楊帆（天津市靜海區(qū)疾病預(yù)防控制中心,天津 301600）

食品是人類賴以生存及發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，而食物安全問題更是關(guān)系到人體健康及民生的重要社會(huì)問題之一，已經(jīng)引起了人們的高度重視。近些年來，我國(guó)因世界范圍內(nèi)大規(guī)模生物污染所導(dǎo)致的食源性疾病暴發(fā)事件在日常生活中屢見不鮮。例如奶粉中含有金黃色葡萄球菌、日本出血性大腸埃希菌污染、法國(guó)李斯特菌中毒以及世界范圍內(nèi)的SARS流行等[1]。生活中所涉及的食品污染總共分為三類，第一類為化學(xué)性污染，主要是重金屬污染物、化學(xué)殘留物等；第二類為物理性污染，表現(xiàn)為放射性物質(zhì)對(duì)食品的污染；第三類在生活中最為常見，為昆蟲、寄生蟲、微生物等對(duì)食品的污染。據(jù)權(quán)威數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年會(huì)有15億以上的腹瀉患者，其中有70%的患者是因食用了被微生物污染的食品而發(fā)病的。我國(guó)則是以細(xì)菌毒素及細(xì)菌所造成的污染危害最大[2]。其中細(xì)菌感染型中毒潛伏時(shí)期較長(zhǎng)，通常為十余個(gè)小時(shí)，且伴有發(fā)燒癥狀；而毒素型中毒時(shí)間僅為2-4個(gè)小時(shí)，很少會(huì)出現(xiàn)發(fā)燒的問題。從檢測(cè)方式上看，目前包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家仍有部門應(yīng)用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方式對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)[3]。這類檢測(cè)方式的不足之處在于靈敏度低、操作繁瑣及檢測(cè)周期長(zhǎng)，因此細(xì)菌檢測(cè)方式在臨床上應(yīng)用則顯得尤為滯后。因此需要引入一類特異性及敏感性均較強(qiáng)的檢測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)，這對(duì)于明確致病菌的類型以及促進(jìn)早期診療的開展均有著可觀的臨床應(yīng)用價(jià)值。筆者引入了基于分子生物學(xué)的FQ-PCR檢測(cè)技術(shù)，最終取得了較為可觀的檢出結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象資料 抽取天津市靜海區(qū)疾病預(yù)防中心2021年5月-2022年5月之間發(fā)生群體食源性中毒腹瀉和疑似患者共計(jì)100例，分別取其糞便標(biāo)本60份，嘔吐物標(biāo)本40份，共計(jì)100份標(biāo)本作為研究材料，對(duì)其中所含有的食源性致病菌進(jìn)行測(cè)定。

1.2 方法 （1）儀器及試劑：PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)某公司生產(chǎn)，分析軟件由廠家提供。另選取試劑包括FQ-PCR熒光染料、DNA聚合酶、細(xì)菌基因組提取試劑盒、離心機(jī)。（2）細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)方式：金黃色葡萄球菌、沙門菌、志賀菌及副溶血性弧菌均按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌培養(yǎng)法和自動(dòng)化微生物分析儀進(jìn)行測(cè)定。（3）FQ-PCR檢測(cè)方式：①熱裂解法提取樣本DNA：取細(xì)菌培養(yǎng)液10ml置于試管中，按照8000r/min的速率進(jìn)行離心。將其滅菌后應(yīng)用蒸餾水進(jìn)行2次洗滌。然后應(yīng)用1ml蒸餾水進(jìn)行懸浮處理，最后將樣本用水煮沸10min，按照8000r/min進(jìn)行離心，取上清液，即為DNA模板液。②PCR擴(kuò)增：在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，并按照說明書要求分別配置擴(kuò)增液，調(diào)節(jié)循環(huán)參數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo) ①FQ-PCR試劑盒特異性分析：選取導(dǎo)致食源性中毒的6個(gè)特異性菌株與導(dǎo)致食源性中毒的14個(gè)無關(guān)菌株各5份作為檢測(cè)樣本，計(jì)算FQ-PCR試劑盒的特異性水平。②FQ-PCR試劑盒的靈敏度及線性范圍：將本次檢測(cè)所分離鑒定出的菌株進(jìn)行分離檢測(cè)，按照初始濃度2×107cfu進(jìn)行10倍梯度稀釋，然后按照上述方法中所提及的方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)照方式采用平板培養(yǎng)法，組中測(cè)算出試劑盒的線性范圍及靈敏度水平。③不同方式檢出結(jié)果：比較細(xì)菌培養(yǎng)法及FQ-PCR法對(duì)沙門菌、志賀菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、諾如病毒及輪狀病毒的檢出率，并將結(jié)果以百分比形式表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 借助SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示數(shù)據(jù)存在比對(duì)價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 FQ-PCR技術(shù)靈敏度 通過定量對(duì)照模板進(jìn)行10倍稀釋，并取7個(gè)濃度（2×10-2×107拷貝/ml），并對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR方式檢測(cè)。最終測(cè)定結(jié)果顯示，模板在2×102-2×107拷貝/ml范圍之間與其對(duì)應(yīng)的CT值具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)大于＞0.999。即為FQ-PCR方式能夠?qū)?×102-2×107拷貝/ml之間的食源性細(xì)菌病原體進(jìn)行精準(zhǔn)定量測(cè)量。具體相關(guān)性曲線圖詳見圖1。

