趙丹丹 焦盼盼 吳宿慧,2 李寒冰,2 李根林,2

(1河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州 450046;2河南省仲景方藥健康衰老產(chǎn)業(yè)工程研究中心)

衰老是指隨著時間推移,生物對環(huán)境及心理上適應能力降低,逐漸走向衰亡的過程〔1〕,是自然界的一種普遍現(xiàn)象,任何生物都無法抗拒的生理過程。有研究發(fā)現(xiàn),人類衰老自胚胎發(fā)育時期已經(jīng)開始〔2〕,而全球老齡化人口正在以越來越快的速度擴大,到2050年,世界四分之一人口將由老年人組成。由于衰老研究成本高、耗時長、衰老過程復雜,因此衰老研究被認為是最困難的生物學領域之一〔3〕。秀麗隱桿線蟲是一種在土壤中生活的真核生物,全身透明易觀察,生命周期短,基因組序列已知,可操控性強,價格低廉〔4〕,并且具有與人類基因組序列高度的同源性〔5〕、高度保守的信號通路等優(yōu)勢,被廣泛應用于抗衰老領域的研究。地黃是玄參科地黃屬植物,以塊根入藥,是著名的“四大懷藥”之一,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,生地黃具有滋陰清熱、涼血止血的功效〔6〕。生地黃作為一種傳統(tǒng)中草藥,在我國被廣泛用于治療衰老相關疾病,但其延緩衰老成分并未完全闡明,梓醇作為生地黃中含量最高的活性單體成分之一,研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎和抗氧化、心血管保護、神經(jīng)保護、抗糖尿病、抗癌、保肝等多種藥理作用〔7～12〕,然而,梓醇的抗衰老特性及其作用機制報道尚少。因此,本研究以秀麗隱桿線蟲為模式生物,研究梓醇抗衰老特性及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料和儀器 梓醇(從生地黃中提取,≥98%,分子式C15H22O10,分子量362.45)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。尿嘧啶缺陷型大腸桿菌OP50、野生型N2秀麗隱桿線蟲、突變體線蟲Daf-2(CF1041)、Daf-16(CF1038)購自美國秀麗隱桿線蟲遺傳中心(CGC)。蛋白胨、瓊脂粉、膽固醇(北京奧博星生物技術有限責任公司);胡桃醌(上海阿拉丁試劑公司);TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ、Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (寶日醫(yī)生物技術有限公司);氯化鈉、次氯酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氫氧化鈉、乙醇、異丙醇、氯仿等均為分析純。生化培養(yǎng)箱(LRH-250,上海一恒科學儀器有限公司);超聲波清洗器(KQ5200B,昆山市超聲儀器有限公司);體式顯微鏡(SMZ-161,麥克奧迪實業(yè)集團有限公司);分析天平(BSA224S-CW,德國賽多利斯公司);自動凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR儀,美國Applied Biosystems公司);低溫離心機(FRESO21)、超微量紫外分光光度計(Nano Drop One C 2000)購自美國Thermo Fisher公司;超純水純化系統(tǒng)(ESW-I-30,上海茸研生化儀器廠);高壓滅菌鍋(HVE-50,日本HIRAYAMA公司);制冰機(SIM-F140AY65,寧波格蘭特制冷設備制造有限公司)。

