楊光梅，黃 燕，盧 琦，李杰麗，任云偉，魏 波，范銀英，李浩成，郭利娟

(1.云南現(xiàn)代民族藥工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650217；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心 民族藥分中心，云南 昆明 650217；3.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院 云南省第一人民醫(yī)院MICU科，云南 昆明 650032)

燈盞花主產(chǎn)于云南，是短葶飛蓬(菊科植物)Erigeron breviscapus (Vant.)Hand-Mazz的干燥全草，是比較常用的中藥材，又稱為燈盞細(xì)辛、東菊、地頂草等[1]。主要的有效成分為燈盞乙素和野黃芩苷，具有發(fā)表散寒、消炎、止痛之功效。是燈盞細(xì)辛顆粒、燈盞細(xì)辛口服液、燈盞花注射液和注射用燈盞花素等制劑主要原材料[2]。種植期間會受到病蟲害的影響，主要害蟲是蝸牛、蚜蟲、菜青蟲、地老虎。燈盞花在投料使用前雖然經(jīng)過了適當(dāng)?shù)牧罆?、干燥等處理，但作為全草藥材直接投入使用，非常有必要對其所含的農(nóng)藥殘留成分，尤其是國家農(nóng)業(yè)部及相關(guān)部門已明令禁止使用的高毒、劇毒、高殘留、致癌、致畸、致突變的農(nóng)藥組分及《中國藥典》2020版四部農(nóng)藥殘留的規(guī)定進(jìn)行控制和考察，保證患者用藥安全，建立適用于燈盞花藥材的農(nóng)藥殘留測定方法[3]。近年來，QuEChERs 發(fā)展較快已成為國際上廣泛并得認(rèn)可的一種用于中藥材、農(nóng)副產(chǎn)品等殘留檢測的快速樣品前處理技術(shù).[4-7]本法有高效、快速、簡單、科學(xué)等特點，在農(nóng)藥殘留檢測中得到普遍廣泛應(yīng)用[8]。本實驗采用QuEChERs-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定中藥燈盞花29種禁用農(nóng)藥殘留。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 (Agilengt 1290 infinity-6470 LC/MS美國安捷倫公司)；電子天平 (SI-224賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；分液漏斗震蕩器(MMW東京理化器械株式會社)；多功能冷凍離心機(jī) (Rotina 380R上海凌儀生物科技有限公司)；震蕩器 (VORTEX 海門市其林貝爾儀器制遠(yuǎn)有限公司)。

1.1.2 試劑

乙腈 (GR，賽默飛世爾科技)、甲酸胺 (GR，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技開發(fā)有限公司)、磷酸、冰醋酸 (AR，國藥集團(tuán)試劑有限公司)、QuEChERs SPE凈化管 (批號：6559539-01，北京迪馬科技公司)。

1.1.3 對照品

禁用農(nóng)藥混合對照溶液(批號：610020-202001，中國食品藥品檢定研究院)

1.1.4 樣品

所用15批燈盞花藥材經(jīng)鑒定均為正品，燈盞花：(批號：210701、220101昆明道地中藥飲片廠；批號：190103 云南金發(fā)藥業(yè)有限公司；批號：200526 云南展熠藥業(yè)有限公司；批號：210226、210510、210526 昆明市官渡區(qū)肖友明中藥材經(jīng)營部；批號：211201、 211202、211203、211204、220301、220302、220303、22030昆明廣有堂中藥材經(jīng)營部)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 色譜柱

Infinity Poroshell 120 EC-C18 (3.0 mm ×100 mm，2.1 μm)

2.1.2 流動相

A：0.1%甲酸溶液 (含5 mmoL甲酸銨)

B：乙腈-0.1%甲酸水溶液 (含5 mmoL甲酸銨)(95∶5)并按表.進(jìn)行梯度洗脫：

表1 梯度洗脫表

2.1.3 流動相

色譜柱柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL/min

2.1.4 進(jìn)樣量

供試品溶液和對照品溶液：2 μL

2.1.5 質(zhì)譜檢測器

干燥氣 (N2)流速：11.0 L/min；霧化氣 (N2)壓力：40 psi；干燥氣溫度：250 ℃；毛細(xì)管出口電壓：3500 V；靶氣流速：11.0 L/min；靶氣溫度：350 ℃；噴嘴電壓：0 V。

2.1.6 檢測模式

多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)模式

2.2 對照品溶液的配制

精密量取對照品 0.5 mL 置于 10 mL 容量瓶中，加色譜級乙腈稀釋至刻度，混勻，獲得對照品儲備液。

2.3 基質(zhì)溶液制備

取燈盞花空白基質(zhì)樣品，同2.5供試品溶液制備方法制成溶液作為空白基質(zhì)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

精密量取對照品儲備溶液 10 μL 并加入空白基質(zhì) 600 μL 混勻，即質(zhì)量濃度約為 5 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 20 μL，精密加入空白基質(zhì) 600 μL，混勻，即得質(zhì)量濃度約為 1000 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用相同的方式依次稀釋分別得到質(zhì)量濃度約為10、20、40、60、80、100、200 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.5 供試品溶液配制

