李威亞，潘美紅，惠林沖，陳 微，張仕林，繆美華，陳振泰，何林玉，楊海峰

（連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000）

洋蔥(Allium cepaL.)是百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)中以肉質(zhì)鱗片和鱗芽構(gòu)成產(chǎn)品器官的二年生草本植物，20世紀(jì)初傳入我國。目前中國的洋蔥種植面積與總產(chǎn)量均居世界第1位［1-2］。我國洋蔥栽培歷史較短，種質(zhì)資源相對匱乏，育種水平與國際先進(jìn)水平相比尚有很大的差距。我國洋蔥育種目前仍以常規(guī)選育為主，主要通過引種、雜交、選種等手段選育新品種，存在周期長、工作量大等問題?，F(xiàn)在國內(nèi)生產(chǎn)上應(yīng)用的洋蔥主要雜交種仍以引進(jìn)為主，每年需要花費大量的外匯從國外進(jìn)口種苗，并且一些進(jìn)口品種由于適應(yīng)性等問題，常給生產(chǎn)造成不必要的損失，對進(jìn)一步擴(kuò)大洋蔥的生產(chǎn)規(guī)模產(chǎn)生了不利的影響。因此選育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的洋蔥雜交種，解決進(jìn)口依賴問題，是我國洋蔥生產(chǎn)的當(dāng)務(wù)之急。

洋蔥為典型的異花授粉作物，其常規(guī)的親本選育方法具有育種周期長、工作量大、育種效率低等弊端［3-5］。并且與其他植物相比，洋蔥帶有不利的隱性基因，在經(jīng)過長期異交后其自交系衰退嚴(yán)重，通常只能自交2～3次。目前常采用在少量全同胞子代內(nèi)混合授粉的方法培育洋蔥自交系，這種自交系由于其本身的基因具有一定的雜合度，因此，將其作為雜交親本會在一定程度上影響雜種優(yōu)勢的表現(xiàn)，而育成1個優(yōu)良的洋蔥自交系需要6～10 a。洋蔥離體雌核誘導(dǎo)與單倍體愈傷再生技術(shù)是直接利用離體花蕾進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，促進(jìn)胚珠內(nèi)的雌配子發(fā)育成單倍體植株，所培養(yǎng)植株的基因型和表現(xiàn)型是相同的，可以方便地鑒定出所需要的個體；同時結(jié)合愈傷再成苗技術(shù)，可以快速地形成單倍體純系群體，便于加倍誘導(dǎo)、篩選和相關(guān)研究利用，而且能夠應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)材料的快速繁育［6-7］。單倍體群體通過自然加倍或者人工加倍可以得到正常雙單倍體群體，采用該方法僅需2～3 a時間就可以得到穩(wěn)定、純合的洋蔥株系；經(jīng)品質(zhì)性狀篩選，目標(biāo)株系既能作為常規(guī)種使用，也可以作為親本材料配制雜交種，結(jié)合傳統(tǒng)育種方法可大幅提高我國洋蔥的育種效率和水平。此外，采用該技術(shù)獲得的雙單倍DH系群體由于不存在基因間顯隱性作用，還是基因多效性分析、目標(biāo)基因分離、基因精細(xì)定位和克隆等研究的理想材料。

本研究以不同熟期、皮色、球型的中日照洋蔥品種為試驗材料，經(jīng)不同預(yù)處理后，采用不同的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)洋蔥的離體花蕾，以獲得單倍體植株；通過比較不同單倍體的誘導(dǎo)率，進(jìn)一步對洋蔥離體雌核單倍體誘導(dǎo)技術(shù)中的材料處理、技術(shù)操作及培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，以提高誘導(dǎo)出苗率。同時探究了洋蔥單倍體的組培快繁技術(shù)，以期為后續(xù)加倍誘導(dǎo)等研究提供材料保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自有的5個中日照洋蔥品種，如表1所示。

