周海東 羅昌泰 稂宇嘉 韋積華 周俊秀 玉藍(lán)青

1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，廣西百色 533000；3.廣西百色市婦幼保健院，廣西百色 533000

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種血糖調(diào)節(jié)功能紊亂為特征的疾病。根據(jù)病因的不同，可分為1 型DM、2 型DM 以及妊娠糖尿病等類型[1]。研究顯示，我國(guó)兒童DM 發(fā)病率逐漸上升，成為全世界兒童發(fā)病率上升最快的國(guó)家之一[2]。此外，機(jī)體高血糖會(huì)導(dǎo)致各種急、慢性并發(fā)癥的發(fā)生，如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病高滲性昏迷、糖尿病腎病、糖尿病足等，降低患者的生活質(zhì)量，給社會(huì)和個(gè)人帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。然而，臨床上尚無(wú)有效手段根治DM，其治療以控制血糖為主，胰島素及降糖藥物均有副作用，如低血糖、胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損害等，嚴(yán)重者危及生命。因此，DM 的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及治療機(jī)制研究成為當(dāng)今熱點(diǎn)。四氧嘧啶可致胰島β 細(xì)胞發(fā)生不可逆性損傷，最常用于構(gòu)建DM 模型；其毒性較強(qiáng)，可致肝腎發(fā)生急性損傷而危及生命。查閱“知網(wǎng)”“維普”“Pubmed”等國(guó)內(nèi)外檢索網(wǎng)站，未見(jiàn)四氧嘧啶安全使用劑量及誘導(dǎo)模型成功率的報(bào)道，或給出“異常低的死亡率”“無(wú)顯著死亡率”等模糊的報(bào)告[4]。因此，合適的誘導(dǎo)劑量提高DM動(dòng)物成模率迫在眉睫且順應(yīng)當(dāng)今科學(xué)技術(shù)發(fā)展。

1 四氧嘧啶致DM機(jī)制

四氧嘧啶于1838 年被合成，于1943 年首次被發(fā)現(xiàn)具有致DM 的作用[5]；此后，很多學(xué)者對(duì)其化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：①四氧嘧啶是一種親水不穩(wěn)定的嘧啶衍生物，其親水性是誘導(dǎo)DM 發(fā)生的重要生理特性。②四氧嘧啶與葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合胰島β 細(xì)胞上載體蛋白，減少胰島素分泌。③四氧嘧啶可使胰腺細(xì)胞核酸自發(fā)斷裂，導(dǎo)致不可逆損傷。

1.1 氧化還原反應(yīng)

四氧嘧啶極不穩(wěn)定，入血后立即氧化成“化合物305”，同時(shí)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）破壞磷脂雙分子結(jié)構(gòu)；胞內(nèi)存在-SH 基團(tuán)的還原劑[如還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、半胱氨酸（cysteine，CySH）及可與蛋白質(zhì)相結(jié)合的巰基（包含-SH 的蛋白質(zhì)）]時(shí)，四氧嘧啶被還原成徑尿酸，產(chǎn)生大量的超氧自由基，加速細(xì)胞損傷。此外，當(dāng)體內(nèi)存在氧化劑（O2、H2O2等）時(shí)，徑尿酸又被氧化成四氧嘧啶，產(chǎn)生ROS[6]，見(jiàn)圖1。

圖1 四氧嘧啶在胞內(nèi)發(fā)生氧化還原反應(yīng)

1.2 誘發(fā)低血糖機(jī)制

胰島β細(xì)胞胞膜鑲嵌著兩種重要信號(hào)蛋白——依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（glucose transporter-2，GLUT-2）、葡萄糖激酶（glucokinase，GK）。胰島素分泌依賴于GK，GK 由體內(nèi)的葡萄糖激活；四氧嘧啶與葡萄糖具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但前者對(duì)-SH 基團(tuán)的親和力遠(yuǎn)高于后者。胞膜的GK 與四氧嘧啶的結(jié)合更快速、緊密，且不會(huì)產(chǎn)生與葡萄糖結(jié)合時(shí)的生理作用（促進(jìn)胰島素分泌），從而使胰島素分泌受限。意味著四氧嘧啶可作用于上述靶點(diǎn)，中斷胰島素分泌信號(hào)，導(dǎo)致血糖升高[7-8]。

此外，四氧嘧啶誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+釋放，使細(xì)胞處于持續(xù)去極化狀態(tài)，電壓依賴性鈣通道長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)放，大量Ca2+涌入，致使胞內(nèi)DNA 發(fā)生斷裂，這或許是胰島β 細(xì)胞無(wú)法再生的機(jī)制[9]，見(jiàn)圖2。