圖1 FQ-PCR技術(shù)靈敏度相關(guān)性曲線圖

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出結(jié)果 由表1可知，細(xì)菌培養(yǎng)法共檢出沙門菌5份、志賀菌41份、副溶血性弧菌5份、金黃色葡萄球菌6份、諾如病毒5份、輪狀病毒1份，總陽(yáng)性檢出數(shù)63份，總陽(yáng)性率為63.00%。

表1 細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出結(jié)果

2.3 FQ-PCR法陽(yáng)性檢出結(jié)果 由表2可知，F(xiàn)Q-PCR法共檢出沙門菌7份、志賀菌58份、副溶血性弧菌10份、金黃色葡萄球菌9份、諾如病毒7份、輪狀病毒1份，總陽(yáng)性檢出數(shù)92份，總陽(yáng)性率為92.00%。

表2 FQ-PCR法陽(yáng)性檢出結(jié)果

2.4 不同方式檢測(cè)結(jié)果比較 FQ-PCR法陽(yáng)性檢出份數(shù)為92份，細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出樣本份數(shù)為63份，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.114，P=0.000）。

3 討論

食品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售的各個(gè)環(huán)節(jié)中很容易受到微生物的污染。故在當(dāng)前的食品衛(wèi)生檢驗(yàn)工作中，非常重要的一個(gè)要求即為準(zhǔn)確、及時(shí)地將食品中的有害微生物予以檢出，避免有害食物流向市場(chǎng)。當(dāng)前，隨著人們生活水平及保健意識(shí)的不斷提升，大眾對(duì)于食品衛(wèi)生安全的關(guān)注度也在與日俱增。因此，需要在食品生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)中均進(jìn)行檢測(cè)，保證食品在生產(chǎn)過程中的安全，使食品食用時(shí)的安全性得到有效保障。

從檢測(cè)手段上看，傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方式主要是根據(jù)食品的生理性狀及形態(tài)特征進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)及一系列生化反應(yīng)的檢測(cè)方式。檢測(cè)步驟用時(shí)較長(zhǎng)，且操作比較繁瑣，特別是部分細(xì)菌往往不能得出理想的鑒定結(jié)果，同時(shí)在細(xì)菌檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用過程中，還會(huì)出現(xiàn)結(jié)果出具時(shí)間與實(shí)際需求不匹配的情況。當(dāng)前隨著食品細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用的不斷增多，臨床上可應(yīng)用的細(xì)菌檢測(cè)方法與手段也變得愈發(fā)多元化，可應(yīng)用的檢測(cè)儀器也越來越靈敏。如何采用準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)且快捷的檢測(cè)方式為當(dāng)前食品安全檢測(cè)需重點(diǎn)關(guān)注的問題。從當(dāng)前的發(fā)展趨勢(shì)上看，食品檢測(cè)需要體現(xiàn)出快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。在食品運(yùn)輸?shù)倪^程中，進(jìn)出口商檢、質(zhì)檢人員、質(zhì)控人員及食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)都需要政府部門能夠在短時(shí)間內(nèi)取得準(zhǔn)確且及時(shí)的質(zhì)控結(jié)果。故應(yīng)用一類省力、省時(shí)且成本低的檢測(cè)方式是社會(huì)各界所迫切需要的。

