施春蘭，曾舒泉，王志江，謝永輝，詹莜國(guó)，黃永迪，吳國(guó)星，高 熹，秦得強(qiáng)*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省煙草公司 昆明市公司，云南 昆明 650051）

0 前言

煙草是我國(guó)的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，在我國(guó)各地廣泛種植，栽培效益高。煙草既可以作為工業(yè)原料，又具有一定的醫(yī)療作用，如麻醉、鎮(zhèn)痛等。煙草赤星病、黑脛病、根腐病、靶斑病等是煙草生產(chǎn)上的常見病害，其中煙草黑脛病是由煙草疫霉菌侵染引起的一種毀滅性病害，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率高達(dá)80%；據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年由煙草黑脛病造成的損失高達(dá)1億元。這些病害一旦發(fā)生都會(huì)對(duì)煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量造成較大的影響［1-4］。生物防治由于具有高效、無(wú)污染、無(wú)殘留、選擇性高等特點(diǎn)，在煙草病害的防治中發(fā)揮了重要作用。生防芽孢桿菌主要包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、短小芽孢桿菌(B.pumilis)、多粘芽孢桿菌(B. polymyxa)和蠟狀芽孢桿菌(B. cereus)等［5］。

盧燦華等［6］以烘烤期煙葉柄部霉病的病原菌為指示菌，進(jìn)行拮抗菌的篩選，得到了5株有較強(qiáng)抑菌活性的菌株，其中芽孢桿菌(Bacillusspp.)Z002和05-1205菌株對(duì)該病的防效都高于70%。李小杰等［7］從健康煙田煙株根際土壤中分離篩選到1株多粘芽孢桿菌LB-9，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)煙草疫霉菌的抑制活性達(dá)到了60.6%且比較穩(wěn)定。楊德政等［8］從煙草赤星病發(fā)病嚴(yán)重的田塊取根際土壤進(jìn)行生防菌的分離、篩選，得到了1株貝萊斯芽孢桿菌Y6，通過(guò)試驗(yàn)證明其對(duì)煙草赤星病具有抑制作用。孫曉宇等［9］研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對(duì)煙草根腐病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子形成都有一定的抑制作用。陳丹陽(yáng)等［10］從四川省攀枝花健康煙田煙株根際土壤分離得到了貝萊斯芽孢桿菌CDY-6，經(jīng)過(guò)初篩試驗(yàn)與復(fù)篩試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)煙草靶斑病菌有顯著的拮抗作用。

土壤一直是生防菌的寶庫(kù)，其生防菌不僅種類多，而且活性好，煙草病害的拮抗菌大多數(shù)來(lái)自土壤［3］。本課題組從土壤中分離并篩選得到了2株對(duì)煙草黑脛病、赤星病、靶斑病、根腐病均具有較好抑制作用的拮抗細(xì)菌Gj7和Gj9。本研究通過(guò)形態(tài)特征觀察、生理生化特征測(cè)定以及16S rDNA分析，進(jìn)一步探討了這2株拮抗菌的分類地位，并優(yōu)化了其發(fā)酵條件，旨在為這2個(gè)菌株的后續(xù)研究及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣及菌株 本試驗(yàn)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2株細(xì)菌從健康煙草植株根際土壤中分離得到，土壤采集地為云南省峨山縣小街鎮(zhèn)，菌株編號(hào)為Gj7和Gj9，現(xiàn)保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min。馬鈴薯培養(yǎng)基(PSA)：馬鈴薯20 g/L，蔗糖2 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌30 min。蛋白胨酵母蔗糖培養(yǎng)基(YSP)：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂15 g/L，115 ℃滅菌30 min。牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基(NYBD)：牛肉浸膏8 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂15 g/L，115 ℃滅菌30 min。細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CM)：葡萄糖5 g/L，(NH4)2SO42 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，K2HPO44 g/L，KH2PO46 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min。蛋白胨酵母培養(yǎng)基(LB)：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min［11］。

