邵明君 黃翠翠 王巖 高遠(yuǎn)

(1滕州市中心人民醫(yī)院急診科,山東 棗莊 277500;2棗莊科技職業(yè)學(xué)院)

急性心肌梗死(AMI)是指冠狀動脈血管發(fā)生急性狹窄和閉塞,引起心肌細(xì)胞缺血缺氧及壞死,涉及多個生物學(xué)環(huán)節(jié),一系列生物信號通路參與調(diào)節(jié)〔1,2〕。生長分化因子(GDF)-15作為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β超家族中的一分子,對于缺血性心臟病有一定的保護(hù)作用,GDF-15能夠修復(fù)缺血、再灌注損傷后的心肌〔3〕。且相繼有臨床研究指出,GDF-15能夠作為多種心源性疾病的診斷及預(yù)后指標(biāo)〔4〕。有研究發(fā)現(xiàn),GDF-15具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制炎癥細(xì)胞浸潤等作用〔5〕。然而,目前已有的臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果僅能證實GDF-15能夠改善血管閉塞引起的心肌缺血,對AMI的干預(yù)效果尚未明確〔6〕。melusin是一種胞內(nèi)肌特異性表達(dá)蛋白,是一種特殊的生物應(yīng)力感受器,可能通過調(diào)節(jié)下游信號Akt的磷酸化等調(diào)節(jié)心臟功能,對于melusin/Akt通路在AMI中的基礎(chǔ)研究較少〔7～9〕。基于此,本研究對AMI大鼠采用GDF-15進(jìn)行干預(yù),探究其臨床指標(biāo)及其與melusin/Akt通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 選取35只清潔級SD雄性大鼠,8～10周齡,平均(8.55±0.95)周齡,體質(zhì)量180～220 g,平均體質(zhì)量(190.00±19.00)g,購自上海杰思捷公司,動物編號:SYXK(滬)2017-0037,大鼠均常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食飲水,溫度適宜,濕度在50%左右。

1.2AMI模型〔10〕制備 采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制作AMI大鼠模型。27只大鼠于造模前正常飼養(yǎng)2 w,術(shù)前禁食12 h。根據(jù)大鼠體質(zhì)量給予一定劑量的10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。嚴(yán)格控制劑量,避免因劑量而致大鼠死亡。麻醉成功后,固定手術(shù)臺,將心電圖導(dǎo)聯(lián)與大鼠連接,用去毛器在大鼠左胸部進(jìn)行備皮、消毒,隨后用手術(shù)刀在3～4肋間作一橫切口,分離肋間肌肉,鈍性開胸后,輕輕擠壓右胸壁,暴露心臟,找出左前降支,在室間溝左心耳的下方2～3 cm處,對前降支進(jìn)行穿針結(jié)扎,迅速將心臟放回胸腔,關(guān)閉胸腔,擠出胸腔內(nèi)的氣體,密切觀察大鼠生命體征及心電圖的變化,根據(jù)大鼠心電圖的變化確認(rèn)造模成功后將胸壁縫合。術(shù)后注射3 d青霉素預(yù)防感染。造模成功后,將大鼠放回籠子,注意保暖,密切觀測大鼠的生命體征。造模成功標(biāo)準(zhǔn):前降支結(jié)扎成功的大鼠,可見Ⅱ?qū)?lián)的ST段呈弓背向上抬高,持續(xù)30 min以上,可以確認(rèn)造模成功;除此之外,結(jié)扎后的心肌顏色變?yōu)榘咨虬l(fā)紺,以及心電圖出現(xiàn)高聳的R、T波,也可以判定造模成功,共計成功24只大鼠。

1.3分組及干預(yù) 將大鼠隨機分為上調(diào)GDF-15組、下調(diào)GDF-15組、模型組各8只,未進(jìn)行建模的8只正常大鼠作為正常組,下調(diào)GDF-15組于造模前2 d尾靜脈注射100 μl滴度為106～107的GDF-15siRNA慢病毒(GC10312K1605)進(jìn)行干預(yù)。上調(diào)GDF-15組于造模前2 d尾靜脈注射100 μl滴度為106～107的GDF-15cDNA慢病毒(GC10312K1606)。GDF-15 siRNA慢病及GDF-15 cDNA慢病毒均購自廣州復(fù)能基因有限公司。模型組及正常組均給予同等體積的生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。