表1 洋蔥雌核誘導(dǎo)材料

1.2 預(yù)處理及培養(yǎng)方法

2019年9月將試驗材料種植于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院東辛試驗基地，2020年5月收獲鱗莖；將收獲的鱗莖存放在庫房，至2020年10月時再次種植。2021年5月取部分花蕾開放的花薹作試材，用塑料袋包裝后放入4 ℃冰箱，進(jìn)行2 d的冷藏預(yù)處理。選取直徑為3.0～5.5 mm、未開放的花蕾，剪切（留2～3 mm的花梗），用作外植體；用紗布包裹外植體，先用自來水沖洗20 min，然后用70%酒精消毒30 s，最后用超純無菌水沖洗2次。繼續(xù)按以下2個方案對外植體進(jìn)行消毒：（1）放入濃度為10%的NaClO溶液消毒7～10 min，然后用超純無菌水沖洗3次；（2）放入0.1% HgCl2溶液消毒7 min，然后用超純無菌水沖洗3次。消毒完成后，將外植體接種在含有NAA(或2,4-D)和6-BA等不同激素配比的B5培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)瓶接種10個花蕾。每升培養(yǎng)基均加100.0 g蔗糖和6.5 g瓊脂，用1% NaOH調(diào)其pH值至6.0；用240 mL規(guī)格的培養(yǎng)瓶分裝50 mL培養(yǎng)基，擰上配有透氣孔的瓶蓋后，將培養(yǎng)瓶放入120 ℃高壓鍋內(nèi)滅菌20 min，冷卻后備用。外植體消毒及移植均按組織培養(yǎng)操作規(guī)范于超凈工作臺內(nèi)完成。將接種的試驗材料放置于25 ℃恒溫、0～35 μmol/(m2·s)光強(qiáng)、16 h/d光照時間的組培室內(nèi)，誘導(dǎo)培養(yǎng)5個月。

培養(yǎng)的花蕾裂開長出胚狀體后，將胚狀體接種在含不同配比激素(2,4-D和6-BA)的MS培養(yǎng)基中，于25 ℃恒溫、黑暗條件下進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)、擴(kuò)繁，每20 d繼代培養(yǎng)1次。50 d后，將愈傷組織接種在含不同配比激素(2,4-D和6-BA)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行再生芽誘導(dǎo)，30 d后將生成的小苗接種在含不同配比激素(2,4-D和6-BA)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)。生成完整植株后，將植株接植于無激素的MS培養(yǎng)基中自由生長。再生芽誘導(dǎo)、生根誘導(dǎo)和植株培養(yǎng)的條件均為25 ℃恒溫、0～35 μmol/(m2·s)光強(qiáng)、16 h/d光照時間。培養(yǎng)基均加30.0 g蔗糖和6.5 g瓊脂，用1% NaOH調(diào)其pH值至6.0。胚狀體及生根誘導(dǎo)用直徑240 mL規(guī)格的培養(yǎng)瓶分裝30 mL培養(yǎng)基，植株生長培養(yǎng)用250 mL錐形瓶分裝30 mL培養(yǎng)基，均于120 ℃高壓鍋內(nèi)滅菌20 min。試材移植、繼代培養(yǎng)均按組織培養(yǎng)操作規(guī)范于超凈工作臺內(nèi)完成。

1.3 倍性鑒定、煉苗及定植

再生植株生長至3葉1心后，取植株的新鮮葉片0.5 cm2，置于10 cm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入1.0 mL Kiwifruit Buffer裂解液，隨后快速用刀片切碎葉片，靜置萃取60 s；將樣品用30 μm孔徑的小濾網(wǎng)過濾至1.5 mL離心管，放置于4 ℃冰箱冷藏5 min。取出樣品離心5 min，倒去上清液，分別加入60 μL預(yù)冷的PI染色液和600 μL解離液，于4 ℃黑暗條件下染色15 min。然后采用Beckman Colour流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定，以正常二倍體植株為對照，由儀器直接繪制出DNA曲線圖，其縱坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)量，縱坐標(biāo)峰值的高低反映細(xì)胞比例的不同?？v坐標(biāo)峰值對應(yīng)的熒光強(qiáng)度X-Mean（橫坐標(biāo)）與細(xì)胞DNA含量成正比，所以可以根據(jù)各樣本X-Mean值的比例關(guān)系判斷倍性，例如，將對照的二倍體峰調(diào)整在橫坐標(biāo)200位置，則四倍體峰會出現(xiàn)在400位置，三倍體峰會出現(xiàn)在300位置，而峰值仍出現(xiàn)在200位置的則為二倍體。

在倍性檢測完成后，將準(zhǔn)備的基質(zhì)分裝入營養(yǎng)缽，將鑒定篩選的單倍體植株移栽至營養(yǎng)缽中，放置于玻璃溫室馴化生長15 d，然后將4～5葉1心的幼苗移栽至大田，觀察單倍體植株在大田的開花結(jié)籽情況，以進(jìn)一步驗證其倍性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對離體花蕾培養(yǎng)污染率的影響

從表2可以看出：5個洋蔥品種花蕾外植體經(jīng)0.1% HgCl2溶液消毒后，在培養(yǎng)后第30天，其污染率為32.3%～48.3%，明顯低于經(jīng)10% NaClO溶液消毒后的污染率，說明前者的消毒效果明顯優(yōu)于后者，重金屬汞離子的滲透性較好，可以穿透花蕾萼片等進(jìn)行深層次消毒。

