李彬 阮劍 袁媛 寧曉潔 趙建國

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 武漢市第一醫(yī)院甲乳外科,湖北 武漢 430022)

乳腺癌是一種臨床常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率較高,尋找副作用少的新藥是當(dāng)下抗腫瘤藥物領(lǐng)域研究的重點(diǎn),中藥具有多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn),是治療乳腺癌的重要手段〔1,2〕。紫鉚因又名紫鉚查爾酮,是一種從漆樹中分離出來的植物多酚類物質(zhì),作為傳統(tǒng)中草藥具有多種藥理活性,如抗氧化、抗腫瘤〔3〕。報(bào)道顯示,紫鉚因可以抑制宮頸癌細(xì)胞Hela的增殖,促進(jìn)其凋亡〔4〕。紫鉚因可以通過抑制PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)U2OS骨肉瘤的凋亡并抑制其侵襲轉(zhuǎn)移〔5〕。紫鉚因可通過減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生來抑制乳腺癌的生長〔6〕。紫鉚因可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖〔7〕。然而紫鉚因?qū)θ橄侔┘?xì)胞的影響及其潛在的分子機(jī)制及作用靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。研究報(bào)道m(xù)iR-487a-3p在胰腺癌〔8〕和前列腺癌〔9〕組織中低表達(dá),過表達(dá)miR-487a-3p可抑制胰腺癌、前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移。然而miR-487a-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及紫鉚因之間的聯(lián)系仍未可知。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察紫鉚因在乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和miR-487a-3p表達(dá)中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1臨床資料 采集武漢市第一醫(yī)院2018年1月至2020年12月乳腺癌患者(43例)的癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣5 cm),年齡29～78歲,平均(52.7±2.1)歲;經(jīng)手術(shù)切除癌組織,患者均知情且同意。本研究患者或家屬均簽署知情同意書并由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞與主要試劑 MDA-MB-231細(xì)胞(美國ATCC);紫鉚因(純度≥98%,無錫云萃生物科技有限公司);甲基噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司);放射免疫沉淀分析法(RIPA)蛋白裂解液、結(jié)晶紫(北京百奧萊博公司);RNA提取及熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.3細(xì)胞分組與處理 RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞并將細(xì)胞分為對(duì)照組(正常培養(yǎng))、紫鉚因-低、中、高組(給予10、20、40 μmol/L的紫鉚因處理48 h)、miR-NC組(將miR-NC轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞)、miR-487a-3p組(將miR-487a-3p模擬物轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞)及紫鉚因+anti-miR-NC組(將miR-487a-3p抑制劑的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞后,用40 μmol/L的紫鉚因處理48 h)、紫鉚因+anti-miR-487a-3p組(將miR-487a-3p抑制劑轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞后,用40 μmol/L的紫鉚因處理48 h)。

1.4細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 在96孔板上接種各組MDA-MB-231細(xì)胞(每孔5 000個(gè)細(xì)胞,含100 μl培養(yǎng)基),孵育48 h,加入MTT試劑(20 μl/孔),再孵育4 h;然后棄去培養(yǎng)基,加入二甲基亞砜(150 μl/孔)使晶體完全溶解,10 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)量每孔的吸光度(OD)值,檢測(cè)波長570 nm,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)。

1.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 在6孔板中培養(yǎng)各組MDA-MB-231細(xì)胞(1 000個(gè)/孔),生長2 w形成集落后,用4%多聚甲醛固定15 min,并用0.1%結(jié)晶紫染色30 min,觀察并計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.6劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 各組MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)過夜細(xì)胞鋪滿孔底后,用無菌移液管尖端在細(xì)胞單層上劃一條線,然后更換培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)0 h和48 h時(shí)對(duì)劃痕進(jìn)行拍照并用Image-Pro Plus6.0軟件對(duì)劃痕寬度進(jìn)行量化,計(jì)算劃痕愈合率。

