牛靜靜，薛 燕，楊 潔

三門峽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 三門峽 472000

急性髓系白血病（AML）屬血液系統(tǒng)惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞通常起始于尚未分化為白細(xì)胞的骨髓細(xì)胞，或者其他類型的造血細(xì)胞，表現(xiàn)為原始的腫瘤細(xì)胞大量增生，引起外周血的異常改變［1］。其主要癥狀有貧血、出血、感染、全身肝脾和淋巴結(jié)腫大等，目前，主要通過化療或移植控制疾病，達(dá)到緩解狀態(tài)后，仍舊有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險，其根本原因是仍有微小病灶的殘留。復(fù)發(fā)后的疾病治療起來更加棘手，因此最大程度的清除微小病灶可大大提高患者生存率，延長緩解期［2-3］?；谀壳澳[瘤免疫治療的研究如火如荼，有研究報道［4-5］，細(xì)胞免疫功能直接關(guān)系到血液系統(tǒng)腫瘤疾病的形成、發(fā)展和預(yù)后，在這之中，T 淋巴細(xì)胞作為關(guān)鍵的免疫細(xì)胞，受病原體的刺激后可產(chǎn)生細(xì)胞毒T細(xì)胞，該細(xì)胞可特異針對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮免疫作用。然而，現(xiàn)罕有報道指出T淋巴細(xì)胞亞群參與AML 疾病的作用，對疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的聯(lián)系仍未明確。因此，本研究將選取健康人群、AML 復(fù)發(fā)患者及未復(fù)發(fā)患者為研究對象，探討T 淋巴細(xì)胞亞群在不同人群間的分布，并進(jìn)一步闡述其對預(yù)測復(fù)發(fā)所帶來的作用，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016 年4 月—2018 年4 月三門峽市中心醫(yī)院收治的100 例急性髓系白血病患者病歷資料，作為初診AML 組，該組男45 例，女55 例，平均年齡（28.31±5.28）歲；同時選取同時期正常體檢的20名健康人，作為健康人群組，該組男11例，女9例，平均年齡（28.66±5.88）歲。兩組患者一般資料具有可比性（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）在醫(yī)院首次確診為AML。（2）發(fā)病時間在1 周以內(nèi)。（3）排查其他惡性腫瘤的可能。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病程超于一星期。（2）多臟器衰竭。（3）妊娠期婦女。（4）既往接受過其他治療。（5）長期免疫抑制劑治療。

1.2 方法

AML患者均給予誘導(dǎo)方案治療，依據(jù)患者病情程度及自身承受能力范圍進(jìn)行個性化選擇，并于骨髓抑制期進(jìn)行血常規(guī)監(jiān)測，輸注血制品，以及配合抗菌藥物使用。所有研究對象進(jìn)行外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測，空腹時抽取3 mL靜脈血，確保2 h前不服用任何藥物的情況下采血。將乙二胺四乙酸加入血液標(biāo)本，防止沉淀物析出。吸取100 μL血液置于流式檢測管，再向其加入20 μL 單克隆抗體，于黑箱內(nèi)37 ℃孵育15 min。取出流式檢測管，向其加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻后置于黑箱內(nèi)37 ℃孵育10 min，用3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速將血清分離10 min，得到血清放置于-20 ℃恒溫箱中保存，所有血液標(biāo)本狀態(tài)均無出現(xiàn)黃疸、溶血。除去上清液，加入PBS 液洗滌，沖洗3 次后，加入500 μL PBS 溶液混勻，放入流式分析儀檢測CD3+、CD4+及CD8+，計算CD4+與CD8+比值。

1.3 觀察指標(biāo)

比較初診AML 組和健康人群組外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平；以2018 年4 月—2021 年4 月內(nèi)是否復(fù)發(fā)為依據(jù)，將初診AML組分為對照組（未復(fù)發(fā)和完全痊愈病例）和復(fù)發(fā)組。其中對照組63 例，復(fù)發(fā)組37 例。統(tǒng)計并比較兩組患者平均年齡、病程、疾病遺傳史例數(shù)、以及治療前后外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平及差值；使用COX 回歸分析探究外周血T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)變化與AML 患者復(fù)發(fā)風(fēng)險之間的相關(guān)性。

1.4 療效及復(fù)發(fā)判定標(biāo)準(zhǔn)