1.2溶液配制 (1)LB固體培養(yǎng)基:準確稱量氯化鈉2.0 g,胰蛋白胨2.0 g,酵母提取物1.0 g,瓊脂粉3 g,加入200 ml超純水,超聲混勻后,121 ℃,20 min高壓滅菌。(2)LB液體培養(yǎng)基:準確稱量氯化鈉2.0 g,胰蛋白胨2.0 g,酵母提取物1.0 g,加入200 ml超純水,超聲混勻后,121 ℃,20 min高壓滅菌。(3)M9緩沖溶液:準確稱量磷酸二氫鉀0.602 g,磷酸氫二鈉2.922 g,氯化鈉0.104 g,硫酸鎂0.206 g,加入純水200 ml,超聲混勻后,121 ℃,20 min高壓滅菌,超凈工作臺冷卻至室溫,放4 ℃冰箱備用。(4)同期化漂白液配制:0.33 mol/L的氫氧化鈉3 ml、7 %的次氯酸鈉1.4 ml和0.6 ml的超純水混勻,避光(現(xiàn)配現(xiàn)用)。(5)1 mol/L磷酸鉀緩沖溶液:準確稱量磷酸二氫鉀27.2 g,磷酸氫二鉀11.401 g,純水定容至250 ml,用磁力攪拌器混勻,1 mol/L氫氧化鉀調(diào)pH為6.0,121 ℃,20 min高壓滅菌,超凈工作臺放涼后放入4 ℃冰箱中備用。(6)1 mol/L氯化鈣溶液:準確稱量22.2 g的無水氯化鈣加入純水200 ml,超聲混勻后,121 ℃,20 min高壓滅菌,超凈工作臺待放涼后放入4 ℃冰箱備用。(7)1 mmol/L硫酸鎂溶液:準確稱量49.2 g的硫酸鎂加入純水200 ml,超聲混勻后,121 ℃,20 min高壓滅菌,超凈工作臺待放涼后放入4 ℃冰箱備用。(8)5 mg/ml膽固醇溶液:準確稱量1.0 g膽固醇加入200 ml無水乙醇,超聲混勻后,放入4 ℃冰箱備用。(9)75%無水乙醇:取9 ml的無水乙醇加入3 ml的無水RNase后混勻放置。

1.3藥液配制 取15 ml離心管,準確稱量20.0 mg梓醇置于離心管中,加入10 ml純水,得到原液2 mg/ml。濃度依次稀釋成0.100、0.050、0.025 mg/ml。

1.4線蟲固體培養(yǎng)基 NGM培養(yǎng)基:精密稱取0.6 g氯化鈉、0.5 g蛋白胨、3.4 g瓊脂粉、200 μl膽固醇(5 mg/ml膽固醇),加入純水200 ml,超聲混勻,121 ℃高壓滅菌鍋12 min后,放入超凈工作臺中,加入200 μl氯化鈣(1 mol/L氯化鈣),200 μl硫酸鎂(1 mol/L硫酸鎂)和5 ml(1 mol/L磷酸鉀緩沖溶液)慢慢搖勻,倒入培養(yǎng)皿中。

1.5線蟲同期化 取M9緩沖液沖洗含有孕蟲的培養(yǎng)皿,反復沖洗幾次至離心管中,3 000 r/min,3 min,棄去上清。迅速加入5 ml次氯酸鈉漂白液,室溫下劇烈震蕩2.5 min,然后4 000 r/min,1 min,棄去上清,用5 ml M9緩沖液重懸底部沉淀,混勻后3 000 r/min,3 min,棄上清,M9重懸底部沉淀過程重復3次,吸取沉淀加入含有大腸桿菌的培養(yǎng)基中,N2線蟲和Daf-16線蟲置于20 ℃培養(yǎng)箱中,Daf-2線蟲在15 ℃培養(yǎng)箱中,孵育大約52 h后,由卵可得到L4期線蟲,用于后續(xù)實驗。

1.6壽命實驗 將L4期N2、Daf-2及Daf-16線蟲隨機挑取至空白對照組、梓醇高、中、低劑量給藥組(0.100、0.050、0.025 mg/ml),每組平行3盤,每盤30條。每天計數(shù)線蟲死亡數(shù)、上壁數(shù)、鉆培養(yǎng)基數(shù),飼養(yǎng)至每組線蟲全部死亡為止。判斷線蟲死亡標準:用熱鉑絲針輕觸線蟲,觀察線蟲是否有反應。

1.7生殖實驗 挑取L4期N2野生型線蟲至空白對照組、梓醇高、中、低劑量組,每組10盤,每盤1條,開始產(chǎn)卵時記錄為生殖實驗第一天,每隔一天將線蟲轉移至新的培養(yǎng)基中,直到線蟲進入生殖后期不再產(chǎn)卵。將含有卵的培養(yǎng)基養(yǎng)至蟲卵長大,在子代產(chǎn)卵前計算蟲數(shù),計算得到的總蟲數(shù)即該線蟲的產(chǎn)卵數(shù)。

