蘇兵 劉娟 高曉峰 李碩 左莉莉

(衡水市人民醫(yī)院,河北 衡水 053000)

雖然心臟病臨床治療在降低心血管疾病死亡率方面取得了很大的進(jìn)展,但缺血性心臟病,尤其是心肌梗死,仍是人類健康的主要威脅〔1,2〕。心肌梗死的病程在臨床上可分為超急性、急性、亞急性和慢性〔3〕,急性期的充分護(hù)理和治療對(duì)于心肌梗死損傷后患者的預(yù)后至關(guān)重要〔4,5〕。急性心肌梗死(AMI)的特征之一是心肌纖維化,AMI后心肌纖維化屬于心肌重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)之一,主要的病理變化為缺血誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞激活并增生合成大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),導(dǎo)致ECM過(guò)度沉積,最終導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)的破壞和器官衰竭〔6,7〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)被定義為一種長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸且不編碼蛋白質(zhì)的RNAs〔8〕。LncRNAs與常見(jiàn)病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)〔9～12〕。據(jù)報(bào)道,LncRNAs 可能作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性 RNAs (ceRNAs) 來(lái)調(diào)節(jié) miRNAs 的表達(dá)〔13〕。LncRNAs被發(fā)現(xiàn)參與了纖維化的進(jìn)程〔14,15〕,LncRNA H19位于人類第11號(hào)染色體端粒區(qū)附近的H19基因,是最廣為人知的印跡基因之一〔16〕。LncRNAs H19表達(dá)在纖維化的人近端腎小管上皮細(xì)胞及纖維化肝星狀細(xì)胞中顯著上調(diào)〔17,18〕。本研究探討LncRNAs H19在心肌纖維化進(jìn)程中的作用,以期為AMI有效治療開(kāi)拓新視野。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 原代HCFs購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),在37 ℃、5%CO2的條件下,在補(bǔ)充了10%胎牛血清(FBS,美國(guó)Invitrogen公司)、1%青霉素和1%鏈霉素(美國(guó)Gibco公司)的加濕培養(yǎng)箱中孵育48 h,37 ℃下血管緊張素(Ang)Ⅱ(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)處理(0.01 mmol/L)24 h,以誘導(dǎo)心肌纖維化表型。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 通過(guò)LiPofectamine 2000 (貨號(hào):11668-019,美國(guó)Invitrogen公司)將si-NC、si-H19#1/2、inhibitor-NC、miR-130a-3p inhibitor、pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-Ⅰ型TGF-β受體(TGFBR1)(上海Genechem公司)轉(zhuǎn)染至HCFs中,正常培養(yǎng)基中恢復(fù)24 h。分組:Blank組(未進(jìn)行處理的HCFs)、AngⅡ組(AngⅡ處理的HCFs)、AngⅡ+si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC后,使用AngⅡ處理的HCFs)、AngⅡ+si-H19#1組(轉(zhuǎn)染si-H19#1,再進(jìn)行AngⅡ處理的HCFs)、AngⅡ+si-H19#2組(轉(zhuǎn)染si-H19#2,再進(jìn)行AngⅡ處理的HCFs)、AngⅡ+si-H19+inhibitor-NC組(轉(zhuǎn)染si-H19#1和inhibitor-NC,再進(jìn)行AngⅡ處理的HCFs)、AngⅡ+si-H19+miR-inhibi組(轉(zhuǎn)染si-H19#1和miR-130a-3p inhibitor,再進(jìn)行AngⅡ處理的HCFs)、AngⅡ+si-H19+oe-NC組(轉(zhuǎn)染si-H19#1和pcDNA3.1-NC,再進(jìn)行AngⅡ處理的HCFs)、AngⅡ+si-H19+oe-TGFBR1(轉(zhuǎn)染si-H19#1和pcDNA3.1-TGFBR1,再進(jìn)行AngⅡ處理的HCFs)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 使用Trizol (美國(guó)Invitrogen公司)裂解HCFs。RNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司)提取總RNA,根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū),使用SuperScript Ⅳ試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在50 ℃ 10 min與80 ℃ 10 min下合成cDNA。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū),使用PowerUpTMSYBRTMGreen Master mix (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司) 和 ABI ViiA 7 System (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行qRT-PCR。采用以下熱循環(huán)條件:95 ℃初始變性120 s,95 ℃變性15 s,60 ℃延伸60 s,循環(huán)40次。用2-ΔΔCt方法〔19〕進(jìn)行定量。引物序列:miR-130a-3p正向5′-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3′,反向5′-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3′;H19正向5′-TCCCAGAACCCACAACATGAA-3′,反向5′-TTCACCTTCCAGAGCCGATTC-3′;TGFBR1正向5′-GACAAC-GTCAGGTTCTGGCTCA-3′,反向5′-CCGCCACTTTCCTCTCCAAACT-3′;GAPDH正向5′-AGCCACATC-GCTCAGACAC-3′,反向5′-GCCCAATACGACCAAA-TCC-3′;U6正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4CCK-8實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以3 000個(gè)/孔接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后,培養(yǎng)0、24、48、72 h,在37 ℃下向培養(yǎng)基中加入10 μl CCK-8溶液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。使用多功能酶標(biāo)儀(英國(guó)Hybrid Technology公司)測(cè)定450 nm處的吸光度。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中,培養(yǎng)至達(dá)到融合。如1.2中的方法處理細(xì)胞后,使用1 000 μl無(wú)菌微量移液器吸頭在每孔的細(xì)胞層中心下方劃痕。然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞兩次,并在不含胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在劃痕后0、24 h于明視場(chǎng)顯微鏡(日本Olympus公司)下每組采集3個(gè)隨機(jī)獨(dú)立視野圖像。使用ImageJ軟件(版本v1.52a;美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)對(duì)劃痕的寬度進(jìn)行定量測(cè)量,并計(jì)算遷移率。

