楊 寧，王 瑤，武明爽，郝 玲，王 雷

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院松北腫瘤內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150028；

2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150000

結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是全球常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)2018 年全球新發(fā)結(jié)直腸癌180 多萬(wàn)例，死亡88.1萬(wàn)例［1］，世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌癥發(fā)病率位于第三位，死亡率位于第二位。我國(guó)所處的亞洲也是結(jié)直腸癌發(fā)病率較高的地區(qū)之一。雖然外科手術(shù)、化療、靶向治療等治療手段的運(yùn)用延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間，但結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及因此帶來(lái)的癌癥相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)仍然居高不下。

作為中華民族瑰寶的祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥，近年來(lái)越來(lái)越多的在臨床惡性腫瘤的治療中發(fā)揮出其天然優(yōu)勢(shì)。燈盞花素是從中藥半枝蓮、燈盞花等植物的莖葉中提取的活性單體成分，具有抗氧化、清除自由基、抗炎性反應(yīng)等特性。近年來(lái)隨著燈盞花素藥理作用相關(guān)研究的逐漸完善，其抗腫瘤特性漸漸顯露出來(lái)。多項(xiàng)研究相繼發(fā)現(xiàn)燈盞花素在乳腺癌［2］、淋巴瘤［3］、舌鱗狀細(xì)胞癌［4］、結(jié)直腸癌［5］和前列腺癌［6］等多種腫瘤中均具有抗腫瘤效應(yīng)，主要表現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤血管生成。但對(duì)于燈盞花素在結(jié)直腸癌中的確切作用機(jī)制尚無(wú)定論。本研究通過燈盞花素對(duì)結(jié)直腸癌作用及相關(guān)機(jī)制的研究，為結(jié)直腸癌尋找新的治療靶點(diǎn)和方向。

1 材料與方法

1.1 一般資料

HCT-116 結(jié)直腸癌細(xì)胞系（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。NCM460 正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）。燈盞花素購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要試劑與儀器

垂直電泳儀（美國(guó)BIO-RAD 公司），DYY-122型電泳儀（北京六一儀表廠），PCR 儀（美國(guó)Eppendorf 公司），紫外凝膠檢測(cè)成像系統(tǒng)（美國(guó)CapitalBio 公司）。AO/EB 試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司），MTT（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司），Hoechst 33342試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）。

1.3 主要方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代 HCT-116 結(jié)直腸癌細(xì)胞及NCM460 正常結(jié)腸上皮細(xì)胞在含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素及50 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)開始進(jìn)行傳代，加入0.25%的胰蛋白酶消化液2 mL，常溫消化3 min，當(dāng)大部分貼壁細(xì)胞消化釋放變圓時(shí)終止消化，用吸管反復(fù)吹打形成細(xì)胞懸液，分瓶培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)HCT-116細(xì)胞增殖能力 設(shè)置燈盞花素處理組和對(duì)照組，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到96 孔板（104個(gè)細(xì)胞/孔），燈盞花素處理組分別以a、b兩種給藥方式作用。a 方式：燈盞花素處理每孔分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 燈盞花素溶液100 uL，空白對(duì)照組加入等量DMSO，作用48 h，倒置顯微鏡觀察。b 方式：燈盞花素處理組每孔細(xì)胞分別加入濃度為30 μmol/L 燈盞花素溶液100 uL，空白對(duì)照組加入等量100 uL 的DMSO，分別作用24、48、72 h，倒置顯微鏡觀察。其后每孔加入新鮮配制的MTT 溶液（濃度為5 mg/mL）20 uL，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞離心后每孔分別加入DMSO 100 uL，低速振蕩使藍(lán)色結(jié)晶物充分融解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔在540 nm 處吸光值，記錄結(jié)果。分別以藥物濃度和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。以上實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次。

1.3.3 Hoechst 33342 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 參照Invitrogen 公司Hoechst 33342 染色試劑盒說明書操作。將密度為106個(gè)細(xì)胞/mL 的HCT-116 細(xì)胞接種到96 孔板，共分4 組（3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1 個(gè)對(duì)照組），每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，各實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液100 uL，空白組加入等量DMSO，置入37 ℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱，孵育48 h。小心吸去孔內(nèi)上清液，PBS 清洗1 次，室溫下4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗一次，加入濃度為20 μg/mL 的Hoechst 33342 工作液100 uL，室溫15 min，吸出熒光染料，倒置熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)并拍照。在熒光顯微鏡下觀察分析：活細(xì)胞，細(xì)胞核呈均勻一致的藍(lán)色；凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，且伴有核固縮。以上實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次。