1.4各組心功能檢測 大鼠經(jīng)30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉,采用MyLabTMSigma VET小動物彩色多普勒超聲儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)檢測左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD),并計算左室短軸短縮率(LVFS)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.5各組心肌酶指標(biāo)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清肌酸磷酸激酶同工酶(CKMB)、乳酸脫氫酶(LDH)含量,取大鼠腹腔靜脈血1 ml,低溫高速離心機離心,3 500 r/min離心10 min分離血清后,酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司,貨號:JN5236、JN19786,具體實驗步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6各組心肌組織觀察 實驗5 d后,處死大鼠,取出其心肌組織。將其在10%甲醛溶液中固定后,石蠟包埋切片脫蠟至水,將切片同染色架放入燒杯中,自來水沖洗。切片入蘇木素染液3～5 min后,自來水洗,1%鹽酸酒精溶液分化,水洗,稀碳酸鋰水溶液藍(lán)化30 s,水洗。切片經(jīng)80%乙醇脫水,入伊紅染色液染色10～30 s。調(diào)色及脫水,透明封片,鏡檢。

1.7熒光定量PCR檢測心肌組織GDF-15表達(dá)水平 大鼠處死后均取梗死區(qū)同一部位左室前壁心肌約20 mg,提取RNA。酶標(biāo)儀上檢測RNA的濃度計純度后,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。最后進(jìn)行qPCR,每個樣本重復(fù)3次。GDF-15正向引物:5'-AGTGAGTCCTTGT-GTCTCTAC-3',反向:5'-GCAGGCTGGTGATGAGTC-3′;反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s。

1.8Western印跡檢測melusin/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá) 100 mg心肌組織中加入500 μl細(xì)胞裂解液充分勻漿后置于冰上裂解30 min。3 500 r/min離心10 min,收集上清,加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)加載緩沖液,100 ℃煮沸10 min。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)轉(zhuǎn)膜。聚偏氟乙烯(PVDF)膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入封閉液稀釋的melusin(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)抗體,4 ℃孵育過夜。磷酸緩沖鹽溶液(PBST)洗滌3次,加入標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,PBST洗滌3次,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行齊性方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組GDF-15表達(dá)比較 如表1所示,與正常組比,上調(diào)GDF-15組、下調(diào)GDF-15組、模型組GDF-15表達(dá)顯著降低(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)GDF-15組GDF-15表達(dá)顯著升高,下調(diào)GDF-15組GDF-15表達(dá)顯著降低。與下調(diào)GDF-15組相比,上調(diào)GDF-15組GDF-15表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

表1 各組GDF-15及心功能、心肌酶指標(biāo)比較

2.2GDF-15對各組心功能指標(biāo)的影響 如表1所示,與正常組比,上調(diào)GDF-15組、下調(diào)GDF-15組、模型組LVEDD、LVESD表達(dá)顯著較高,LVFS、LVEF表達(dá)顯著較低(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)GDF-15組LVEDD、LVESD表達(dá)顯著較低,LVFS、LVEF表達(dá)顯著較高,下調(diào)GDF-15組LVEDD、LVESD表達(dá)顯著較高,LVFS、LVEF表達(dá)顯著較低(P<0.05)。與下調(diào)GDF-15組相比,上調(diào)GDF-15組LVEDD、LVESD表達(dá)顯著較低,LVFS、LVEF表達(dá)顯著較高(P<0.05)。

2.3GDF-15對各組心肌酶指標(biāo)的影響 如表1所示,與正常組比,上調(diào)GDF-15組、下調(diào)GDF-15組、模型組CKMB、LDH表達(dá)顯著較高(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)GDF-15組CKMB、LDH表達(dá)顯著較低,下調(diào)GDF-15組CKMB、LDH表達(dá)顯著較高(P<0.05)。與下調(diào)GDF-15組相比,上調(diào)GDF-15組CKMB、LDH表達(dá)較低(P<0.05)。

2.4各組心肌組織觀察 如圖1所示,模型組心肌纖維組織損傷較嚴(yán)重,排列不緊密且較紊亂,細(xì)胞間隙較大,形狀不規(guī)則。正常組心肌組織排列整齊、致密且清晰可見其結(jié)構(gòu),細(xì)胞間的間隙較小且均勻。上調(diào)GDF-15組心肌纖維排列較為正常,形狀尚可,心肌組織呈現(xiàn)出點狀壞死,下調(diào)GDF-15組心肌纖維組織嚴(yán)重?fù)p傷,排列松散、紊亂,細(xì)胞間的間隙增大,形狀怪異,呈現(xiàn)彌漫性。

圖1 各組心肌組織觀察(HE染色,×400)