圖2 四氧嘧啶誘發(fā)低血糖機(jī)制

2 不同劑量下各臟器損傷分析

構(gòu)建DM 模型因劑量及注射方式不同有所差異：①腹腔注射（intraperitoneal injection，ip），150～180 mg/kg 范圍內(nèi)有小鼠成功造模報(bào)道；75～250 mg/kg 范圍內(nèi)有大鼠成功造模報(bào)道；兔未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。②靜脈注射（intravenous injection，iv），50～75 mg/kg 范圍有小鼠成功造模報(bào)道；35～120 mg/kg 范圍有大鼠成功造模報(bào)道；60～200 mg/kg 范圍有兔成功造模報(bào)道。此外，報(bào)道指出四氧嘧啶有多系統(tǒng)、多臟器損害風(fēng)險(xiǎn)，且與注射方式及劑量存在一定關(guān)聯(lián)，主要表現(xiàn)為：①血糖水平增加，體重下降；②胰腺細(xì)胞破壞明顯，周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝、腎組織炎癥損傷明顯；③心臟重構(gòu)；④大動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、損傷，中、小動(dòng)脈硬化；⑤血液中炎癥因子、細(xì)胞毒性因子等水平升高；⑥牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)損傷。見(jiàn)表1。

表1 四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型的注射劑量（mg/kg）

上述條件均有報(bào)道成功構(gòu)建DM 模型，但既往的研究中多數(shù)學(xué)者未報(bào)道成模率，而是“異常低的死亡率”“無(wú)顯著死亡率”等模糊報(bào)告。單次ip 四氧嘧啶200 mg/kg，鼠DM 死亡率為30%，若通過(guò)iv給藥，則死亡率更高[31]。單次ip 四氧嘧啶140 mg/kg，動(dòng)物存活率較高（具體未說(shuō)明）。通過(guò)ip 四氧嘧啶90～140 mg/kg，大鼠血糖恢復(fù)正常，成模率極低，提示低劑量ip 給藥無(wú)法長(zhǎng)期維持大鼠DM 狀態(tài)。通過(guò)iv 80 mg/kg 四氧嘧啶構(gòu)建兔DM 模型，死亡率為75%，增加至150 mg/kg，死亡率達(dá)100%；而分三次給藥（每次50 mg/kg）死亡率為41.67%[32]。綜上，有理由認(rèn)為構(gòu)建DM 模型所需的四氧嘧啶劑量并不恒定，在同一種屬、同性別、成熟度相似且體重相近的情況下，所需劑量均不同，且死亡率極高，給后續(xù)研究帶來(lái)諸多不便。但不同注射劑量及注射方式可表現(xiàn)出不同組織、不同程度的機(jī)體損害。

再者，總結(jié)四氧嘧啶常用造模劑量及對(duì)全身各組織損傷情況，避免選用多臟器損害的劑量進(jìn)行造模，可降低其他臟器產(chǎn)生的誤差，如通過(guò)ip 方式給藥的大鼠，75 mg/kg 可造成胰腺結(jié)構(gòu)改變、動(dòng)脈硬化等病理改變，120 mg/kg 可造成較嚴(yán)重的心肝腎及胰腺等多臟器損害，表明在75～120 mg/kg 區(qū)間內(nèi)選擇偏向75 mg/kg 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物影響較小。在小鼠、家兔及不同注射方式中均有類似表現(xiàn)。因此，通過(guò)對(duì)比不同劑量下機(jī)體各臟器的損害程度及相關(guān)因子的表達(dá)情況，對(duì)選擇合適造模劑量、降低造模死亡率有重要指導(dǎo)意義。

3 總結(jié)

DM 在我國(guó)為高發(fā)疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，治療手段單一。因此，探索其發(fā)病機(jī)制、尋找有效療法至關(guān)重要，而構(gòu)建DM 動(dòng)物模型是研究其機(jī)制和治療方法的基礎(chǔ)及關(guān)鍵環(huán)節(jié)。四氧嘧啶作為構(gòu)建DM 動(dòng)物模型最常用的誘導(dǎo)藥物，國(guó)際上卻未報(bào)道提高其存活率方法，提高存活率及造成的實(shí)驗(yàn)誤差成為DM 建模難題。綜上，本文總結(jié)近年構(gòu)建DM 模型采用的劑量及可能產(chǎn)生的各組織損害，為后期科研工作者提供參考。下一步課題組將對(duì)此進(jìn)行探索，進(jìn)而為相關(guān)研究人員構(gòu)建DM 動(dòng)物模型提供有效依據(jù)。