1.2 生防菌的分離

參考尹福強(qiáng)等［12］的方法（略作改動(dòng)）。稱取待測(cè)土樣10 g，放入盛有90 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，于振蕩器上振蕩20 min后，對(duì)土壤懸液進(jìn)行梯度稀釋，分別配制成10-5、10-6、10-7稀釋梯度的土壤溶液。再分別取100 μL土壤稀釋液至LB培養(yǎng)皿中進(jìn)行涂布，并于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。待形成細(xì)菌單菌落后，用接種環(huán)分別挑取少許不同的單菌落于新制備的LB培養(yǎng)皿上，進(jìn)行劃線培養(yǎng)并逐步純化，直至無(wú)雜菌產(chǎn)生。

1.3 生防菌抑菌效果的測(cè)定

1.3.1 生防菌的平板對(duì)峙效果 使用已滅菌的打孔器（直徑5 mm）在已活化的煙草疫霉、根腐病、靶斑病、赤星病菌平板上分別打孔，再分別使用已滅菌的鑷子夾取1塊菌餅接種于另1個(gè)新的PSA平板的中央。采用“十字交叉法”將Gj7和Gj9分別對(duì)稱接種于PSA平板距菌餅2.5 cm處，再于28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，待出現(xiàn)抑菌效果后取出平板，計(jì)算抑菌率。以不接拮抗菌作為空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)［11］。

1.3.2 生防菌揮發(fā)性氣體對(duì)病原菌的抑制效果 采用對(duì)扣法［13］進(jìn)行試驗(yàn)。將涂有100 μL拮抗菌液的LB固體培養(yǎng)基與接有病原菌的PSA培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)扣培養(yǎng)，將有病原真菌的一方朝下，涂有拮抗菌液體的一方朝上。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對(duì)照組菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后取出平板，計(jì)算抑菌率。以不接拮抗菌作為空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 生防菌的鑒定

1.4.1 生防菌的形態(tài)特征觀察及生理生化特征測(cè)定 生防菌的形態(tài)特征觀察參考蘭明先等［14］的方法；生防菌的生理生化特征測(cè)定和革蘭氏染色分析參考沈萍等［15］《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》中的方法。

1.4.2 生防菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 分別提取Gj7和Gj9菌株的基因組DNA，以此為模板，選擇細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R（5′-GGTTACCTTGTTAGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL：PCR Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，Rnase H2O 18 μL。擴(kuò)增條件為：94.8 ℃預(yù)變性2.5 min；98 ℃10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將產(chǎn)物送昆明擎科生物公司測(cè)序。得到菌株的16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果后，在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)。最后，使用Clustal X1.83和MEGA 7軟件分析其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系，并構(gòu)建進(jìn)化樹［11］。

1.5 生防菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.5.1 種子液制備 挑取菌株Gj7和Gj9的單菌落于100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，得到種子液，備用。

1.5.2 最適培養(yǎng)基的優(yōu)化 參考蘭明先等［16］的方法（有所改動(dòng)），配制YSP、NYBD、NA、LB和CM培養(yǎng)基各100 mL，分別接入50 μL種子液，于28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定不同培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600值，篩選出最佳培養(yǎng)基［17］。每組重復(fù)3次，下同。

1.5.3 最適碳源的篩選 以1.5.2篩選出的最適培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉作為碳源，培養(yǎng)基中的其他成分均保持不變。于28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定不同碳源培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600值，篩選最佳碳源。

1.5.4 最適氮源的篩選 采用上述最適培養(yǎng)基，分別以氯化銨、酵母浸粉、硝酸銨、酪氨酸、谷氨酸作為氮源，培養(yǎng)基中的其他成分均保持不變。于28℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定不同氮源培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600值，篩選最佳氮源。

1.5.5 最適接菌量的篩選 采用最適培養(yǎng)基，將種子液分別以0.05%、0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、2.5%（體積分?jǐn)?shù)）的接菌量接入培養(yǎng)基中。于28℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定不同接菌量處理細(xì)菌的OD600值，篩選最佳接菌量。

1.5.6 最適裝液量的篩選 采用最適培養(yǎng)基，將初始裝液量分別換為30、60、90、120、150 mL，接入種子液。于28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定不同裝液量處理細(xì)菌的OD600值，篩選最佳裝液量。