1.3.4 AO/EB雙染色法細(xì)胞凋亡檢測(cè) 參照Invitrogen公司AO/EB 雙染色試劑盒說明書操作。將密度為106/mL 的HCT-116 細(xì)胞，接種至96 孔板，每孔體積100 uL，共分4組（3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1 個(gè)對(duì)照組），每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液100 μL，空白組加入等量DMSO，孵育48 h。隨后各加10 μL AO/EB 工作液，室溫下作用5 min，取上述染色液一滴，滴在潔凈的載玻片上，加上蓋玻片后立即在倒置熒光顯微鏡下觀察鏡下細(xì)胞變化和凋亡小體。AO 能透過胞膜完整的細(xì)胞，嵌入胞核DNA，使之發(fā)出綠色熒光。EB 僅能透過胞膜受損的細(xì)胞，嵌入胞核DNA，發(fā)橘紅色熒光。在熒光顯微鏡下觀察分析：活細(xì)胞，核染色質(zhì)呈綠色；凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)呈橘紅色，固縮狀或圓珠狀。以上實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次。

1.3.5 TUNEL 染色法細(xì)胞凋亡檢測(cè) 參照Roche 公司TUNEL染色試劑盒說明書操作。HCT-116細(xì)胞爬片，貼壁后分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液，空白組加入等量DMSO，作用4 h，PBS 清洗3 次，室溫下4%多聚甲醛固定1 h，于冰上用0.1% TritonX-100 溶于0.1%檸檬酸鈉溶液通透2 min，PBS清洗2次，各孔分別加入50 μL TUNEL 反應(yīng)混合溶液，在37℃濕盒中避光孵育1 h，PBS 清洗3 次，隨后加入轉(zhuǎn)化劑-POD 50 μL，于37 ℃濕盒中繼續(xù)孵育30 min，PBS 清洗3 次，載玻片上滴加100 μL DAB 底物溶液，室溫孵育5～10 min，隨時(shí)進(jìn)行鏡下觀察，待染色后立刻用蒸餾水終止反應(yīng)，蒸餾水沖洗2 次，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗2 min，80%～100%梯度乙醇脫水，各3 min，二甲苯透明，各5 min，封片。熒光顯微鏡下觀察分析：活細(xì)胞核呈藍(lán)色；凋亡細(xì)胞核呈棕褐色，固縮狀或圓珠狀。以上實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)PDK1 蛋白表達(dá) 濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液處理后的HCT-116細(xì)胞、空白對(duì)照組HCT-116 細(xì)胞及NCM460 正常結(jié)腸上皮細(xì)胞，分別在37 ℃、5% CO2、95%空氣、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱，孵育48 h，收集各組細(xì)胞。經(jīng)預(yù)冷的PBS 漂洗3次，每孔加入100 μL 富含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA 裂解液，5 min 后在4℃條件下14 000 r/min 離心10 min，取上清，使用Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。經(jīng)SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜以及含有5%脫脂奶粉的磷酸緩沖液室溫封閉1 h，加入5%脫脂奶粉稀釋的兔抗PDK1 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG 羊抗兔二抗，室溫孵育2 h。放入顯像液中1 min顯像，暗室曝光。隨后采用LI-COR DNA 分析系統(tǒng)和Odyssey v1.2 軟件定量分析條帶的灰度，以灰度值作為參照，計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對(duì)HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

分別以10、30、100 μmol/L 不同濃度的燈盞花素溶液作用于HCT-116 細(xì)胞，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔在540 nm 處吸光值，記錄結(jié)果。分別以藥物濃度和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：10 μmol/L 濃度組、30 μmol/L 濃度組以及100 μmol/L 濃度組與空白對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組均能夠抑制HCT-116 細(xì)胞增殖，且對(duì)HCT-116 細(xì)胞增殖的抑制程度與作用藥物的濃度具有相關(guān)性，隨著藥物濃度逐漸增加，存活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A。不同濃度的燈盞花素通過劑量—依賴方式抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖1 燈盞花素對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖的影響

