA技術(shù)的出現(xiàn)則使上述情況出現(xiàn)了轉(zhuǎn)機。Cardás等利用eDNA技術(shù)對西班牙北部納隆河和薩拉河的歐洲鰻鱺Anguillaanguilla進行了監(jiān)測[110],證實了eDNA在瀕危魚類監(jiān)測方面的潛力。此外,Budd等利用eDNA技術(shù)對美國關(guān)島西太平洋海域的路氏雙髻鯊Sphyrnalewini進行了監(jiān)測,并建立了相關(guān)的監(jiān)測體系,其中特別值得關(guān)注的是基于傳統(tǒng)方法的調(diào)查自1970年開始便再未捕獲到路氏雙髻鯊[111]。由此可見,eDNA技術(shù)是一種強有力的珍稀瀕危魚類監(jiān)測工具。

3.2 生物量評估

生物量是生態(tài)學研究領(lǐng)域中重要的基礎(chǔ)生物學參數(shù)之一[112],準確地評估生物量對于種群大小的管理[113—114]、自然資源的保護[115]、生態(tài)系統(tǒng)的功能與服務(wù)[116]以及生態(tài)交互作用[117]具有十分重要的意義。自上個世紀以來,有關(guān)動物種群生物量評估方法的研究一直是科研人員與政策制定者所關(guān)注的焦點[118]。然而,對于魚類等水生生物類群而言,準確的評估其生物量是十分困難的[112]。同時,現(xiàn)有的評估方法通常成本高昂、耗時耗力且對于種群數(shù)量極小的物種無法開展有效的工作[119—120]。為了解決上述問題帶來的困擾,Takahara等首次提出利用eDNA技術(shù)來評估魚類的生物量,并將該技術(shù)應(yīng)用到了鯉Cyprinuscarpio的生物量評估中,其原理主要是尋找魚類釋放到水環(huán)境中的eDNA的濃度與魚類生物量之間的關(guān)系,進而建立相應(yīng)的生物量評估模型[112]。自此之后,利用eDNA技術(shù)探究魚類生物量的研究日益增多。為了摸清魚類的生長對eDNA技術(shù)進行生物量評估的影響,Mizumoto等以日本北部的瀕危物種遠東哲羅鮭Parahuchoperryi為研究對象,探究了由不同生長階段的遠東哲羅魚組成的魚群釋放eDNA的濃度與其生物量之間的關(guān)系,結(jié)果表明在魚類生物量恒定的情況下,不同規(guī)格的魚所組成的魚群釋放的DNA的濃度是相等的[121]。然而,以往在自然水域中進行的研究,結(jié)果通常顯示eDNA的濃度與生物量之間的相關(guān)性并不是很強[119]。為了能夠進一步提高利用eDNA技術(shù)進行生物量評估結(jié)果的精確性, Fukaya等提出在利用eDNA評估魚類生物量時應(yīng)充分考慮eDNA時空分布形成的機制,并以日本竹筴魚Trachurusjaponicus為研究對象證實了只有在某些特定的假設(shè)條件下才能夠利用廣義線性模型來準確地評估魚類的種群數(shù)量[122]。但時至今日,關(guān)于eDNA在水環(huán)境中動態(tài)變化的情況尚無定論,而這始終是阻礙利用eDNA技術(shù)評估魚類生物量的一大障礙。因此,在未來一段時間內(nèi),如何利用eDNA技術(shù)精確地評估魚類的生物量仍是該領(lǐng)域內(nèi)的熱點與難點問題之一。