本次研究中則是在常見的食源性病毒檢測(cè)中引入了FQ-PCR技術(shù)作為支持，最終檢測(cè)結(jié)果較為可觀：FQ-PCR法陽(yáng)性檢出份數(shù)為92份，高于細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出樣本份數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.114，P=0.000）。這一結(jié)果說明，應(yīng)用FQ-PCR技術(shù)相較于細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)對(duì)食源性細(xì)菌的檢出率更高。對(duì)本次研究中所涉及的檢測(cè)菌種進(jìn)行分析：①沙門菌屬：其屬于導(dǎo)致食物中毒最常見的致病菌類型，位居我國(guó)食物中毒的第一位菌種。食源性中毒所感染的菌種一般是由豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及鼠傷寒沙門氏菌所引起的。當(dāng)菌種進(jìn)入到腸道中，則會(huì)大量繁殖，使得腸道黏膜發(fā)炎。在反應(yīng)過程中，大量活菌釋放所產(chǎn)生的內(nèi)毒素還將導(dǎo)致患者機(jī)體出現(xiàn)中毒的表現(xiàn)。該菌種為出入境檢疫、畜牧獸醫(yī)、食品衛(wèi)生、公共衛(wèi)生檢測(cè)中的重要指標(biāo)之一，屬于必檢項(xiàng)目之一。當(dāng)前臨床上主要是將沙門氏菌的ssaN，invA基因作為靶基因，建立FQ-PCR的方式進(jìn)行檢測(cè)。也有學(xué)者試著將ivnA mRNA作為模板，結(jié)合反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，也在一定程度上提升了活菌檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[4]。②志賀菌：該菌種屬于細(xì)菌性痢疾中最常見的病原菌類型。各型痢疾桿菌均能夠釋放出強(qiáng)烈的內(nèi)毒素，而內(nèi)毒素在作用到腸壁時(shí)，則會(huì)使得腸壁的通透性增高，進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)體吸收內(nèi)毒素，導(dǎo)致患者出現(xiàn)中毒性休克、神經(jīng)障礙及發(fā)熱等表現(xiàn)。此外，膿血便產(chǎn)生的原因即為內(nèi)毒素作用于腸壁神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一種里急后重、腸道損傷癥狀。有學(xué)者通過將志賀菌CssrB基因的一段特異性核酸序列為靶標(biāo)，并將設(shè)計(jì)帶有FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記的發(fā)卡探針為對(duì)象，最終驗(yàn)證該檢測(cè)方式能穩(wěn)定、靈敏地檢測(cè)出志賀菌，為該菌種診斷提供了一類全新的方式[5]。③副溶血性弧菌：該菌種涉及的食品主要為海產(chǎn)品（貝類、蟹類、魚蝦）等制品，是由其直接或間接污染所導(dǎo)致。據(jù)權(quán)威數(shù)據(jù)顯示，在海產(chǎn)品中，副溶血性弧菌的帶菌率可高達(dá)45%以上。而引起食物中毒的季節(jié)主要在夏秋之間，屬于食源性疾病中最常見的致病微生物之一。而在人們生活質(zhì)量不斷提升的今天，人們所食用的海產(chǎn)品數(shù)量也在不斷增加，故因該菌感染所中毒的患者數(shù)量也在不斷增加。當(dāng)前主要將其中的gyrB、toxR、trh、tdh基因作為靶基因進(jìn)行的FQ-PCR檢測(cè)。有學(xué)者將位于toxR基因上的特異性片段作為靶基因，并應(yīng)用PGM-T為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，最終結(jié)果顯示，這類檢測(cè)結(jié)果靈敏度較佳，為40拷貝/反應(yīng)體系，且變異系數(shù)較低，均為5%以下[6]。④金黃色葡萄球菌：該菌種是一種廣泛存在于自然界中的革蘭陽(yáng)性菌類型，是導(dǎo)致細(xì)菌性食物中毒發(fā)病的主要致病菌之一。該菌種可通過與空氣接觸的方式傳播對(duì)食品造成污染。據(jù)權(quán)威數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，金黃色葡萄球菌能在多種食品中檢出，污染范圍較為廣泛。若是食物本身的加熱溫度不夠，食物中的菌種未能被有效殺死，可能導(dǎo)致食物中毒發(fā)生。從檢測(cè)手段上看，傳統(tǒng)的平板和血平板檢測(cè)法檢測(cè)存在靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)及可能產(chǎn)生假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的問題。應(yīng)用FQ-PCR檢測(cè)技術(shù)時(shí)，則主要以金黃色葡萄球菌中的耐熱核酸酶基因、腸毒素作為靶基因，能夠起到提升檢出率的效果。也有學(xué)者引入了免疫磁性分離、基質(zhì)增融等的樣本前處理方式，分析其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基質(zhì)增容及浮選法可允許在1-10CFU/ml的細(xì)胞中進(jìn)行定量檢測(cè)，這能使低濃度樣本情況下細(xì)菌的檢出率得到有效提升[7]。⑤諾如病毒又被稱為膿融病毒，該病菌在全年均可感染，且在冬季發(fā)生感染的概率最高。大多數(shù)患者發(fā)病是因食物中毒所引起的腹瀉導(dǎo)致。該病毒能夠通過被感染者污染的糞便、飛沫接觸、未煮熟的貝類、海鮮、食物、被污染的水源等傳播。從感染的人群上看，孩子、老人等體質(zhì)比較弱的人最容易感染。由于感染諾如病毒后，患者自身腹瀉的癥狀及臨床表現(xiàn)是有所差異的，故在致病菌分辨及檢查上需進(jìn)行嚴(yán)格劃分，避免出現(xiàn)誤診誤治的情況發(fā)生。一般臨床上進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)時(shí)的靶基因?yàn)橹Z如病毒GI型和GⅡ型靶基因ORF1及ORF2[8]。⑥輪狀病毒感染在2歲以下的嬰幼兒中較為常見。發(fā)病后患者的早期癥狀主要包括嘔吐及發(fā)熱等，隨后將出現(xiàn)腹瀉的癥狀，甚至出現(xiàn)脫水的表現(xiàn)。該病毒對(duì)機(jī)體多個(gè)臟器均有影響。該病屬于自限性疾病類型，自然病程5-8天，屬于嬰幼兒常見致死病因。一般臨床上進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的基因是對(duì)輪狀病毒NSP5靶基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)多對(duì)引物，利用探針篩選[9]。