1.7Transwell小室實(shí)驗(yàn) 將1×104個(gè)細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中重懸,取100 μl細(xì)胞懸液接種到Transwell上室(有基質(zhì)膠包被),600 μl完全培養(yǎng)基加入下室。孵育24 h后去除上表面剩余細(xì)胞,侵入的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計(jì)算5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8Western印跡法檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 用RIPA裂解緩沖液提取各組細(xì)胞總蛋白,50 μg蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜,然后用5%脫脂奶粉封閉膜1 h;將膜與一抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)4 ℃孵育過夜,與二抗在室溫下反應(yīng)1 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑使條帶可視化,分析條帶灰度值,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9RT-qPCR分析miR-487a-3p表達(dá) 使用Trizol試劑提取組織/細(xì)胞總RNA,使用miRcute miRNA-cDNA Kit通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成單鏈互補(bǔ)DNA(cDNA),然后在實(shí)時(shí)PCR儀上擴(kuò)增miRNA,采用2-ΔΔCt法分析miR-487a-3p相對(duì)表達(dá)量,U6為內(nèi)參。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1紫鉚因抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖 與對(duì)照組比較,紫鉚因-低、中、高組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高,克隆形成數(shù)顯著減少,呈顯著濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及miR-487a-3p水平比較

2.2紫鉚因?qū)iR-487a-3p表達(dá)的影響 與對(duì)照組比,紫鉚因低、中、高組miR-487a-3p水平顯著升高,呈顯著濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

2.3紫鉚因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與對(duì)照組比,紫鉚因-低、中、高組劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)和MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低,呈顯著濃度依賴性(P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

1～8:對(duì)照組、紫鉚因-低組、紫鉚因-中組、紫鉚因-高組、miR-NC組、miR-487a-3p組、紫鉚因+anti-miR-NC組、紫鉚因+anti-miR-487a-3p組;圖2同圖1 紫鉚因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 miR-487a-3p過表達(dá)抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲

2.4miR-487a-3p在乳腺癌組織中的表達(dá) 乳腺癌組織中miR-487a-3p的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(0.37±0.04 vs 1.00±0.10,n=43,t=30.373,P<0.05)。

2.5miR-487a-3p過表達(dá)抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲 與miR-NC組比,miR-487a-3p組miR-487a-3p水平、增殖抑制率顯著升高,克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)和MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

2.6抑制miR-487a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了紫鉚因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 紫鉚因+anti-miR-487a-3p組相較于紫鉚因+anti-miR-NC組,miR-487a-3p水平、細(xì)胞增殖抑制率顯著降低,克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)和MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表3。

表3 抑制miR-487a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了紫鉚因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用

3 討 論

在乳腺癌治療中,中醫(yī)藥是重要手段之一,其可多層次、多途徑抑制腫瘤,且毒副作用小,闡明中醫(yī)藥的具體作用機(jī)制,可以更好地發(fā)揮其效用〔10〕。紫鉚因作為一種傳統(tǒng)中藥,具有抗腫瘤作用,如紫鉚因可通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路的活化抑制人胃癌細(xì)胞增殖〔11〕。紫鉚因可抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔12〕。紫鉚因可通過下調(diào)雌激素受體(ER)α抑制乳腺癌生長〔13〕。以上研究表明紫鉚因?qū)Χ喾N腫瘤均具有抗癌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫鉚因可濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移侵襲,提示紫鉚因具有抗對(duì)乳腺癌生長的作用。

miR-487a-3p屬于miRNA的一種,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程;研究報(bào)道m(xù)iR-487a-3p通過靶向PPM1A抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長和侵襲〔14〕。miR-487a-3p可通過抑制TM4SF1的表達(dá)抑制腎癌細(xì)胞ACHN的增殖和侵襲〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,乳腺癌組織中miR-487a-3p的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,過表達(dá)miR-487a-3p可降低MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,并降低MMP-2、MMP-9表達(dá);表明過表達(dá)miR-487a-3p可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,提示miR-487a-3p可能在乳腺癌中起抑癌作用。此外,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紫鉚因可上調(diào)miR-487a-3p表達(dá),敲低miR-487a-3p可明顯減弱紫鉚因?qū)DA-MB-231細(xì)胞惡性行為的抑制作用。

總之,紫鉚因可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其作用機(jī)制可能與上調(diào)miR-487a-3p表達(dá)有關(guān)。