3.3 生物多樣性監(jiān)測與評價

生物多樣性是衡量物種豐富程度的重要指標之一,而生物多樣性調(diào)查則是開展生物多樣性評價的重要基礎(chǔ)性工作,如何獲取精確的調(diào)查數(shù)據(jù)將會對后續(xù)的研究工作產(chǎn)生重要的影響。傳統(tǒng)的魚類多樣性調(diào)查方法主要依賴于魚類標本的采集,諸如底拖網(wǎng)、圍網(wǎng)、流刺網(wǎng)、地籠以及電捕魚法等,但上述方法往往具有一定的選擇性,不能夠全面系統(tǒng)地對研究區(qū)域內(nèi)的魚類多樣性做出精確的評價。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展,Thomsen等開創(chuàng)性地應(yīng)用eDNA技術(shù)對丹麥海域的魚類多樣性進行了調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了15種魚類,其中包括一罕見種——歐洲沙丁魚Sardinapilchardus。同時,為了驗證eDNA技術(shù)在魚類多樣性監(jiān)測方面的效率,Thomsen等還將eDNA調(diào)查的結(jié)果與9種傳統(tǒng)調(diào)查方法的結(jié)果進行了對比,表明利用eDNA監(jiān)測到的魚類物種數(shù)高于或者等于傳統(tǒng)方法,證實了eDNA在魚類多樣性調(diào)查方面具有極大的潛力[47]。此后,利用eDNA進行魚類多樣性調(diào)查的相關(guān)研究日益增多[65—66]。

在利用eDNA技術(shù)進行魚類多樣性研究的初期,研究人員最為關(guān)注的是eDNA技術(shù)在魚類監(jiān)測方面的能力,相關(guān)研究的主題主要是利用eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)方法同時對某特定研究區(qū)域內(nèi)的魚類多樣性進行調(diào)查,進而驗證eDNA技術(shù)是否可被用來進行魚類多樣性的調(diào)查[47]。在經(jīng)過大量研究的證實之后,eDNA技術(shù)逐漸開始被用來解決具體的科學問題,例如魚類群落時空分布的動態(tài)變化[123—124]、魚類群落中各物種相對豐度的情況[66,125]、魚類群落的系統(tǒng)發(fā)育多樣性[126]以及功能多樣性[127—128]等。然而,生物多樣性監(jiān)測的目的是為了進行生物多樣性評價。為了得到準確的評價結(jié)果,如何選擇合適的評價指標與標準尤為重要[129—130]。盡管基于eDNA技術(shù)的監(jiān)測方法能夠提供比傳統(tǒng)方法更多的可用于生物多樣性評價的信息[131],但目前尚未有一套基于eDNA技術(shù)的生物多樣性評價體系。未來要想將基于eDNA技術(shù)的方法整合到現(xiàn)有的生物多樣性監(jiān)測與評價體系中,還需要從國家與國際的層面來采取行動以制定相關(guān)的標準[131]。

3.4 魚類繁殖活動監(jiān)測

精確地掌握魚類產(chǎn)卵的時間與場所有助于人類更加清楚地認識魚類的繁殖習性、準確地評估魚類種群的繁殖力,進而能夠針對當前的資源狀況制定相關(guān)的開發(fā)利用與保護策略。然而,當前在魚類早期資源調(diào)查中所用到的調(diào)查方法通常會導致受精卵與仔稚魚死亡率的升高,進而會對受威脅種與稀有種的種群繁殖造成極大的傷害。鑒于上述原因的考慮,相關(guān)科研人員嘗試利用eDNA技術(shù)來探究魚類產(chǎn)卵的時間與場所。Bylemans等利用eDNA技術(shù)對澳洲麥氏鱸Macquariaaustralasica的產(chǎn)卵時間與場所進行了調(diào)查,研究發(fā)現(xiàn)在繁殖期水體中nDNA的量要顯著高于mtDNA的量,而在其他時期nDNA的量與mtDNA的量大致相等。因此,可以根據(jù)棲息環(huán)境中魚類nDNA與mtDNA相對豐度的變化來識別產(chǎn)卵時間與場所[69]。Bracken等以海七鰓鰻Petromyzonmarinus為研究對象,利用qPCR對愛爾蘭境內(nèi)2條河流中固定點位eDNA的時空分布進行了連續(xù)3年的監(jiān)測,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在海七鰓鰻的繁殖期,河流中eDNA的濃度將會顯著升高,表明eDNA技術(shù)可以被用來進行魚類繁殖活動的監(jiān)測[132]。此外,還有大量類似的研究同樣支持利用eDNA技術(shù)進行魚類繁殖活動的監(jiān)測[133—135]。