表2 NaClO和HgCl2溶液對不同洋蔥品種花蕾的消毒效果（培養(yǎng)30 d時）

將未開放的花蕾移植于培養(yǎng)瓶，于組培室培養(yǎng)，第3天開始觀察到污染現(xiàn)象（圖1、圖2）；在培養(yǎng)后7～15 d污染發(fā)生最多，在此期間的污染主要是由外植體消毒不徹底或試驗操作不當(dāng)引起的；此后的污染數(shù)慢慢變少，在30 d之后較少出現(xiàn)污染。

圖1 霉菌污染

2.2 離體花蕾的誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)育過程

將離體花蕾接種在含不同配比激素（NAA或2,4-D+6-BA）的B5誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從第2天開始有部分花蕾開放。由于培養(yǎng)瓶內(nèi)氣體環(huán)境穩(wěn)定，花藥和花粉很難接觸到柱頭，第5天花藥開始萎蔫消失。后續(xù)花蕾逐漸膨大飽滿，個別花蕾出現(xiàn)脫分化現(xiàn)象或基部出現(xiàn)愈傷組織。培養(yǎng)60 d后花蕾開始萎縮轉(zhuǎn)黃，個別裂開而長出胚狀體，在培養(yǎng)70～100 d期間胚狀體出現(xiàn)最多，后續(xù)逐漸減少（圖3）。

圖2 細(xì)菌污染

2.3 不同激素組成對胚狀體誘導(dǎo)效果的影響

含不同配比激素的B5培養(yǎng)基對洋蔥離體花蕾的誘導(dǎo)效果如表3、表4所示。含不同配比激素NAA+6-BA的B5培養(yǎng)基對離體花蕾的誘導(dǎo)成功率（出胚率）明顯低于含不同配比2,4-D+6-BA的，說明2,4-D與6-BA搭配較適合于洋蔥離體雌核胚狀體的誘導(dǎo)。

表3 B5培養(yǎng)基中2,4-D和6-BA濃度對洋蔥離體雌核胚狀體誘導(dǎo)的影響

連蔥11號、連蔥9號、連蔥15號、3號這4個洋蔥品種在2,4-D和6-BA濃度均為2.0 mg/L的B5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率最高，在2,4-D和6-BA濃度均為1.5 mg/L的B5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率次之。連蔥17號在2,4-D和6-BA濃度均為1.5 mg/L的B5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率最高，在2,4-D和6-BA濃度均為2.0 mg/L的B5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率次之。說明在B5培養(yǎng)基中2.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L 6-BA的激素配比最適于洋蔥離體花蕾雌核胚狀體的誘導(dǎo)發(fā)育，1.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA的激素配比次之。

2.4 不同品種胚狀體誘導(dǎo)率的差異

據(jù)表3、表4數(shù)據(jù)，3號材料相較于其他品種誘導(dǎo)率最高，在2,4-D和6-BA濃度均為2.0 mg/L的B5培養(yǎng)基中成功誘導(dǎo)出46個胚狀體，出胚率達(dá)4.6%；而連蔥17號的誘導(dǎo)率在5個品種中最低，在含1.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA 或2.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L 6-BA的B5培養(yǎng)基中出胚率只有0.5%或0.2%。在含不同配比NAA+ 6-BA的B5培養(yǎng)基中，只有連蔥15號和3號誘導(dǎo)出胚狀體，且后者的出胚率明顯高于前者的，3號材料在含1.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA的B5培養(yǎng)基中出胚率最高，達(dá)1.0%。以上結(jié)果說明不同基因型洋蔥離體雌核胚狀體誘導(dǎo)對激素種類和濃度的要求不同。

2.5 愈傷擴(kuò)繁與植株再生

將胚狀體移植在含不同配比2,4-D和6-BA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷擴(kuò)繁和成苗誘導(dǎo)培養(yǎng)，供試培養(yǎng)基及其激素配比如表5所示。

表5 MS培養(yǎng)基中2,4-D和6-BA的濃度設(shè)置 mg/L

胚狀體在2,4-D和6-BA均未添加的MS培養(yǎng)基上生長成正常植株，但無愈傷出現(xiàn)。5個品種材料在含1.5 mg/L 2,4-D+2.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上均誘導(dǎo)出愈傷組織，且愈傷誘導(dǎo)率均接近100%，說明該培養(yǎng)基組成較適于離體雌核胚狀體的愈傷誘導(dǎo)。