1.5.7 最適初始pH值的篩選 采用最適培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)其pH值為4、5、6、7、8、9、10，接入種子液，于28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定不同pH值培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600值，篩選出培養(yǎng)基的最佳初始pH值。

1.5.8 最適轉(zhuǎn)速的篩選 采用最適培養(yǎng)基，分別設(shè)置搖床的轉(zhuǎn)速為120、150、180、210、240 r/min，接入種子液，在優(yōu)化條件下振蕩培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600值，篩選出最佳轉(zhuǎn)速。

1.5.9 最適溫度的篩選 采用最適培養(yǎng)基，分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為20、24、28、32、36、40 ℃，接入種子液，在優(yōu)化條件下振蕩培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600值，篩選出最佳培養(yǎng)溫度。

1.5.10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 采用最適培養(yǎng)基，接入種子液，在上述優(yōu)化條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)0～24 h期間每隔2 h測(cè)量1次OD600值，培養(yǎng)24 h后每隔12 h測(cè)量1次OD600值，繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，篩選出最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0、GraphPad Prism 8.0和Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析和圖表制作；采用Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)不同處理間的差異顯著性。

抑菌率的計(jì)算公式［11］為：抑菌率（%）=［（對(duì)照平板菌落直徑-處理平板菌落直徑）/對(duì)照平板菌落直徑］×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌的抑菌效果

2.1.1 平板對(duì)峙結(jié)果 由表1和圖1可以看出：Gj7和Gj9菌株對(duì)煙草黑脛病、赤星病、靶斑病以及根腐病菌均有一定的抑制效果，平板抑制效果均超過(guò)了60%；這2株菌對(duì)煙草靶斑病菌的平板抑制效果最好，抑制率分別達(dá)到了76.10%和77.30%。

圖1 2株生防菌對(duì)4種煙草病原真菌的抑制效果

表1 Gj7和Gj9菌株對(duì)煙草不同病原菌的平板對(duì)峙效果

2.1.2 生防菌的揮發(fā)性氣體對(duì)煙草病菌的抑制效果 由表2可以看出：Gj7和Gj9菌株的揮發(fā)性氣體對(duì)煙草黑脛病、赤星病、靶斑病、根腐病菌均有抑制效果，其中Gj7對(duì)4種病原菌的平板抑制率都超過(guò)了55%；Gj9對(duì)煙草黑脛病和赤星病菌的平板抑制率都超過(guò)了55%，但該菌株對(duì)煙草靶斑病和根腐病菌的平板抑制率不高。

表2 Gj7和Gj9的揮發(fā)性氣體對(duì)煙草不同病原菌的抑制效果

2.2 生防菌的鑒定結(jié)果

2.2.1 拮抗菌的形態(tài)特征觀察及生理生化特征測(cè)定 由圖2可以看出：Gj7在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，單菌落為圓形、乳白稍黃菌落，表面粗糙不規(guī)則，有很多隆起、褶皺，菌體為桿狀，芽孢橢圓形；Gj9單菌落為淡黃色不透明菌落，表面隆起，邊緣不規(guī)則，桿狀菌體，芽孢橢圓形；這2個(gè)菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，其生理生化特征測(cè)定結(jié)果如表3所示。

圖2 2個(gè)菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果

表3 菌株Gj7和Gj9的生理生化特征測(cè)試結(jié)果

2.2.2 拮抗菌的分子鑒定結(jié)果 將Gj7和Gj9校對(duì)后的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明：Gj7與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有較高的相似性，Gj9與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有較高的相似性。下載同源性較高的序列，使用ClustalX 1.83和MEGA 7軟件對(duì)這2個(gè)菌株進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。根據(jù)構(gòu)建的進(jìn)化樹（圖3、圖4），并結(jié)合其形態(tài)特征和生理生化特征，初步鑒定菌株Gj7為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，Gj9為枯草芽孢桿菌(B. subtilis)。