盡管目前已有大量研究利用eDNA技術(shù)對魚類繁殖活動進行了監(jiān)測,并證明eDNA技術(shù)在該方面具有一定的潛力,但其在實際應(yīng)用中仍存在些許問題。就當前利用eDNA技術(shù)進行魚類繁殖活動監(jiān)測的研究而言,所選取的研究對象多為人類已熟知其生活習性并掌握了其繁殖時間的物種,從而能夠使科研人員根據(jù)已掌握的情況結(jié)合eDNA量的變化來推斷魚類的產(chǎn)卵活動,而對那些生活習性沒有被人類所掌握的魚類來說,則無法使用該方法來進行判斷。因此,未來應(yīng)著重探究在尚未熟知魚類生態(tài)習性的背景下如何利用eDNA技術(shù)精確地識別魚類的繁殖時間與繁殖場所。

4 eDNA技術(shù)在魚類生態(tài)學研究領(lǐng)域中面臨的挑戰(zhàn)

應(yīng)用eDNA技術(shù)進行魚類調(diào)查的主要目的是為了能夠精確的掌握某特定研究區(qū)域內(nèi)魚類資源的狀況[79],從而解決一些具體的科學問題。因此,為了能夠保證eDNA研究結(jié)果的精確性,闡明影響eDNA研究結(jié)果精確性的因素至關(guān)重要[136]。目前,eDNA技術(shù)在魚類生態(tài)學研究領(lǐng)域的具體應(yīng)用中產(chǎn)生的錯誤主要有假陽性與假陰性兩種類型,而造成上述錯誤的主要原因來自于eDNA釋放到環(huán)境中之后的一系列生態(tài)學過程以及eDNA分析流程中的各個方面。鑒于此,為了能夠使科研人員在應(yīng)用eDNA技術(shù)的過程中盡量避免假陽性與假陰性錯誤的產(chǎn)生,本部分將針對造成eDNA研究結(jié)果中各類錯誤的原因展開詳細的論述并提出可能的解決方案。

4.1 eDNA技術(shù)操作流程的標準化

隨著eDNA技術(shù)在魚類生態(tài)學研究領(lǐng)域內(nèi)的日益流行,尋求一套能夠使研究結(jié)果最佳的eDNA技術(shù)操作流程與實驗方案已成為科研人員關(guān)注的熱點問題之一[137—138]。當前已有研究表明,水樣采集量、eDNA的富集與提取方法、PCR擴增目的基因的選擇等均會對研究結(jié)果的精確性產(chǎn)生影響[27,46,139]。同時,也有大量研究對eDNA技術(shù)的操作流程進行了優(yōu)化,但現(xiàn)有的研究更多的是針對某些特定的生物類群以及研究區(qū)域所做出的優(yōu)化,在一定程度上不具有普適性,從而也就使不同區(qū)域的研究結(jié)果無法進行相應(yīng)的對比[21,48]。為了能夠在更大尺度上使利用eDNA技術(shù)調(diào)查獲得的數(shù)據(jù)具有可比較性,同時能夠使政策制定者在相應(yīng)政策的制定上不做出誤判,eDNA技術(shù)的應(yīng)用必須規(guī)范化、標準化[21]。目前,歐洲標準化委員會(CEN)已經(jīng)在討論制定歐盟成員國在使用eDNA技術(shù)進行生物監(jiān)測時的標準化問題[140],日本也成立了專門的eDNA學會并編寫了一本eDNA技術(shù)標準化的研究手冊[21]—“Environmental DNA Sampling and Experiment Manual” (http://ednasociety.org/en/manual)。然而,目前國內(nèi)關(guān)于eDNA領(lǐng)域的研究日益增多,但不同單位的科研人員在采樣以及實驗方案的設(shè)計等方面存在諸多差異,這將使不同研究之間結(jié)果的精確性無法被進行準確地評估。因此,為了能夠使eDNA技術(shù)在國內(nèi)廣泛的正確使用,政府部門應(yīng)該盡快出臺相應(yīng)的研究手冊,以確保在全國范圍內(nèi)使用eDNA技術(shù)獲取的生物監(jiān)測數(shù)據(jù)能夠具有良好的對比性。