以濃度為30 μmol/L 的燈盞花素溶液分別作用于HCT-116 細(xì)胞不同時(shí)間（24 h、48 h、72 h），結(jié)果顯示：24 h組、48 h 組、72 h 組與空白對(duì)照組相比，隨著藥物作用時(shí)間的逐漸增加，存活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。相同濃度的燈盞花素通過時(shí)間—依賴方式抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.2 Hoechst 33342染色法檢測(cè)HCT-116細(xì)胞凋亡作用

采用Hoechst 33342 染色法評(píng)價(jià)不同濃度的燈盞花素對(duì)HCT-116 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。分別用10、30 以及100 μmol/L 不同濃度的燈盞花素溶液作用于HCT-116細(xì)胞相同時(shí)間，結(jié)果顯示：燈盞花素作用后10 μmol/L 濃度組、30 μmol/L 濃度組、100 μmol/L 濃度組細(xì)胞分別出現(xiàn)呈亮藍(lán)色細(xì)胞核的陽(yáng)性細(xì)胞，且伴有染色質(zhì)凝聚、核固縮等形態(tài)改變。并隨給藥濃度增大，陽(yáng)性細(xì)胞增多，凋亡率增加?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞核為均勻一致的藍(lán)色，未出現(xiàn)上述異常表現(xiàn)的陽(yáng)性細(xì)胞，見圖2A。

圖2 燈盞花素誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡

2.3 AO/EB雙染色法檢測(cè)HCT-116細(xì)胞凋亡作用

采用AO/EB 雙染色評(píng)價(jià)不同濃度燈盞花素對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。分別用10、30、100 μmol/L 不同濃度的燈盞花素溶液作用于HCT-116 細(xì)胞相同時(shí)間，結(jié)果顯示：燈盞花素作用后10 μmol/L 濃度組、30 μmol/L 濃度組、100 μmol/L 濃度組細(xì)胞分別出現(xiàn)呈橘紅色細(xì)胞核的陽(yáng)性細(xì)胞，且伴有染色質(zhì)凝聚、核固縮等形態(tài)改變。并隨藥物濃度增大，陽(yáng)性細(xì)胞增多，凋亡率增加?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞核為均勻一致的綠色，未出現(xiàn)上述異常表現(xiàn)的陽(yáng)性細(xì)胞，見圖2B。

2.4 TUNEL染色法檢測(cè)HCT-116細(xì)胞凋亡作用

采用TUNEL 染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，鏡下顯示為細(xì)胞核呈棕色。非凋亡細(xì)胞為陰性細(xì)胞，鏡下顯示為細(xì)胞核呈藍(lán)色。結(jié)果顯示：不同濃度的燈盞花素作用后的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞核呈棕色的陽(yáng)性細(xì)胞，且伴有染色質(zhì)凝聚、核固縮等形態(tài)改變。隨藥物濃度增大，陽(yáng)性細(xì)胞增多，凋亡率增加?？瞻讓?duì)照組幾乎無(wú)TUNEL檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞，見圖2C。

2.5 PDK1在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)

通過Western blot 檢測(cè)結(jié)直腸癌HCT-116 細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮NCM460 細(xì)胞中丙酮酸脫氫酶激酶1（PDK1）蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：HCT-116 細(xì)胞中PDK1 蛋白表達(dá)相較于對(duì)照細(xì)胞顯著升高，見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)PDK1蛋白表達(dá)

2.6 燈盞花素抑制PDK1表達(dá)

