楊 寧,王 瑤,武明爽,郝 玲,王 雷
1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院松北腫瘤內(nèi)科,黑龍江 哈爾濱 150028;
2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,黑龍江 哈爾濱 150000
結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤,據(jù)統(tǒng)計(jì)2018 年全球新發(fā)結(jié)直腸癌180 多萬(wàn)例,死亡88.1萬(wàn)例[1],世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌癥發(fā)病率位于第三位,死亡率位于第二位。我國(guó)所處的亞洲也是結(jié)直腸癌發(fā)病率較高的地區(qū)之一。雖然外科手術(shù)、化療、靶向治療等治療手段的運(yùn)用延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間,但結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及因此帶來(lái)的癌癥相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)仍然居高不下。
作為中華民族瑰寶的祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥,近年來(lái)越來(lái)越多的在臨床惡性腫瘤的治療中發(fā)揮出其天然優(yōu)勢(shì)。燈盞花素是從中藥半枝蓮、燈盞花等植物的莖葉中提取的活性單體成分,具有抗氧化、清除自由基、抗炎性反應(yīng)等特性。近年來(lái)隨著燈盞花素藥理作用相關(guān)研究的逐漸完善,其抗腫瘤特性漸漸顯露出來(lái)。多項(xiàng)研究相繼發(fā)現(xiàn)燈盞花素在乳腺癌[2]、淋巴瘤[3]、舌鱗狀細(xì)胞癌[4]、結(jié)直腸癌[5]和前列腺癌[6]等多種腫瘤中均具有抗腫瘤效應(yīng),主要表現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤血管生成。但對(duì)于燈盞花素在結(jié)直腸癌中的確切作用機(jī)制尚無(wú)定論。本研究通過(guò)燈盞花素對(duì)結(jié)直腸癌作用及相關(guān)機(jī)制的研究,為結(jié)直腸癌尋找新的治療靶點(diǎn)和方向。
HCT-116 結(jié)直腸癌細(xì)胞系(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。NCM460 正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。燈盞花素購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。
垂直電泳儀(美國(guó)BIO-RAD 公司),DYY-122型電泳儀(北京六一儀表廠),PCR 儀(美國(guó)Eppendorf 公司),紫外凝膠檢測(cè)成像系統(tǒng)(美國(guó)CapitalBio 公司)。AO/EB 試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司),MTT(美國(guó)Sigma-Aldrich 公司),Hoechst 33342試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)。
1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代 HCT-116 結(jié)直腸癌細(xì)胞及NCM460 正常結(jié)腸上皮細(xì)胞在含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素及50 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中,每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%融合時(shí)開(kāi)始進(jìn)行傳代,加入0.25%的胰蛋白酶消化液2 mL,常溫消化3 min,當(dāng)大部分貼壁細(xì)胞消化釋放變圓時(shí)終止消化,用吸管反復(fù)吹打形成細(xì)胞懸液,分瓶培養(yǎng)。
1.3.2 MTT法檢測(cè)HCT-116細(xì)胞增殖能力 設(shè)置燈盞花素處理組和對(duì)照組,選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到96 孔板(104個(gè)細(xì)胞/孔),燈盞花素處理組分別以a、b兩種給藥方式作用。a 方式:燈盞花素處理每孔分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 燈盞花素溶液100 uL,空白對(duì)照組加入等量DMSO,作用48 h,倒置顯微鏡觀察。b 方式:燈盞花素處理組每孔細(xì)胞分別加入濃度為30 μmol/L 燈盞花素溶液100 uL,空白對(duì)照組加入等量100 uL 的DMSO,分別作用24、48、72 h,倒置顯微鏡觀察。其后每孔加入新鮮配制的MTT 溶液(濃度為5 mg/mL)20 uL,于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),懸浮細(xì)胞離心后每孔分別加入DMSO 100 uL,低速振蕩使藍(lán)色結(jié)晶物充分融解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔在540 nm 處吸光值,記錄結(jié)果。分別以藥物濃度和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo),OD 值為縱坐標(biāo),繪制曲線。以上實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次。