針對上述eDNA技術(shù)分析流程標準化的問題,相關(guān)部門在編寫eDNA研究手冊時應(yīng)著重考慮樣品采集、DNA富集與提取、PCR擴增以及后續(xù)的生物信息學分析等方面標準的制定。目前,已有不少研究專門針對eDNA技術(shù)的分析流程進行了優(yōu)化,相關(guān)研究結(jié)果可作為eDNA技術(shù)標準化的參考依據(jù)[46,55,141—142]。通過對現(xiàn)有文獻的整理即可發(fā)現(xiàn)在魚類生態(tài)研究領(lǐng)域中eDNA樣品的采集應(yīng)以水樣采集為主,水樣采集地點要盡可能覆蓋各種生境類型,水樣的采集量則以1 L或2 L為最佳且每個采樣點至少采集3個平行樣本[94,143]。關(guān)于eDNA的富集方法一般推薦使用過濾的方法將DNA截留在濾膜上,而濾膜材質(zhì)與孔徑的選擇則主要傾向于0.45 μm的玻璃纖維濾膜[141]。富集之后則需要對eDNA進行提取,就eDNA的提取而言當前主要推薦使用商業(yè)化的試劑盒,其中提取效果較好的試劑盒主要為Qiagen′s DNeasy Blood &Tissue Kit與Mo Bio Power Water DNA Extraction Kit兩種[46,60]。eDNA提取之后PCR擴增測序過程中需要標準化的主要是引物的選取,當前在關(guān)于引物的選用方面較為推薦使用12s rRNA基因的通用引物[87,88]。測序之后需要標準化的則為生物信息學分析流程,盡管目前已有大量用于生信分析的軟件,但不同軟件在算法上存在諸多差異,未來最好能夠開發(fā)出一套專門針對魚類eDNA高通量測序數(shù)據(jù)處理的軟件與分析流程[144]。相信通過對eDNA技術(shù)的分析流程進行標準化之后,將能夠使eDNA研究結(jié)果的精確性得到極大的提升。

4.2 參考數(shù)據(jù)庫的缺乏

在eDNA技術(shù)成為主流的魚類資源調(diào)查方法之前,尚有許多方法論上的困難需要克服[65],其中之一便是DNA序列參考數(shù)據(jù)庫的不完全以及現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫中存在諸多錯誤信息[22]。目前,eDNA研究中常用的公共參考數(shù)據(jù)庫主要有NCBI的基因數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、歐洲分子生物學實驗室的數(shù)據(jù)庫(EMBL)(http://www.ebi.ac.uk/embl)、生命條形碼數(shù)據(jù)庫(BOLD)(http://v4.boldsystems.org)、漁業(yè)生物條形碼計劃在線數(shù)據(jù)庫(FISH-BOL)(http://www.fishbol.org)以及日本的魚類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫(MitoFish)(http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp)等。然而,鑒于上述數(shù)據(jù)庫中大量錯誤信息的存在與魚類12s rRNA基因序列的極度匱乏,科研人員逐漸意識到建立本土魚類基因數(shù)據(jù)庫的重要性,且現(xiàn)已有相關(guān)研究證明相較于公共數(shù)據(jù)庫而言,本土魚類基因數(shù)據(jù)庫能提供更加精確的物種分類注釋信息,對eDNA研究結(jié)果精確性的提高具有十分重要的意義[31,145]。

為了解決上述數(shù)據(jù)庫不完全的問題,科研人員在利用傳統(tǒng)方法進行魚類資源調(diào)查時應(yīng)盡可能廣泛地收集構(gòu)建魚類基因數(shù)據(jù)庫所需的魚類組織材料,以確保構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫能夠在最大程度上涵蓋某海域或流域的魚類物種信息。同時,為了保障數(shù)據(jù)庫的精確性,數(shù)據(jù)庫中應(yīng)包含每個魚類物種的樣品采集信息、分類鑒定信息以及DNA條形碼信息,尤其是對于那些形態(tài)學上較難辨認的物種要格外注意。此外,關(guān)于數(shù)據(jù)庫構(gòu)建過程中條形碼擴增片段的選擇方面,作者建議最好能夠建立魚類線粒體全基因組數(shù)據(jù)庫以滿足不同研究的需求,即便是出于成本的考慮只能構(gòu)建單基因片段的數(shù)據(jù)庫,那么也應(yīng)該建立能夠覆蓋該目的基因全部序列的長片段DNA條形碼數(shù)據(jù)庫[23]。盡管擁有一個盡可能完善且精確的本土魚類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫將能夠極大地提高eDNA研究結(jié)果的精確性,但本土數(shù)據(jù)庫同時也存在一個嚴重的缺陷——物種的覆蓋度較低,這說明在研究中如果僅使用本土數(shù)據(jù)庫進行物種的分類注釋,將無法檢測到數(shù)據(jù)庫中尚未涵蓋的某些處于入侵早期的魚類物種信息[144],從而也會對研究結(jié)果的精確性產(chǎn)生一定的影響。因此,為了能夠取得最佳的研究效果,在進行高通量測序數(shù)據(jù)的物種分類注釋時最好能夠同時利用公共數(shù)據(jù)庫與本土數(shù)據(jù)庫。