連蔥9號、連蔥17號和連蔥11號產(chǎn)生的愈傷組織在2,4-D和6-BA均未添加的MS培養(yǎng)基上再生芽誘導(dǎo)成功率最高，均在75%左右。3號材料的愈傷組織在2,4-D和6-BA均未添加的MS培養(yǎng)基上再生芽誘導(dǎo)成功率在30%左右，而連蔥15號在此培養(yǎng)基上未產(chǎn)生再生芽。

連蔥9號、連蔥17號、連蔥11號和3號的再生芽在只含0.5 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，1周內(nèi)均產(chǎn)生了根系；這4個品種材料在未添加任何激素的MS培養(yǎng)基上也產(chǎn)生了正常根系，但所需時間較長，說明一定濃度的2,4-D能促進(jìn)再生芽的根系產(chǎn)生（圖4）。

2.6 倍性鑒定及煉苗定植

取3葉1心的洋蔥胚狀體再生幼苗葉片，以二倍體正常植株為對照，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性檢測。如圖5所示：僅有2個3號材料的離體花蕾誘導(dǎo)植株群體顯現(xiàn)出二倍體波峰；其余材料均顯現(xiàn)出單倍體波峰，單倍體誘導(dǎo)率達(dá)97%以上。與染色體計數(shù)等傳統(tǒng)方法相比，流式細(xì)胞儀倍性檢測方法簡便、迅速，可應(yīng)用于再生誘導(dǎo)植株大群體的倍性檢測。

將篩選得到的單倍體植株移栽至裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，放置于玻璃溫室進(jìn)行煉苗；待幼苗生長至4～5葉1心時將其移栽至大田。按照該煉苗、定植步驟，洋蔥單倍體植株在大田的定植存活率在90%以上。

3 討論

單倍體育種作為一種新的育種途徑，與常規(guī)選育法相比，其在較短時間內(nèi)便可以選育出整齊一致的純系，在育種時間和成本上都有很大的優(yōu)勢，因此日益受到研究人員與育種家們的重視。迄今，已經(jīng)成功建立了多種作物的單倍體育種技術(shù)體系，并育成了相應(yīng)的新品種，如辣椒、茄子、大白菜、水稻、玉米等［8-14］。本研究以建立洋蔥單倍體育種技術(shù)體系為目標(biāo)，利用洋蔥的離體花蕾進(jìn)行雌核單倍體的誘導(dǎo)，結(jié)果胚狀體的誘導(dǎo)成功率最高達(dá)4.6%，單倍體的誘導(dǎo)成功率達(dá)97%。單倍體再生植株的大田存活率達(dá)90%以上，并提高了鑒定、篩選優(yōu)質(zhì)材料的效率和準(zhǔn)確性，解決了洋蔥育種周期長、選育品種性狀整齊度差等問題。

本研究的5個洋蔥品種材料在熟期、皮色等性狀特征上有較大的區(qū)別，它們的雌核誘導(dǎo)和愈傷、擴(kuò)繁結(jié)果也有較大的差異，說明不同基因型材料對培養(yǎng)基和激素配比的適應(yīng)性不同。今后擬進(jìn)一步篩選、優(yōu)化適于不同基因型材料的特定培養(yǎng)基，以進(jìn)一步提高洋蔥單倍體育種的效率。

今后有必要進(jìn)一步研究洋蔥單倍體植株形成的分子、細(xì)胞、生物學(xué)機(jī)制，建立切實可行的雙單倍加倍技術(shù)體系，完善洋蔥單倍體育種技術(shù)體系。同時，應(yīng)研究不同染色體倍性對洋蔥特定表型性狀、物質(zhì)合成的影響，以及單個基因不同倍性的作用機(jī)制及其表達(dá)效應(yīng)，填補(bǔ)國內(nèi)外在該研究領(lǐng)域的空白。

4 結(jié)論

洋蔥的離體花蕾外植體適宜采用0.1% HgCl2溶液消毒。在B5培養(yǎng)基中，2.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L 6-BA的激素配比最適于洋蔥離體花蕾雌核胚狀體的誘導(dǎo)，出胚率最高達(dá)4.6%；在MS培養(yǎng)基中，1.5 mg/L 2,4-D+2.5 mg/L 6-BA的激素配比最適于洋蔥雌核胚狀體的愈傷誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率接近100%；在不含任何激素的MS培養(yǎng)基中，再生芽的誘導(dǎo)成功率最高，達(dá)75%左右；在只含0.5 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基中，再生芽均能誘導(dǎo)出根系。

經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，采用以上外植體消毒、培養(yǎng)基和激素配比等培養(yǎng)條件，洋蔥離體雌核單倍體的誘導(dǎo)成功率達(dá)97%。洋蔥單倍體植株移栽至裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，放置于玻璃溫室進(jìn)行煉苗，在大田定植后存活率在90%以上。