1.3.3 Hoechst 33342 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 參照Invitrogen 公司Hoechst 33342 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。將密度為106個(gè)細(xì)胞/mL 的HCT-116 細(xì)胞接種到96 孔板,共分4 組(3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組,1 個(gè)對(duì)照組),每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔,各實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液100 uL,空白組加入等量DMSO,置入37 ℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱,孵育48 h。小心吸去孔內(nèi)上清液,PBS 清洗1 次,室溫下4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗一次,加入濃度為20 μg/mL 的Hoechst 33342 工作液100 uL,室溫15 min,吸出熒光染料,倒置熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)并拍照。在熒光顯微鏡下觀察分析:活細(xì)胞,細(xì)胞核呈均勻一致的藍(lán)色;凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核呈亮藍(lán)色,且伴有核固縮。以上實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次。
1.3.4 AO/EB雙染色法細(xì)胞凋亡檢測(cè) 參照Invitrogen公司AO/EB 雙染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。將密度為106/mL 的HCT-116 細(xì)胞,接種至96 孔板,每孔體積100 uL,共分4組(3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組,1 個(gè)對(duì)照組),每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液100 μL,空白組加入等量DMSO,孵育48 h。隨后各加10 μL AO/EB 工作液,室溫下作用5 min,取上述染色液一滴,滴在潔凈的載玻片上,加上蓋玻片后立即在倒置熒光顯微鏡下觀察鏡下細(xì)胞變化和凋亡小體。AO 能透過(guò)胞膜完整的細(xì)胞,嵌入胞核DNA,使之發(fā)出綠色熒光。EB 僅能透過(guò)胞膜受損的細(xì)胞,嵌入胞核DNA,發(fā)橘紅色熒光。在熒光顯微鏡下觀察分析:活細(xì)胞,核染色質(zhì)呈綠色;凋亡細(xì)胞,核染色質(zhì)呈橘紅色,固縮狀或圓珠狀。以上實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次。
1.3.5 TUNEL 染色法細(xì)胞凋亡檢測(cè) 參照Roche 公司TUNEL染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。HCT-116細(xì)胞爬片,貼壁后分別加入濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液,空白組加入等量DMSO,作用4 h,PBS 清洗3 次,室溫下4%多聚甲醛固定1 h,于冰上用0.1% TritonX-100 溶于0.1%檸檬酸鈉溶液通透2 min,PBS清洗2次,各孔分別加入50 μL TUNEL 反應(yīng)混合溶液,在37℃濕盒中避光孵育1 h,PBS 清洗3 次,隨后加入轉(zhuǎn)化劑-POD 50 μL,于37 ℃濕盒中繼續(xù)孵育30 min,PBS 清洗3 次,載玻片上滴加100 μL DAB 底物溶液,室溫孵育5~10 min,隨時(shí)進(jìn)行鏡下觀察,待染色后立刻用蒸餾水終止反應(yīng),蒸餾水沖洗2 次,蘇木素復(fù)染,自來(lái)水沖洗2 min,80%~100%梯度乙醇脫水,各3 min,二甲苯透明,各5 min,封片。熒光顯微鏡下觀察分析:活細(xì)胞核呈藍(lán)色;凋亡細(xì)胞核呈棕褐色,固縮狀或圓珠狀。以上實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次。
1.3.6 Western blot 檢測(cè)PDK1 蛋白表達(dá) 濃度為10、30、100 μmol/L 的燈盞花素溶液處理后的HCT-116細(xì)胞、空白對(duì)照組HCT-116 細(xì)胞及NCM460 正常結(jié)腸上皮細(xì)胞,分別在37 ℃、5% CO2、95%空氣、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱,孵育48 h,收集各組細(xì)胞。經(jīng)預(yù)冷的PBS 漂洗3次,每孔加入100 μL 富含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA 裂解液,5 min 后在4℃條件下14 000 r/min 離心10 min,取上清,使用Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。經(jīng)SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜以及含有5%脫脂奶粉的磷酸緩沖液室溫封閉1 h,加入5%脫脂奶粉稀釋的兔抗PDK1 單克隆抗體,4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG 羊抗兔二抗,室溫孵育2 h。放入顯像液中1 min顯像,暗室曝光。隨后采用LI-COR DNA 分析系統(tǒng)和Odyssey v1.2 軟件定量分析條帶的灰度,以灰度值作為參照,計(jì)算蛋白表達(dá)量。