圖3 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的Gj9的進(jìn)化樹

圖4 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的Gj7的進(jìn)化樹

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 從圖5可以看出，Gj9和Gj7菌株在供試的5種培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)情況在不同培養(yǎng)基間存在顯著性差異。具體來(lái)說(shuō)，Gj9、Gj7均在YSP培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，其OD600值分別達(dá)到了2.15和2.11；Gj9和Gj7均在CM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，其OD600值分別只有0.39和0.03。因此，Gj9和Gj7菌株的最適培養(yǎng)基均為YSP培養(yǎng)基。

圖5 培養(yǎng)基對(duì)Gj9、Gj7菌株生長(zhǎng)的影響

2.3.2 不同碳源對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 如圖6所示：Gj9、Gj7菌株在5種碳源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)；蔗糖為Gj9菌株的最適發(fā)酵碳源，其OD600值達(dá)1.99；葡萄糖為Gj7菌株的最適發(fā)酵碳源，其OD600值達(dá)2.03；Gj9和Gj7在碳源為淀粉的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)均較差，其OD600值分別僅為0.86和0.95。

圖6 不同碳源對(duì)Gj9、Gj7菌株生長(zhǎng)的影響

2.3.3 不同氮源對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 如圖7所示：Gj9、Gj7菌株在NH4Cl、酵母膏、NH4NO3、酪氨酸這4種氮源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)；酵母膏是2個(gè)菌株的最適氮源，其OD600值分別達(dá)到了2.24和2.12；Gj9和Gj7均幾乎不能在氮源為谷氨酸的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，其OD600值分別僅為0.004和0.022。

圖7 不同氮源對(duì)Gj9、Gj7菌株生長(zhǎng)的影響

2.3.4 初始接菌量對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 從圖8可以看出：當(dāng)初始接菌量為100 μL時(shí)，Gj7的OD600值最大，為2.24，因此，100 μL為Gj7的最適初始接菌量；當(dāng)初始接菌量為2000 μL時(shí)，Gj9的OD600值最大（2.11），因此，2000 μL是Gj9的最適初始接菌量。

圖8 初始接菌量對(duì)Gj9、Gj7菌株生長(zhǎng)的影響

2.3.5 裝液量對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 由圖9可見：在不同裝液量處理之間2個(gè)菌株的生長(zhǎng)均存在顯著性差異；當(dāng)裝液量為30 mL時(shí)，Gj9、Gj7的OD600值均最大，分別達(dá)到了2.28和2.48，因此，30 mL是這2個(gè)菌株發(fā)酵培養(yǎng)的最適裝液量。

圖9 裝液量對(duì)Gj9、Gj7菌株生長(zhǎng)的影響

2.3.6 初始pH值對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 如圖10所示，在不同pH值處理之間2個(gè)拮抗細(xì)菌菌株的生長(zhǎng)均存在顯著性差異。Gj9生長(zhǎng)的適宜pH值范圍為6～9，最適pH值為8，此時(shí)其OD600值達(dá)2.29；Gj7生長(zhǎng)的適宜pH值范圍為6～10，最適pH值為10，此時(shí)其OD600值達(dá)2.36。

圖10 初始pH值對(duì)Gj9、Gj7菌株生長(zhǎng)的影響

2.3.7 轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 如圖11所示，在不同轉(zhuǎn)速條件下細(xì)菌的生長(zhǎng)存在顯著性差異。當(dāng)轉(zhuǎn)速為240 r/min時(shí)，Gj9、Gj7菌株的生長(zhǎng)量均達(dá)到最大，其OD600值分別達(dá)2.24和2.26，所以240 r/min是這2個(gè)菌株發(fā)酵培養(yǎng)的最適轉(zhuǎn)速。

圖11 不同轉(zhuǎn)速對(duì)Gj9、Gj7菌株生長(zhǎng)的影響

2.3.8 溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 從圖12可以看出：Gj9、Gj7在20～40 ℃的溫度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)；Gj9菌株生長(zhǎng)的最適溫度為24 ℃，在此條件下其OD600值達(dá)2.08；Gj9菌株在40 ℃下的OD600值顯著降低；Gj7菌株生長(zhǎng)的最適溫度為36 ℃左右，在此溫度條件下其OD600值為2.15；在20 ℃下Gj7菌株的生長(zhǎng)量顯著降低。