取不同批次來源的供試品，粉碎，粉末 (并過三號篩)，精密稱定 3 g，放置于聚苯乙烯具塞離心管中，加入 15 mL 1%冰醋酸溶液，在渦旋儀上混勻讓藥粉充分浸潤，放置 30 min 以上，精密加入 15 mL 色譜乙腈與內(nèi)標(biāo)溶液 100 μL，混勻，置振蕩器上劇烈震蕩(500次/min)10 min 以上，加入質(zhì)量比例為 (1∶4)無水乙酸鈉與無水硫酸鎂的混合粉末 7.5 g，及時搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩(500次/min)10 min 左右，于冰浴中冷卻 10 min，離心 (3500轉(zhuǎn)/min)5 min。取上清液 9 mL，置已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管[N-丙基乙二胺(PSA)300 mg，無水硫酸鎂 900 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠 300 mg，石墨化炭黑 90 mg，硅膠 300 mg]中，使物料充分混勻，再置振蕩器上劇烈震蕩(600次/min)10 min 使凈化完全，離心 (4500轉(zhuǎn)/min)10 min，吸取上清液，用微孔濾膜 (0.22 μm)濾過，作為供試品溶液 。

分別取對照品溶液、供試品溶液、空白基質(zhì)溶液 2 μL 進(jìn)樣，圖譜如下圖1、圖2、圖3。

圖1 對照品譜圖

圖2 樣品譜圖

圖3 空白基質(zhì)譜圖

2.6 檢出限、定量限、線性關(guān)系與線性范圍考察

分別精密吸取上述2.4制備好的禁用農(nóng)殘對照品溶液 2 μL 注入液相色譜儀按上述色譜條件測得峰面積，以峰面積積分值進(jìn)行回歸處理。結(jié)果見表2。

表2 LC-MS/MS各分析物的檢測結(jié)果

2.7 系統(tǒng)精密度、準(zhǔn)確度(加標(biāo)回收率)

參照對照品溶液配制與供試品溶液配制方法，配制約 50 ng/mL 對照品溶液1份，對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，分別記錄29項禁用農(nóng)藥的保留時間與峰面積?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：各峰的保留時間RSD≤2%(n=6)，各峰的峰面積RSD≤15%(n=6)。

采用全程加標(biāo)法，即取約 3.0 g 燈盞花藥材粉末，精密稱定，加入農(nóng)藥殘留對照品儲備液0.75、1.5、2.25 mL 各3份，對照品的加入量為與所取供試品中待測定成分量之比控制在1∶0.5、1∶1、1∶1.5左右，之后按照供試品溶液制備方法配制。按50%，100%，150%質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別配制9份供試品加標(biāo)溶液。對照品、供試品溶液各進(jìn)樣1次，對照品溶液、供試品溶液分別進(jìn)樣 2 μL，結(jié)果見表3。

表3 系統(tǒng)精密度、回收率結(jié)果

2.8 樣品定性、定量測定

2.8.1 定性測定

進(jìn)行樣品定性分析測定時，如果檢出的色譜峰與對照品的保留時間一致，在扣除背景后的質(zhì)譜圖中，被選擇的2個監(jiān)測離子對都同時出現(xiàn)，而且所選擇的監(jiān)測離子對與對照品的監(jiān)測離子對峰面積比一致(相對比例大于50%，允許偏差±20%：相對比例大于20%～50%，允許偏差±25%：相對比例大于10%～20%，允許偏差±30%；相對比例小于10%，允許偏差±50%)，則可判斷樣品中存在該農(nóng)藥。

2.8.2 定量測定

取上述制備好的對照品溶液和供試品溶液各2μL注入，計算各分析物含量。結(jié)果：15批燈盞花藥材中均未檢查出29種分析物。

3 討論

樣品取樣量的確定—燈盞花藥材經(jīng)加工處理后為干燥藥材，含水量不多。3 g的樣品量比較方便合適，且具有一定的代表性。不會因取樣量過大，而導(dǎo)致試劑、樣品的浪費(fèi)及環(huán)境的污染。最后處理得到供試品溶液中藥材含量為0.5 g/mL，滿足藥材痕量分析要求。

提取后的燈盞花溶液含有植物甾醇、樹膠、樹脂、鞣質(zhì)、揮發(fā)油等物質(zhì)，參考文獻(xiàn)相關(guān)報道，快速樣品處理法 (QuEChERS)相對直接提取法能更好地去除雜質(zhì)、防止被測組分和回收率的流失、保證試驗的準(zhǔn)確性。

離子對的優(yōu)化與判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)全掃描質(zhì)譜得到標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥的各保留時間劃分時間段，盡可能減少在每一時間段所檢測目標(biāo)化合物的數(shù)量。在質(zhì)譜圖中，選擇3對特征離子，豐度較高的一對作為定量離子對，其余兩對為定性離子對。采用保留時間和離子豐度比定性，再用定量離子對的峰面積定量.

參照《中國藥典》2020年版四部通則2341農(nóng)藥殘留測定法第五法：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對15批燈盞花進(jìn)行農(nóng)藥殘留量的測定，其標(biāo)準(zhǔn)限度按 《中國藥典》2020年版四部通則0212藥材和飲片檢定通則項下33種禁用農(nóng)藥不得檢出 表執(zhí)行，其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法收載30種農(nóng)藥測定，但氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法也有部分項目重復(fù)檢測，考慮分析物甲基異柳磷在氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測效果較佳，所以不在重復(fù)進(jìn)行測定只測定上述29項結(jié)果均為未檢出。根據(jù)上述探索性研究結(jié)果表明，該方法基本可適用于燈盞花禁用農(nóng)藥殘留的質(zhì)量控制。

4 結(jié)論

本研究建立了燈盞花藥材中禁用農(nóng)藥殘留量測定法。對不同來源、方法適用性、分析物含量等方面進(jìn)行了考察研究，發(fā)現(xiàn)能按此超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對燈盞花藥材進(jìn)行29種禁用農(nóng)藥殘留測定，此方法能準(zhǔn)確、快速、科學(xué)、有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。確定取樣量為3 g，采用快速樣品處理法 (QuEChERS)處理，按超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為燈盞花29種禁用農(nóng)藥殘留測定法。