1.6Western印跡 根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明,使用RIPA裂解緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)從細(xì)胞中分離總蛋白。全細(xì)胞蛋白提取物經(jīng)二喹啉甲酸(BCA)法鑒定。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白裂解物,并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(美國(guó)Bio-Rad公司)上。用含吐溫的Tris緩沖鹽水(TBST)中的5%脫脂乳封閉后,用TBST清洗膜一次,一抗4 ℃孵育過(guò)夜。使用GAPDH作為上樣對(duì)照。用耦聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的IgG二抗孵育后,使用增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光(ECL)法(美國(guó)Amersham Biosciences公司)顯示條帶。一抗:膠原蛋白CollagenⅠ(稀釋倍數(shù)1∶1 000,貨號(hào)ab138492,英國(guó)Abcam公司)、Collagen Ⅲ(稀釋倍數(shù)1∶1 000,貨號(hào)ab7778,英國(guó)Abcam公司)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA,稀釋倍數(shù)1∶1 000,化號(hào)ab5694,英國(guó)Abcam公司)、GAPDH(稀釋倍數(shù)1∶1 000,貨號(hào)ab9485,英國(guó)Abcam公司)。二抗:IgG(稀釋倍數(shù)1∶1 000,貨號(hào)ab150077,英國(guó)Abcam公司)。

1.7核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn) 根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū),使用NE-PER核質(zhì)細(xì)胞提取試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)分別提取質(zhì)提取物和核提取物。然后通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)核質(zhì)提取物中H19的表達(dá)。

1.8雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 通過(guò)Starbase網(wǎng)站(https://starbase.sysu.edu.cn/)分析H19與miR-130a-3p及miR-130a-3p與TGFBR1的靶向關(guān)系結(jié)合位點(diǎn),通過(guò)將結(jié)合序列及突變的序列分別克隆至熒光素酶載體pGL3(美國(guó)Promega公司)中來(lái)建立野生型(H19-wt、TGFBR1-wt)和突變型 (H19-mut、TGFBR1-mut)熒光素酶質(zhì)粒。將HCFs細(xì)胞(美國(guó)ATCC)接種在6孔板中(2×105細(xì)胞/孔)。孵育24 h,按照說(shuō)明書(shū)使用LiPofectamine 2000(貨號(hào)11668-019,美國(guó)Invitrogen公司)將構(gòu)建好的熒光素酶載體與mimic-NC或miR-130a-3p mimic同時(shí)轉(zhuǎn)染到HCFs細(xì)胞中。24 h后,用Dual-Lucy Assay Kit(北京Solarbio公司)對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行評(píng)估。