不同濃度10、30、100 μmol/L 的燈盞花素作用于HCT-116 細(xì)胞48 h 后，通過Western blot 法檢測(cè)作用前后細(xì)胞內(nèi)PDK1 表達(dá)的情況。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PDK1 蛋白表達(dá)量均減少，且蛋白表達(dá)量隨藥物濃度增加而下降；其中30 μmol/L 藥物作用實(shí)驗(yàn)組和100 μmol/L 藥物作用實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異（*P＜0.05 vs 對(duì)照組），10 μmol/L 藥物作用實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比沒有顯著性差異，見圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)燈盞花素作用后的HCT-116細(xì)胞PDK1蛋白表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌是人類第三大常見的惡性腫瘤，每年全世界有近14 900 例確診患者［7-8］。近年來(lái)，結(jié)腸癌患病率具有逐年增加的趨勢(shì)。當(dāng)前，結(jié)腸癌的治療是以手術(shù)結(jié)合術(shù)后輔助化療為主的綜合性治療［9］。但是，由于結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)大多數(shù)化療藥物存在耐藥情況，所有這些治療方法很難控制腫瘤不出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移等疾病進(jìn)展［10］。因此亟待對(duì)治療結(jié)腸癌新的有效抗腫瘤藥物進(jìn)行開發(fā)和研究。

燈盞花素是一種從中草藥半枝蓮中提取出的主要活性化合物，并已經(jīng)應(yīng)用了上百年［11-12］。有報(bào)道顯示，燈盞花素具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、抗炎、抗細(xì)菌等作用，因此被臨床用來(lái)治療冠狀動(dòng)脈疾病、腦血栓形成、腦梗死和高血壓病等［13-14］。近年來(lái)，有報(bào)道顯示，燈盞花素能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌、惡性淋巴瘤和舌癌細(xì)胞凋亡，并有一定應(yīng)用于臨床的潛在可能［14］。例如，燈盞花素能夠通過線粒體通路途徑抑制白血病U937 細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡［15］。燈盞花素能夠通過增強(qiáng)Caspase-6 活化從而有效的致敏藥物誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡［14］。體內(nèi)研究也同樣證明了燈盞花素在舌癌中能夠通過降低MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)，顯著減緩腫瘤生長(zhǎng)，抑制腫瘤新生血管生成，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡［16-17］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，燈盞花素能夠以時(shí)間—依賴和計(jì)量—依賴兩種方式顯著性抑制結(jié)腸癌HCT-116 細(xì)胞增殖，同時(shí)具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙重作用。且這種抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用甚至在較低濃度（10 μmol/L）時(shí)仍然存在。然而其確切的作用機(jī)制尚不清楚。

PDK1 由63kDa 的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）組成，作為AGC激酶家族的一員，是一種重要的蛋白激酶，同時(shí)也是AKT 上游的激活劑。PDK1 的結(jié)構(gòu)主要包括兩部分：N末端的激酶結(jié)構(gòu)域及C 末端的血小板—白細(xì)胞C 激酶底物同源性結(jié)構(gòu)域（PH domain），通過其在細(xì)胞外的受體激活傳導(dǎo)如細(xì)胞內(nèi)部并進(jìn)行接下來(lái)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［18-19］。其下游PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系，通路中多種生長(zhǎng)因子與受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK） 相結(jié)合后進(jìn)一步激活PI3K，使二磷酸肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)化為三磷酸肌醇（PIP3）。PIP3 與AKT 和PDK1 的PH 域結(jié)合，隨后PDKl 可通過激活A(yù)KT 蛋白的第308 位點(diǎn)的蘇氨酸發(fā)生磷酸化從而活化［20-21］。活化后的AKT 可進(jìn)一步激活下游的一系列底物，如mTOR/p70-S6K、Bad和Bax等，進(jìn)而影響并調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、糖代謝以及細(xì)胞遷移和凋亡等多種生物學(xué)進(jìn)程［22-24］。PDK1 是一種強(qiáng)效蛋白激酶，通常與癌癥中的信號(hào)級(jí)聯(lián)改變有關(guān)，如PI3K/Akt 信號(hào)和Ras/MAPK 信號(hào)［22-24］。PDK1的高表達(dá)或過度激活能夠?qū)е翽I3K/AKT 信號(hào)通路的激活，或AKT 非依賴性mTOR 信號(hào)通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)癌癥進(jìn)展［22-24］。

本研究結(jié)果證實(shí)了HCT-116 細(xì)胞中PDK1 呈高表達(dá)，而燈盞花素確作用后能夠使PDK1 的表達(dá)量顯著下降。綜上所述，燈盞花素是通過抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中PDK1 的表達(dá)發(fā)揮抑制HCT-116細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，為結(jié)直腸癌體外基礎(chǔ)研究提供了新的方向。