圖12 不同溫度對(duì)Gj9、Gj7菌株生長(zhǎng)的影響

2.3.9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 如圖13所示，Gj9、Gj7菌株的生長(zhǎng)曲線均類似于“S”形。具體而言，在培養(yǎng)0～4 h期間，2個(gè)菌株的生長(zhǎng)較為緩慢，該時(shí)期為細(xì)菌生長(zhǎng)的遲緩期；在培養(yǎng)4～14 h期間，Gj7菌株的生長(zhǎng)量開始迅速增加，該時(shí)期為該菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，在第14 h時(shí)其生長(zhǎng)速率最高，此時(shí)OD600值為2.14；培養(yǎng)4～16 h期間為Gj9菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，該菌株在16 h時(shí)達(dá)到最大生長(zhǎng)量，此時(shí)OD600值為2.28；在培養(yǎng)14～22 h期間為Gj7菌株的生長(zhǎng)穩(wěn)定期，16～36 h為Gj9菌株的生長(zhǎng)穩(wěn)定期；第22 h后，Gj7菌株的生長(zhǎng)量開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，為生長(zhǎng)衰亡期，而Gj9菌株的生長(zhǎng)衰亡期在36 h以后。

圖13 發(fā)酵時(shí)間對(duì)Gj9、Gj7菌株生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌具有使用安全、生長(zhǎng)迅速等特性，可以產(chǎn)生耐高溫的芽孢，對(duì)逆境有較強(qiáng)的抵抗力，在有氧或無(wú)氧環(huán)境下均可以生長(zhǎng)，而且可以產(chǎn)生諸如伊枯草菌素、細(xì)菌素和表面活性素等具有抑菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在抑制病原菌生長(zhǎng)和繁殖方面具有舉足輕重的作用。芽孢桿菌的生防機(jī)制有競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、溶菌、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等［18-21］。煙草病害的拮抗菌大多數(shù)來(lái)源于土壤和植物本體，說(shuō)明土壤和植物生防菌資源豐富［3］。

筆者從煙草根際土壤中分離得到了2株細(xì)菌Gj7和Gj9，這2株菌在平板對(duì)峙試驗(yàn)中對(duì)煙草黑脛病、赤星病、根腐病以及靶斑病菌都有較好的抑制效果?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌中的模式菌，該類細(xì)菌可以產(chǎn)生包括肽類、酯肽類、氨基酸類等在內(nèi)的70多種抗菌物質(zhì)，通過(guò)分泌這些抗菌物質(zhì)對(duì)病原真菌和細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜造成破壞，進(jìn)而發(fā)揮抑制作用［22］?？莶菅挎邨U菌在細(xì)菌性病害、真菌性病害以及病毒病害防治方面都可以發(fā)揮作用，例如，芽孢桿菌SH7的代謝產(chǎn)物以及枯草芽孢桿菌T2G6均可以防治煙草青枯病，枯草芽孢桿菌Tpb55對(duì)煙草TMV有很好的鈍化、預(yù)防治療效果［23］。何明川等［11］從美洲大蠊腸道分離得到的枯草芽孢桿菌MC4-2可用于煙草黑脛病的防治。解淀粉芽孢桿菌作為一類根際促生菌［17］，其在土壤改良以及植物生長(zhǎng)方面可以發(fā)揮很大的作用，它通過(guò)代謝物的拮抗作用、影響致病菌的定殖以及調(diào)控植物代謝途徑等方式在植物病害防治方面也可以發(fā)揮較大的作用，對(duì)由鏈格孢菌［24］、平頭炭疽菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、腐皮鐮刀菌、甘蔗鞭孢堆黑粉菌以及稻梨孢菌等眾多病原菌引致的病害均具有一定的防治效果［25］。