從檢測(cè)原理上分析，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)上所發(fā)展出來的一種高靈敏度核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在熒光染料激發(fā)的作用下利用熒光的光能變化，直接將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化予以反應(yīng)[10]。本次結(jié)果顯示，研究中所應(yīng)用的技術(shù)能夠檢測(cè)低濃度拷貝下的病原體核酸。而分子信標(biāo)技術(shù)的應(yīng)用，也使得FQPCR檢測(cè)方式的靈敏度得到了較大的提升。此外，從檢測(cè)準(zhǔn)確度上看，由于FQ-PCR技術(shù)是在完全封閉的條件下進(jìn)行的，能夠防止外源性因素對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生影響，故提升了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，PCR檢測(cè)儀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的過程均是自動(dòng)的，無需引入如紫外線燈觀測(cè)及電泳等步驟，僅需0.5-1.2h即能夠?qū)⒄麄€(gè)PCR技術(shù)流程完成，顯著提升了檢測(cè)效率[11]。FQ-PCR檢測(cè)的PCR法與定量擴(kuò)增是同步進(jìn)行的，克服了PCR的平臺(tái)效應(yīng)，有效地打破了傳統(tǒng)PCR僅能進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)的局限性。而其應(yīng)用PMA技術(shù)作為DNA嵌入試劑，還能夠?qū)⑺劳黾?xì)菌的DNA予以清除，從源頭上避免了假陽(yáng)性情況的發(fā)生。

綜上所述，在食源性細(xì)菌檢測(cè)中引入FQ-PCR檢測(cè)技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方式，能夠有效提升檢出率，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。