采用SPSS 17.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
分別以10、30、100 μmol/L 不同濃度的燈盞花素溶液作用于HCT-116 細(xì)胞,在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔在540 nm 處吸光值,記錄結(jié)果。分別以藥物濃度和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo),OD 值為縱坐標(biāo),繪制曲線。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:10 μmol/L 濃度組、30 μmol/L 濃度組以及100 μmol/L 濃度組與空白對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組均能夠抑制HCT-116 細(xì)胞增殖,且對(duì)HCT-116 細(xì)胞增殖的抑制程度與作用藥物的濃度具有相關(guān)性,隨著藥物濃度逐漸增加,存活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1A。不同濃度的燈盞花素通過(guò)劑量—依賴方式抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖1 燈盞花素對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖的影響
以濃度為30 μmol/L 的燈盞花素溶液分別作用于HCT-116 細(xì)胞不同時(shí)間(24 h、48 h、72 h),結(jié)果顯示:24 h組、48 h 組、72 h 組與空白對(duì)照組相比,隨著藥物作用時(shí)間的逐漸增加,存活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1B。相同濃度的燈盞花素通過(guò)時(shí)間—依賴方式抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)。
采用Hoechst 33342 染色法評(píng)價(jià)不同濃度的燈盞花素對(duì)HCT-116 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。分別用10、30 以及100 μmol/L 不同濃度的燈盞花素溶液作用于HCT-116細(xì)胞相同時(shí)間,結(jié)果顯示:燈盞花素作用后10 μmol/L 濃度組、30 μmol/L 濃度組、100 μmol/L 濃度組細(xì)胞分別出現(xiàn)呈亮藍(lán)色細(xì)胞核的陽(yáng)性細(xì)胞,且伴有染色質(zhì)凝聚、核固縮等形態(tài)改變。并隨給藥濃度增大,陽(yáng)性細(xì)胞增多,凋亡率增加??瞻讓?duì)照組細(xì)胞核為均勻一致的藍(lán)色,未出現(xiàn)上述異常表現(xiàn)的陽(yáng)性細(xì)胞,見(jiàn)圖2A。
圖2 燈盞花素誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡
采用AO/EB 雙染色評(píng)價(jià)不同濃度燈盞花素對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。分別用10、30、100 μmol/L 不同濃度的燈盞花素溶液作用于HCT-116 細(xì)胞相同時(shí)間,結(jié)果顯示:燈盞花素作用后10 μmol/L 濃度組、30 μmol/L 濃度組、100 μmol/L 濃度組細(xì)胞分別出現(xiàn)呈橘紅色細(xì)胞核的陽(yáng)性細(xì)胞,且伴有染色質(zhì)凝聚、核固縮等形態(tài)改變。并隨藥物濃度增大,陽(yáng)性細(xì)胞增多,凋亡率增加。空白對(duì)照組細(xì)胞核為均勻一致的綠色,未出現(xiàn)上述異常表現(xiàn)的陽(yáng)性細(xì)胞,見(jiàn)圖2B。
采用TUNEL 染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,凋亡細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞,鏡下顯示為細(xì)胞核呈棕色。非凋亡細(xì)胞為陰性細(xì)胞,鏡下顯示為細(xì)胞核呈藍(lán)色。結(jié)果顯示:不同濃度的燈盞花素作用后的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞核呈棕色的陽(yáng)性細(xì)胞,且伴有染色質(zhì)凝聚、核固縮等形態(tài)改變。隨藥物濃度增大,陽(yáng)性細(xì)胞增多,凋亡率增加??瞻讓?duì)照組幾乎無(wú)TUNEL檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞,見(jiàn)圖2C。
通過(guò)Western blot 檢測(cè)結(jié)直腸癌HCT-116 細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮NCM460 細(xì)胞中丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示:HCT-116 細(xì)胞中PDK1 蛋白表達(dá)相較于對(duì)照細(xì)胞顯著升高,見(jiàn)圖3。
圖3 Western blot檢測(cè)PDK1蛋白表達(dá)
不同濃度10、30、100 μmol/L 的燈盞花素作用于HCT-116 細(xì)胞48 h 后,通過(guò)Western blot 法檢測(cè)作用前后細(xì)胞內(nèi)PDK1 表達(dá)的情況。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PDK1 蛋白表達(dá)量均減少,且蛋白表達(dá)量隨藥物濃度增加而下降;其中30 μmol/L 藥物作用實(shí)驗(yàn)組和100 μmol/L 藥物作用實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異(*P<0.05 vs 對(duì)照組),10 μmol/L 藥物作用實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異,見(jiàn)圖4。