1.8抗應激實驗

1.8.1急性熱應激實驗 挑取L4期N2野生型線蟲至空白對照組、梓醇高、中、低劑量給藥組,連續(xù)給藥7 d后,將不含大腸桿菌的培養(yǎng)基置35 ℃培養(yǎng)箱預熱1 h,然后每組挑取線蟲20條置于該培養(yǎng)基中,35 ℃培養(yǎng)進行實驗,每隔1 h計數(shù)線蟲死亡、存活數(shù)目至全部死亡。

1.8.2胡桃醌應激實驗 挑取L4期N2野生型線蟲至空白對照組、梓醇高、中、低劑量給藥組,連續(xù)給藥7 d后,挑取20條至胡桃醌終濃度500 μmol/L不含大腸桿菌的培養(yǎng)基中。每隔1 h計數(shù)線蟲死亡、存活數(shù)目至全部死亡。

1.8.3紫外應激實驗 挑取L4期N2野生型線蟲至空白對照組、梓醇高、中、低劑量給藥組,連續(xù)給藥7 d后,每組挑取20條至不含大腸桿菌的培養(yǎng)基中,采用75 μW/cm2紫外燈平放照射(未關箱門)照射15 min,每隔30 min計數(shù)線蟲死亡、存活數(shù)目直至全部死亡。

1.8.4過氧化氫應激實驗 挑取L4期N2野生型線蟲至空白對照組、梓醇高、中、低劑量給藥組,連續(xù)給藥7 d后,每組挑取8條,置于含30 mmol/L雙氧水溶液的24孔板中。記錄線蟲死亡時間。

1.9擺動頻率的測定 挑取L4期N2野生型線蟲至空白對照組、梓醇高、中、低劑量給藥組,連續(xù)給藥7 d后,測試線蟲擺動頻率,取96孔板,每孔板中加入200 μl的M9,然后挑取1條線蟲,觀察線蟲1 min內(nèi)身體擺動次數(shù),并記錄數(shù)據(jù)。

1.10實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR) 將N2野生型線蟲同期化培養(yǎng)至L4期,分為空白對照組、梓醇高、中、低劑量給藥組。每組各挑取約600條L4期線蟲,連續(xù)給藥7 d。采用低溫Trizol法提取線蟲體內(nèi)總RNA,實驗按照Takara(PrimeScriptTMRT reagent Kit)試劑盒進行反應得cDNA,最后按照Takara(TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ)試劑盒進行熒光定量反應。具體步驟:預變性95 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。引物設計為目的基因Daf-2、Daf-16、Sod-3、Ctl-1,以Act-1為內(nèi)參。引物序列委托上海華大基因生物有限公司合成。見表1。

表1 引物基因堿基序列

1.11統(tǒng)計學處理 采用 GraphPad Prism5.0軟件作圖,SPSS25.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理。單因素方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學檢驗,多重比較方差齊時選用Turkey HSD和LSD法,方差不齊時選用TamhaneT2 檢驗和DunnettT3法。兩組樣本比較采用獨立樣本T檢驗。所有實驗獨立重復3次。

2 結 果

2.1梓醇影響秀麗隱桿線蟲壽命 梓醇高、中劑量組N2線蟲平均壽命顯著高于空白對照組(P<0.01,P<0.05)。而梓醇對于突變體Daf-2和Daf-16線蟲平均壽命差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖1。

圖1 3組不同線蟲生存率

表2 各組線蟲生存時長

2.2梓醇對線蟲生殖能力和運動能力的影響 不同濃度梓醇處理后N2線蟲生殖能力無統(tǒng)計學差異(P>0.05),表明梓醇對N2 線蟲生殖能力沒有明顯作用。與空白組比較,梓醇高、中劑量組N2線蟲運動能力明顯提高(P<0.01)。見表3。