芽孢桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生芽孢和多種活性物質(zhì)，可以提高菌株對(duì)環(huán)境的耐受力［18］。因此通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)探索芽孢桿菌菌株的最適生長(zhǎng)條件非常有必要。本研究采用單因素試驗(yàn)對(duì)Gj7和Gj92菌株的基本培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出Gj7菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蛋白胨1.00 g，酵母浸粉0.50 g，蔗糖2.00 g，蒸餾水100 mL；最佳發(fā)酵條件為pH值8，轉(zhuǎn)速240 r/min，裝液量60 mL，溫度24 ℃，發(fā)酵時(shí)間22 h。Gj9菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蛋白胨1.00 g，酵母浸粉0.50 g，葡萄糖2.00 g，蒸餾水100 mL；最佳發(fā)酵條件為pH值6，轉(zhuǎn)速240 r/min，裝液量30 mL，溫度36 ℃，發(fā)酵時(shí)間14 h。將Gj7菌株與何明川等［11］從美洲大蠊腸道分離得到的MC4-2枯草芽孢桿菌、張夢(mèng)君等［26］從根際土壤中分離得到的HXP-5枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)三者的最適溫度分別為24、32、27 ℃，2株來(lái)自土壤的枯草芽孢桿菌Gj7和HXP-5的最短溫度相近，而從腸道分離的MC4-2的最適溫度高于30 ℃；三者的最適裝液量分別為60、100、30 mL，相差不大；三者的最佳轉(zhuǎn)速分別為210、210、240 r/min，無(wú)明顯差異；三者的最適氮源均為蛋白胨和酵母浸粉；MC4-2和Gj7的最適碳源均為蔗糖；3株菌生長(zhǎng)的最適pH值都在7～8范圍內(nèi)；菌株MC4-2在培養(yǎng)60 h時(shí)生長(zhǎng)量達(dá)到最大，而Gj7菌株在培養(yǎng)22 h時(shí)生長(zhǎng)量達(dá)到最大。除了最適溫度、最佳發(fā)酵時(shí)間差異較大外，三者的其他最適條件差異均不明顯。將Gj9菌株與分離自堅(jiān)尼草的JNC2菌株［27］、分離自土壤的LJ1菌株［28］進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)三者的最適溫度均在30～34 ℃；最適轉(zhuǎn)速均在210～240 r/min；最適pH值在5～6之間；Gj9和JNC2的最適氮源均為蛋白胨和酵母浸粉；Gj9和LJ1的最適碳源均為蔗糖；JNC2菌株在培養(yǎng)72 h時(shí)生長(zhǎng)量達(dá)到最大，而LJ和Gj9菌株均在培養(yǎng)14 h時(shí)達(dá)到最大生長(zhǎng)量。綜上所述，即使為同一種菌株，由于來(lái)源、生境條件等不同，其生理生化特性及最佳發(fā)酵條件也會(huì)存在差異。

拮抗細(xì)菌的代謝產(chǎn)物在抑制病原菌過(guò)程中能發(fā)揮重要作用。王智敏等［29］對(duì)解淀粉芽孢桿菌JK的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性物質(zhì)含有醛類、酯類、酮類等，其中己醛具有較好的抑菌作用。通過(guò)GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)4-乙基苯酚、2-丙基環(huán)己酮這2種成分可能是解淀粉芽孢桿菌LJ02發(fā)揮抑菌活性最重要的氣體成分，對(duì)黑腐皮殼菌、草莓灰霉病菌、棗漿胞病等病原菌都有很好的抑制作用［30］。通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用（GC/MS）法，Chaurasia等［31］發(fā)現(xiàn)由1株拮抗枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能導(dǎo)致病原真菌菌絲和孢子的畸形。

上述研究結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在植物病害生物防治中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。在本研究中，2株菌對(duì)不同的煙草真菌性病菌有較好的抑制效果，其揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)煙草病原菌也有一定的抑制作用，說(shuō)明兩者均具有較大的生防潛力。但對(duì)其在平板上擴(kuò)散的抗菌物質(zhì)與揮發(fā)性抗菌物質(zhì)還有待于深入分析，以提高其應(yīng)用價(jià)值。