1.9RNA免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Magna RIP Kit(美國(guó)Millipore公司)的說(shuō)明,HCFs的裂解物與anti-Ago2/anti-IgG耦聯(lián)的磁珠孵育4 h,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)免疫沉淀RNA中LncRNA H19和miR-130a-3p的富集。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件和GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)、單因素方差分析和多因素方差分析,事后檢驗(yàn)采用Tukey多重檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1低表達(dá)H19可抑制HCFs纖維化的進(jìn)程 與Blank組相比,Ang Ⅱ組H19表達(dá)水平(1.00±0.02 vs 2.47±0.04)、細(xì)胞增殖活力(24、48、96 h)、細(xì)胞遷移能力、Collagne Ⅰ、Collagen Ⅲ和α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05,P<0.001)。與Ang Ⅱ+si-NC組(2.51±0.05)相比,Ang Ⅱ+si-H19#1組(1.46±0.04)和Ang Ⅱ+si-H19#2組H19表達(dá)(1.88±0.05)均顯著降低(t=40.167、21.824,均P<0.001),且Ang Ⅱ+si-H19#1組較Ang Ⅱ+si-H19#2組顯著更低(t=16.067,P<0.001),故選擇si-H19#1作為si-H19進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(作為Ang Ⅱ+si-H19組)。與Ang Ⅱ+si-NC組相比,Ang Ⅱ+si-H19組細(xì)胞增殖活力(24、48、96 h)、細(xì)胞遷移能力、Collagne Ⅰ、Collagen Ⅲ和α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05,P<0.001)。見(jiàn)圖1、表1、表2、圖2。

表1 各組不同時(shí)間HCFs細(xì)胞增殖活力比較

表2 各組遷移實(shí)驗(yàn)及Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

1～8:Blank組、AngⅡ組、AngⅡ+si-NC組、AngⅡ+si-H19組、AngⅡ+si-H19+inhibitor-NC組、AngⅡ+si-H19+miR-inhibi組、AngⅡ+si-H19+oe-NC組、AngⅡ+si-H19+oe-TGFBR1組;圖2同圖1 Western印跡檢測(cè)各組CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA蛋白表達(dá)

圖2 各組遷移實(shí)驗(yàn)(×400)

2.2H19通過(guò)結(jié)合miR-130a-3p調(diào)控TGFBR1表達(dá) 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示H19主要分布于細(xì)胞質(zhì)中(圖3A)。RNA-FISH實(shí)驗(yàn)分析H19在HCFs中的亞細(xì)胞定位也顯示H19主要分布于HCFs的細(xì)胞質(zhì)中(圖3B)。Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)顯示miR-130a-3p中存在H19和TGFBR1結(jié)合的位點(diǎn)(圖3C)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,在轉(zhuǎn)染H19-wt的細(xì)胞中,與共轉(zhuǎn)染mimic NC(1.00±0.02)相比,共轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimic的熒光素酶活性(0.36±0.04)明顯降低(t=35.054,P<0.05)。在轉(zhuǎn)染TGFBR1-wt的細(xì)胞中,與轉(zhuǎn)染mimic NC(1.00±0.03)相比,共轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimic的熒光素酶活性(0.43±0.03)明顯降低(t=32.909,P<0.05)。在轉(zhuǎn)染H19-mut的細(xì)胞中,與共轉(zhuǎn)染mimic NC(1.00±0.02)相比,共轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimic的熒光素酶活性(1.00±0.03)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.001,P>0.05)。在轉(zhuǎn)染TGFBR1-mut的細(xì)胞中,與轉(zhuǎn)染mimic NC(1.00±0.02)相比,共轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimic的熒光素酶活性(1.00±0.05)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.001,P>0.05)。RIP實(shí)驗(yàn)顯示,與Anti-IgG相比,Anti-Ago2細(xì)胞中H19和miR-103a-3p表達(dá)水平均顯著升高(P<0.001)。見(jiàn)表3。qRT-PCR顯示,與si-NC組相比,si-H19組HCFs中miR-130a-3p表達(dá)明顯升高,TGFBR1表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 RIP實(shí)驗(yàn)