4.3 eDNA被釋放后生態(tài)學過程的探究

eDNA的生態(tài)學過程(圖3)主要包括eDNA在環(huán)境中的來源、狀態(tài)、遷移以及最終的結(jié)局[146]。eDNA的生態(tài)是一系列物理、化學以及生物相互作用的過程,在此過程中影響eDNA監(jiān)測結(jié)果精確性的因素主要包括各類生物因素與非生物因素。

圖3 eDNA的生態(tài)Fig.3 The ecology of eDNA

魚類群落中種群數(shù)量的大小、所處的生活史階段、新陳代謝狀況、捕食者的存在以及各類洄游等均會影響環(huán)境中可檢測的eDNA信號強度[23]。Maruyama等設(shè)計室內(nèi)對照組實驗研究發(fā)現(xiàn)由于代謝活動方面的差異,幼魚較成魚有更高的eDNA釋放率[147]。然而,在自然水域中魚類種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜且利用eDNA技術(shù)無法判別種群結(jié)構(gòu)信息,這將導致利用eDNA技術(shù)無法準確地推算魚類種群的生物量。此外,Jo等發(fā)現(xiàn)魚類生物量的大小也會影響eDNA的釋放效率[148],而魚類的集群以及各種類型的洄游往往會導致魚類種群生物量的驟增,這也會對eDNA監(jiān)測結(jié)果的精確性產(chǎn)生一定的干擾。因此,為了能夠使eDNA技術(shù)的監(jiān)測結(jié)果更具說服力,在后期的研究中加強魚類eDNA釋放速率方面的研究十分必要。

除上述生物因素外,環(huán)境中的非生物因素也會嚴重影響eDNA的監(jiān)測結(jié)果。據(jù)當前的研究表明,影響魚類eDNA監(jiān)測效率的非生物因素主要包括水溫、pH、紫外光照、鹽度、渾濁度以及水文條件等,例如Strickler等探究了紫外光照、溫度以及pH對eDNA在水體中存留時間的影響,并發(fā)現(xiàn)eDNA在黑暗、低溫且偏堿性的水環(huán)境中能夠存留的時間更久[15],而Diaz-Ferguson和Moyer則發(fā)現(xiàn)水文條件的變化會影響eDNA在水環(huán)境中的分布情況[149]。盡管目前已有大量關(guān)于非生物因素對eDNA監(jiān)測結(jié)果影響的方面的研究,但基本上是基于室內(nèi)控制實驗且在實驗設(shè)計中僅考慮了部分環(huán)境因子對eDNA生態(tài)的影響,這與自然水體中eDNA生態(tài)的真實情況還存在一定的差距。因此,探究所有對eDNA的生態(tài)有影響的非生物因子如何綜合影響eDNA的研究結(jié)果將是科研人員未來應(yīng)該重點關(guān)注的方向。

針對上述eDNA在環(huán)境中的生態(tài)學過程會對研究結(jié)果精確性產(chǎn)生影響這一問題,作者建議在后期的研究中應(yīng)充分發(fā)揮多學科交叉融合研究的作用,綜合運用各種生態(tài)學以及水文學模型進一步闡明eDNA的生態(tài)學過程。此外,研究人員在具體的研究中應(yīng)充分考慮eDNA的生態(tài)學過程可能會對研究結(jié)果所帶來的影響,并在前期的實驗方案設(shè)計與后期的實驗結(jié)果解釋時將其納入[136,146],從而將eDNA的生態(tài)學過程對研究結(jié)果精確性的影響降至最低。