（1）復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。指骨髓中原始細(xì)胞或病變細(xì)胞數(shù)量為總細(xì)胞數(shù)量的5%以上，和（或）發(fā)現(xiàn)病變范圍超過骨髓。（2）完全痊愈標(biāo)準(zhǔn)。Ⅰ：AML臨床癥狀消失；Ⅱ：骨髓中原始細(xì)胞或病變細(xì)胞數(shù)量低于5%；Ⅲ：奧式小體復(fù)查發(fā)現(xiàn)不存在；Ⅳ：脫離紅細(xì)胞輸注；Ⅴ：凝血功能正常，無白血病細(xì)胞；Ⅳ：髓外無病變細(xì)胞。（3）未復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。較上一次檢查而言，髓內(nèi)原始細(xì)胞比例下降50%以上。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 初診AML 組和健康人群組外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平情況

初診AML 組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均低于健康人群組，CD8+水平顯著高于健康人群組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 初診AML組和健康人群組外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平情況（±s）

表1 初診AML組和健康人群組外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平情況（±s）

組別初診AML組（n=100）健康人群組（n=20）t值P值CD3+（%）49.25±5.36 70.94±7.59 15.327 0.001 CD4+（%）28.64±6.35 42.12±5.48 8.850 0.001 CD8+（%）33.76±8.12 27.84±7.03 3.038 0.003 CD4+/CD8+（%0.87±0.21 1.68±0.61 10.622 0.001

2.2 影響復(fù)發(fā)的單因素分析結(jié)果

治療后，復(fù)發(fā)組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均高于對照組，CD8+水平均低于對照組，且治療前后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+差值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 影響復(fù)發(fā)的單因素分析結(jié)果

2.3 影響復(fù)發(fā)的COX多因素分析結(jié)果

治療前后CD3+差值、CD4+差值、CD8+差值及CD4+/CD8+差值是AML患者獨(dú)立復(fù)發(fā)的危險因素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 影響復(fù)發(fā)的COX多因素分析結(jié)果

3 討論

多名學(xué)者表示［6-7］，80%以上的AML 患者采取IA（去甲柔紅霉素+阿糖胞苷）治療緩解率高，為AML 的救治提供了更佳的選擇。但由于患者因復(fù)發(fā)使治療更為棘手，病死人數(shù)較多。研究指出，二次復(fù)發(fā)的AML患者體能狀態(tài)評分較低，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化療的療效并不顯著，但在早期及時干預(yù)未來可能復(fù)發(fā)的患者，在化療方案的基礎(chǔ)上增加分子靶向藥物，可明顯改善患者的CR率和生存率［8-9］。因此預(yù)測復(fù)發(fā)是高緩解率和長生存期的保障，制定預(yù)測復(fù)發(fā)模型可幫助指導(dǎo)醫(yī)師判斷病情，從而制定更規(guī)范的診療計劃。

T 淋巴細(xì)胞作為參與抗腫瘤免疫的關(guān)鍵物質(zhì)，其數(shù)量占比為外周血淋巴細(xì)胞的70%。CD3+可將上源受體的信號連續(xù)傳導(dǎo)，其數(shù)量和功能狀態(tài)代表了總T 淋巴細(xì)胞亞群水平。根據(jù)淋巴細(xì)胞的表型和功能的不同，人為將T 細(xì)胞分為CD4+和CD8+細(xì)胞。CD4+細(xì)胞在防控癌癥方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，其與組織相容性復(fù)合體結(jié)合后具有識別異類細(xì)胞的功能，啟動自身防御機(jī)制，分泌TNF 殺滅腫瘤，并促進(jìn)CD8+細(xì)胞的生殖，激活其狀態(tài)，啟動細(xì)胞毒T 細(xì)胞效應(yīng)，發(fā)揮特異性免疫機(jī)制。觀察CD4+細(xì)胞比例的變化不失為判定機(jī)體免疫狀態(tài)的一種方式，值得關(guān)注的是，部分CD4+細(xì)胞可分化為Treg 細(xì)胞，該類細(xì)胞可阻滯以上免疫機(jī)制，抑制T淋巴細(xì)胞的功能狀態(tài)。報道顯示，Treg 細(xì)胞可抑制淋巴細(xì)胞殺傷活力，與腫瘤免疫無能息息相關(guān)。另外，CD3+細(xì)胞是T 細(xì)胞亞群整體數(shù)量的反映，其水平的減少提示整體免疫功能將有所下降。CD8+細(xì)胞同樣具有調(diào)控腫瘤免疫機(jī)制的能力，可產(chǎn)生穿孔素，或是激活凋亡機(jī)制，影響腫瘤細(xì)胞的生命力。與此同時，CD8+細(xì)胞也可抑制CD4+細(xì)胞的激活、繁殖，因此各細(xì)胞可通過自身監(jiān)控來維持?jǐn)?shù)量和比例，保證免疫機(jī)制的各種功能正常運(yùn)行。CD4+/CD8+值的波動幅度直接影響抗腫瘤免疫的能力，二者細(xì)胞的比例失衡可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的種植，縮短患者的生存期。