圖4 Western blot檢測(cè)燈盞花素作用后的HCT-116細(xì)胞PDK1蛋白表達(dá)
結(jié)腸癌是人類第三大常見(jiàn)的惡性腫瘤,每年全世界有近14 900 例確診患者[7-8]。近年來(lái),結(jié)腸癌患病率具有逐年增加的趨勢(shì)。當(dāng)前,結(jié)腸癌的治療是以手術(shù)結(jié)合術(shù)后輔助化療為主的綜合性治療[9]。但是,由于結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)大多數(shù)化療藥物存在耐藥情況,所有這些治療方法很難控制腫瘤不出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移等疾病進(jìn)展[10]。因此亟待對(duì)治療結(jié)腸癌新的有效抗腫瘤藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)和研究。
燈盞花素是一種從中草藥半枝蓮中提取出的主要活性化合物,并已經(jīng)應(yīng)用了上百年[11-12]。有報(bào)道顯示,燈盞花素具有多種生物學(xué)活性,如抗氧化、抗炎、抗細(xì)菌等作用,因此被臨床用來(lái)治療冠狀動(dòng)脈疾病、腦血栓形成、腦梗死和高血壓病等[13-14]。近年來(lái),有報(bào)道顯示,燈盞花素能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌、惡性淋巴瘤和舌癌細(xì)胞凋亡,并有一定應(yīng)用于臨床的潛在可能[14]。例如,燈盞花素能夠通過(guò)線粒體通路途徑抑制白血病U937 細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡[15]。燈盞花素能夠通過(guò)增強(qiáng)Caspase-6 活化從而有效的致敏藥物誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[14]。體內(nèi)研究也同樣證明了燈盞花素在舌癌中能夠通過(guò)降低MMP-2 和MMP-9 的表達(dá),顯著減緩腫瘤生長(zhǎng),抑制腫瘤新生血管生成,并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[16-17]。
本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),燈盞花素能夠以時(shí)間—依賴和計(jì)量—依賴兩種方式顯著性抑制結(jié)腸癌HCT-116 細(xì)胞增殖,同時(shí)具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙重作用。且這種抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用甚至在較低濃度(10 μmol/L)時(shí)仍然存在。然而其確切的作用機(jī)制尚不清楚。
PDK1 由63kDa 的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)組成,作為AGC激酶家族的一員,是一種重要的蛋白激酶,同時(shí)也是AKT 上游的激活劑。PDK1 的結(jié)構(gòu)主要包括兩部分:N末端的激酶結(jié)構(gòu)域及C 末端的血小板—白細(xì)胞C 激酶底物同源性結(jié)構(gòu)域(PH domain),通過(guò)其在細(xì)胞外的受體激活傳導(dǎo)如細(xì)胞內(nèi)部并進(jìn)行接下來(lái)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[18-19]。其下游PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系,通路中多種生長(zhǎng)因子與受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK) 相結(jié)合后進(jìn)一步激活PI3K,使二磷酸肌醇(PIP2)轉(zhuǎn)化為三磷酸肌醇(PIP3)。PIP3 與AKT 和PDK1 的PH 域結(jié)合,隨后PDKl 可通過(guò)激活A(yù)KT 蛋白的第308 位點(diǎn)的蘇氨酸發(fā)生磷酸化從而活化[20-21]。活化后的AKT 可進(jìn)一步激活下游的一系列底物,如mTOR/p70-S6K、Bad和Bax等,進(jìn)而影響并調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、糖代謝以及細(xì)胞遷移和凋亡等多種生物學(xué)進(jìn)程[22-24]。PDK1 是一種強(qiáng)效蛋白激酶,通常與癌癥中的信號(hào)級(jí)聯(lián)改變有關(guān),如PI3K/Akt 信號(hào)和Ras/MAPK 信號(hào)[22-24]。PDK1的高表達(dá)或過(guò)度激活能夠?qū)е翽I3K/AKT 信號(hào)通路的激活,或AKT 非依賴性mTOR 信號(hào)通路的激活,進(jìn)而促進(jìn)癌癥進(jìn)展[22-24]。
本研究結(jié)果證實(shí)了HCT-116 細(xì)胞中PDK1 呈高表達(dá),而燈盞花素確作用后能夠使PDK1 的表達(dá)量顯著下降。綜上所述,燈盞花素是通過(guò)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中PDK1 的表達(dá)發(fā)揮抑制HCT-116細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用,為結(jié)直腸癌體外基礎(chǔ)研究提供了新的方向。