表4 qRT-PCR檢測(cè)

圖3 H19通過(guò)結(jié)合miR-130a-3p調(diào)控TGFBR1表達(dá)

2.3下調(diào)miR-130a-3p可部分逆轉(zhuǎn)si-H19對(duì)HCFs纖維化的抑制作用 與Ang Ⅱ+si-H19+inhibitor-NC組(2.38±0.05)相比,Ang Ⅱ+si-H19+miR-inhibi組miR-130a-3p表達(dá)水平(1.52±0.04)顯著降低,細(xì)胞遷移能力、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.001)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,與Ang Ⅱ+si-H19+inhibitor-NC組相比,Ang Ⅱ+si-H19+miR-inhibi組48、96 h細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1、表2、圖2。

2.4上調(diào)TGFBR1可以部分逆轉(zhuǎn)si-H19對(duì)HCFs纖維化的抑制作用 與Ang Ⅱ+si-H19+oe-NC組相比,Ang Ⅱ+si-H19+oe-TGFBR1組TGFBR1 mRNA表達(dá)水平(0.32±0.04 vs 0.74±0.03)顯著升高(t=20.576,P<0.001),細(xì)胞遷移能力、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.001)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,與Ang Ⅱ+si-H19+oe-NC組相比,Ang Ⅱ+si-H19+oe-TGFBR1組96 h細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1、表2、圖2。

3 討 論

AMI是世界上發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一〔20〕,并可能誘發(fā)心室重構(gòu)和心力衰竭〔21〕。據(jù)報(bào)道,心肌纖維化與心臟微血管的稀疏有關(guān),且能導(dǎo)致心力衰竭,心力衰竭是由心肌成纖維細(xì)胞積聚和ECM沉積中膠原的合成、代謝和降解失衡引起的〔22〕。CFCs是分泌心肌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞。在目前的研究中,用Ang Ⅱ處理HCFs誘導(dǎo)心肌纖維化表型。本研究發(fā)現(xiàn)H19在用Ang Ⅱ處理的HCFs中高表達(dá),表明H19可能與心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。研究表明,H19有助于心臟的纖維化進(jìn)程〔23〕,這與本研究的結(jié)果一致。此外,本研究也觀察到了H19促進(jìn)了HCFs的增殖并增強(qiáng)了纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá),而下調(diào)H19的表達(dá)則產(chǎn)生了相反的效果。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明,H19可能促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)miR-130a-3p是H19的潛在靶點(diǎn)之一。在目前的研究中,Ang Ⅱ治療導(dǎo)致miR-130a-3p 表達(dá)減少,而H19下調(diào)則顯著增加了miR-130a-3p表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明,H19可能直接靶向miR-130a-3p并下調(diào)其表達(dá)水平。有研究表明,miR-130a-3p可以減輕肝纖維化的發(fā)生〔24〕。Feng等〔25〕則報(bào)道了 miR-130a-3p通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路減弱心肌梗死后的心肌纖維化。Tan等〔26〕的報(bào)道表明TGFBR1信號(hào)通路與心肌纖維的發(fā)生息息相關(guān),而通過(guò)Starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)到miR-130a-3p與TGFBR1存在結(jié)合位點(diǎn)。故而猜測(cè)H19通過(guò)miR-130a-3p/TGFBR1在心肌纖維化中發(fā)揮調(diào)控作用。在本研究中,miR-130a-3p下調(diào)或TGFB1上調(diào)均促進(jìn)了HCFs的增殖、遷移及纖維化蛋白的表達(dá)。膠原蛋白(一種不溶性纖維蛋白)是ECM的主要成分〔27,28〕。本研究表明,H19通過(guò)海綿化miR-130a-3p促進(jìn)了HCFs的增殖和纖維化相關(guān)蛋白的蛋白表達(dá)。

綜上,H19沉默抑制了HCFs的增殖和膠原表達(dá),這被miR-130a-3p下調(diào)或TGFBR1上調(diào)部分逆轉(zhuǎn);因此,H19通過(guò)海綿化miR-130a-3p促進(jìn)TGFBR1的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞增殖、遷移和纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。因此,H19可能是AMI治療的一個(gè)新的有效靶點(diǎn)。