研究表明，在血液腫瘤患者的血常規(guī)中，常出現(xiàn)T 淋巴細(xì)胞亞群水平的異常。各細(xì)胞數(shù)量發(fā)生改變，則會引起免疫功能的失調(diào)，導(dǎo)致白血病的發(fā)生率急速上升。此外，T 淋巴細(xì)胞分化抗原在白血病細(xì)胞的影響下，表達(dá)能力失調(diào)，導(dǎo)致病情惡化進(jìn)一步加重；IL-10 等免疫抑制分子也受白血病細(xì)胞的控制，活性大大增加，導(dǎo)致白血病的惡性生物學(xué)行為進(jìn)一步加快。研究結(jié)果表示，初診AML 組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均低于健康人群組，CD8+水平顯著高于健康人群組。提示AML 的惡變腫瘤細(xì)胞打破了T淋巴細(xì)胞亞群的平衡狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞成功“逃逸”，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機(jī)制喪失了對其生長的控制。

有報道指出［10］，化療雖存在降低外周白細(xì)胞的缺陷，如淋巴系統(tǒng)，但機(jī)體可做出一系列適應(yīng)性變化，如幫助啟動淋巴增值系統(tǒng)的自穩(wěn)定性功能，增高組織或器官內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量，使免疫功能得到穩(wěn)定?；煵粌H可殺滅癌細(xì)胞，還可抑制腫瘤細(xì)胞對免疫功能的破壞能力，使T 細(xì)胞亞群的狀態(tài)趨于穩(wěn)定，有利于生理功能的恢復(fù)。CD8+水平的上調(diào)提示細(xì)胞免疫活性將受到抑制，可通過CD4+/CD8+水平的變化得到有效的證實(shí)，CD4+/CD8+水平的升高提示免疫功能得到改善。本研究還探討了治療后各細(xì)胞數(shù)量和比例的變化，結(jié)果顯示治療后，復(fù)發(fā)組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均高于對照組，CD8+水平均低于對照組。這表示AML患者經(jīng)規(guī)范治療后免疫功能有所上調(diào)。如果當(dāng)CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均下降后，B 細(xì)胞將調(diào)控補(bǔ)體的生成機(jī)制，促進(jìn)補(bǔ)體的產(chǎn)生，損傷細(xì)胞的正常生理功能。究其原因ALM 患者在脊髓抑制期狀態(tài)后，免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸的能力亦下降。但若通過有效的治療，藥物將有效抑制細(xì)胞免疫進(jìn)一步損傷的可能，正如CD4+/CD8+水平升高即可得到提示。研究表明，當(dāng)CD4+/CD8+水平的提高意味著細(xì)胞免疫的正調(diào)節(jié)點(diǎn)占主導(dǎo)地位，這提示研究者經(jīng)治療后的AML患者抗腫瘤能力得到了顯著提高。

本文通過單因素分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組和對照組治療前后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+差值存在明顯差異，提示誘導(dǎo)治療方案可影響細(xì)胞免疫功能。研究表明，化療可對細(xì)胞免疫有顯著抑制功能。兩組患者治療前T 淋巴細(xì)胞亞群水平并無明顯差異，但治療后T 淋巴細(xì)胞亞群水平波動較大，說明治療后細(xì)胞免疫的變化與復(fù)發(fā)存在一定聯(lián)系。本文通過COX 多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，治療前后CD3+差值、CD4+差值、CD8+差值及CD4+/CD8+差值是AML患者獨(dú)立復(fù)發(fā)的危險因素，這表示免疫紊亂的AML患者與預(yù)后不佳存在直接聯(lián)系，證實(shí)治療前后T淋巴細(xì)胞亞群的差值是預(yù)測AML 危險度的模型，但未來還需更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證該結(jié)論。

綜上所述，針對AML 患者，追蹤T 淋巴細(xì)胞亞群水平的變化可幫助判斷預(yù)后，明確免疫狀態(tài)，應(yīng)用前景廣闊。未來還需再評價在T 淋巴細(xì)胞亞群水平在估計療效、判斷微小殘留病灶方面的價值，以制定更佳的治療方案，延長患者生存期。