5 總結(jié)及前景展望

自eDNA技術(shù)被引入水生生態(tài)系統(tǒng)的研究領(lǐng)域以來,經(jīng)過十多年的發(fā)展其已經(jīng)成為了一種強有力的魚類資源調(diào)查手段。目前,eDNA技術(shù)已經(jīng)在物種監(jiān)測、魚類多樣性監(jiān)測、生物量評估以及魚類繁殖活動監(jiān)測等方面得到了廣泛的應(yīng)用且表現(xiàn)出極大的潛力。同時,相較于傳統(tǒng)的魚類監(jiān)測方法而言,eDNA技術(shù)在監(jiān)測效率、時間與經(jīng)濟成本以及對生態(tài)系統(tǒng)的干擾等方面更具優(yōu)勢。然而,由于eDNA技術(shù)在操作流程上的不規(guī)范、物種注釋參考數(shù)據(jù)庫的不完善以及eDNA被釋放進入環(huán)境之后生態(tài)學過程的不明確等原因,科研人員在應(yīng)用eDNA技術(shù)進行魚類監(jiān)測時所得研究結(jié)果的精確性將會受到一定的影響。因此,未來要想使eDNA技術(shù)能夠成為一種替代傳統(tǒng)方法的常規(guī)化魚類監(jiān)測手段還需要克服很多困難。

在本文中,綜述了eDNA技術(shù)在魚類生態(tài)學研究領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀,同時對eDNA在具體應(yīng)用中所面臨的問題與挑戰(zhàn)做了相關(guān)總結(jié),并提出了相應(yīng)的解決方案。最終,通過對eDNA技術(shù)在魚類生態(tài)學研究領(lǐng)域中相關(guān)文獻的梳理可發(fā)現(xiàn),在未來的研究中要想使eDNA調(diào)查得出的結(jié)果具有更高的可信度,科研人員應(yīng)聚焦于以下幾個方面:(1)不斷完善魚類mtDNA 12s rRNA基因數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建。當前利用eDNA技術(shù)進行魚類生態(tài)學的研究中,業(yè)內(nèi)普遍認為以12s rRNA基因作為目的基因能夠獲得的物種鑒別效果最佳,而在全球范圍內(nèi)該基因的條形碼數(shù)據(jù)庫極度匱乏,嚴重影響了高通量測序數(shù)據(jù)物種注釋結(jié)果的精確性。因此,未來亟需構(gòu)建全球各地的本土魚類12s rRNA基因參考數(shù)據(jù)庫。(2)闡明eDNA的生態(tài)學過程。eDNA的生態(tài)學過程一直以來都是影響eDNA監(jiān)測結(jié)果精確性的重要原因之一,盡管當前已有大量科研人員在該方面做了許多工作,但尚無明確的定論,未來應(yīng)考慮多學科交叉并結(jié)合各種水文學以及生態(tài)學模型全面綜合的考慮各種影響eDNA生態(tài)過程的生物與非生物因素,進一步闡明eDNA在不同生態(tài)系統(tǒng)中的生態(tài)學過程。(3)開發(fā)魚類eDNA研究的生物信息學分析流程。當前用來分析魚類eDNA宏條形碼測序數(shù)據(jù)的主流軟件最初大多是專門針對微生物研究而開發(fā)的,且不同的軟件在算法上存在一定的差異,從而會在一定程度上影響最終的分析結(jié)果。因此,未來科研人員應(yīng)開發(fā)一套專門針對魚類eDNA研究的生物信息學分析流程,盡可能的降低不同研究中測序數(shù)據(jù)在分析過程中因算法導致的差異。(4)不斷開發(fā)新技術(shù),早日實現(xiàn)eDNA監(jiān)測自動化。近年來關(guān)于eDNA采樣的各種新型設(shè)備層出不窮,甚至某些在線監(jiān)測設(shè)備已經(jīng)被投入使用,但上述有關(guān)設(shè)備在許多方面仍不完善,得到的監(jiān)測結(jié)果并不具備很強的說服力。科研人員未來可加強在監(jiān)測設(shè)備開發(fā)方面的研究,爭取早日開發(fā)出能夠放置在各種水生生態(tài)系統(tǒng)中自動監(jiān)測并上傳魚類生態(tài)學數(shù)據(jù)的儀器設(shè)備,以實現(xiàn)魚類eDNA監(jiān)測的自動化。