2.5GDF-15對AMI模型大鼠melusin/Akt信號通路相關(guān)蛋白的影響 如表2、圖2所示,與正常組比,上調(diào)GDF-15組、下調(diào)GDF-15組、模型組melusin、Akt表達(dá)顯著較低(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)GDF-15組melusin、Akt表達(dá)顯著較高,下調(diào)GDF-15組melusin、Akt表達(dá)顯著較低(P<0.05)。與下調(diào)GDF-15組相比,上調(diào)GDF-15組melusin、Akt表達(dá)顯著較高(P<0.05)。

圖2 Western印跡檢測各組melusin、Akt蛋白表達(dá)

表2 GDF-15對AMI模型大鼠melusin/Akt通路蛋白的影響

3 討 論

GDF-15能夠使心臟梗死區(qū)域血管化程度增加,改善心功能。推測可能是GDF-15抑制了血管內(nèi)皮的凋亡,釋放促血管生成因子使血管內(nèi)皮增生,豐富缺血區(qū)血管化,有利于缺血區(qū)內(nèi)環(huán)境得到改善、提供豐富的血液供應(yīng),對于重建功能、改善心功能等具有重要的意義〔11,12〕。衛(wèi)兵艷等〔13〕研究顯示,GDF-15能夠促進(jìn)AMI小鼠缺血心臟的血管新生,抑制梗死及膠原纖維沉積,對改善AMI的心功能有非常積極的作用。本研究顯示,上調(diào)GDF-15其GDF-15表達(dá)較高。GDF-15的表達(dá)對于改善心肌缺血、心室重構(gòu)及心力衰竭的預(yù)后具有正向作用,GDF-15濃度與冠脈側(cè)支形成呈正相關(guān)。有實驗證實,GDF-15能夠促進(jìn)心肌內(nèi)皮細(xì)胞增殖及成管,說明GDF-15有血管新生的作用〔14〕。本研究顯示,上調(diào)GDF-15可有效改善心功能各項指標(biāo),緩解心室舒張和收縮功能,說明上調(diào)GDF-15可改善心功能。

心肌梗死后,由于損傷心肌結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致心力衰竭、心室重構(gòu)等并發(fā)癥的發(fā)生,因此,早期判斷心肌梗死病變極其重要〔15〕。有研究表明,心臟急性缺血時,心肌組織相關(guān)酶發(fā)生異常變化,其中LDH和CKMB為特異性最強的,因此LDH和CKMB可作為AMI特異性指標(biāo),由于組織缺血缺氧、室壁張力增加,繼而引發(fā)心肌組織壞死。釋放抗原性物質(zhì)、黏附分子、補體、激肽等多種炎癥介質(zhì),誘導(dǎo)炎性細(xì)胞趨化,聚集于梗死部位,并釋放炎癥因子〔15,16〕。本研究顯示,上調(diào)GDF-15對LDH和CKMB表達(dá)可有效改善,促進(jìn)恢復(fù)正常表達(dá),GDF-15激活心臟成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分,修復(fù)心肌損傷,抑制梗死區(qū)擴張,對心臟起保護(hù)作用,從而改善LDH和CKMB表達(dá),降低炎癥反應(yīng)〔17〕。

作為富含半胱氨酸的整合素1相關(guān)蛋白,Melusin分子量是38 kD,在心肌組織和骨骼肌中表達(dá),melusin敲除的小鼠心臟的發(fā)育和基本功能并未影響,但melusin過表達(dá)可誘導(dǎo)代償性的心肌肥厚,維持了心功能,而melusin缺失促進(jìn)轉(zhuǎn)變心力衰竭。有研究證實,在主動脈縮窄的患者中心功能的降低與melusin/Akt通路的表達(dá)減少具有正相關(guān)的關(guān)系〔18〕。隨著梗死范圍擴展、變薄室壁、擴張心室、室增加壁張力,激活機械應(yīng)力感受器整合素,整合素將信號傳遞給胞內(nèi)分子,激活一系列下游通路。melusin的信號途徑包括Akt蛋白等,這一途徑在心肌肥厚中起重要作用。上調(diào)GDF-15對大鼠急性心肌梗死及梗死后心室重構(gòu)具有保護(hù)作用,可改善melusin、Akt蛋白表達(dá),增加血液供應(yīng),在抑制心室重構(gòu)和緩解心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用〔19,20〕。本研究顯示,上調(diào)GDF-15可上調(diào)melusin、Akt蛋白的表達(dá),提示上調(diào)GDF-15改善AMI作用機制可能與melusin/Akt信號通路有關(guān)。

綜上所述,GDF-15上調(diào)能改善AMI大鼠心功能及心肌酶,其作用機制可能與melusin/Akt信號通路有關(guān),為臨床AMI靶向治療提供理論依據(jù)。