表3 各組線蟲生殖、運動能力比較

2.3梓醇對線蟲抗應激能力的影響 在過氧化氫(H2O2)應激、高溫熱應激(35 ℃)、紫外線輻射應激和胡桃醌應激等應激條件下,與空白組比較,梓醇高、中劑量組平均生存時間顯著延長(P<0.05,P<0.01)。與空白組相比,不同濃度梓醇均能使N2線蟲應激生存曲線右移,生存曲線右移揭示梓醇延緩了秀麗線蟲的衰老。見表4、圖2。

表4 各組線蟲急性應激存活平均生存時長比較

2.4梓醇對線蟲衰老相關基因表達的影響 與空白組相比,梓醇高劑量組N2線蟲體內(nèi)Daf-2 mRNA表達水平顯著下調(diào),而Daf-16、Sod-3和Ctl-1 mRNA表達水平顯著上調(diào)(P<0.01,P<0.05);梓醇中劑量組Sod-3、Ctl-1 mRNA表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見表5。

表5 各組野生型線蟲mRNA表達水平比較

3 討 論

生物體壽命不可避免伴隨著衰老過程,包括功能衰退、大量慢性疾病逐漸增加,并最終導致死亡〔13〕。盡管衰老無法避免,但是人們還是致力于找到一些干預的措施延緩衰老。橙提取物可以通過胰島素/胰島素樣生長因子(IGF)信號傳導途徑磷脂酰肌醇3-激酶同源物Age-1和Daf-16基因、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路及抗氧化基因增強線蟲抗氧化性能,減輕細胞損傷,延長秀麗隱桿線蟲的壽命〔14〕。迷迭香酸通過胰島素信號途徑和 MAPK信號途徑改善秀麗隱桿線蟲的抗氧化特性,延長了線蟲壽命〔15〕。玉竹葉提取物通過Daf-16/叉頭轉錄因子(Fox)O和SKN-1/核因子E2相關因子(Nrf)-2 信號通路延長壽命,提高了秀麗隱桿線蟲抗氧化應激的特性〔16〕。梓醇是地黃環(huán)烯醚萜苷類含量最高的活性單體成分,研究發(fā)現(xiàn)梓醇具有抗炎和抗氧化等藥理作用〔17〕,研究發(fā)現(xiàn),線蟲繁殖力降低可以延長秀麗隱桿線蟲的壽命〔18〕,本實驗結果表明,梓醇對野生型秀麗隱桿線蟲繁殖力沒有明顯影響,表明梓醇具有抗衰老作用但并不降低線蟲繁殖力,通過對運動能力實驗發(fā)現(xiàn),梓醇可以改善因衰老引起的運動能力下降。研究表明,壓力應激狀態(tài)下應激能力的增強也是線蟲延長壽命的原因之一〔19,20〕。本實驗結果進一步證明了梓醇延緩衰老的作用。胰島素信號通路是調(diào)控衰老的途徑之一,在多種模式生物中都具有高度的保守性,在線蟲體內(nèi)也發(fā)揮著重要作用。Daf-2和Daf-16這兩個基因是胰島素信號通路上與壽命相關的調(diào)控因子,Daf-2是胰島素受體樣基因〔21〕,Daf-16是FoxO轉錄因子的同源物,是調(diào)節(jié)壽命的關鍵分子開關,其下游靶基因有Sod-3、Ctl-1等〔22,23〕。在胰島素信號通路中,線蟲體內(nèi)的Daf-2受體與胰島素配體結合之后,激活了磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Age-1,產(chǎn)生了一系列磷酸化級聯(lián)反應,Age-1又通過蛋白激酶B(AKT)-1、AKT-2、血清和糖皮質(zhì)激素誘導的蛋白激酶(SGK)-1通路引起Daf-16磷酸化,阻止其進入細胞核對下游靶基因進行調(diào)控,進而影響壽命〔24〕。本研究結果表明,胰島素信號通路中Daf-2 mRNA表達降低,Daf-16 mRNA表達升高,促進了下游靶基因Sod-3、Ctl-1表達,延緩了線蟲的衰老。為了進一步確定其作用機制,本研究對胰島素信號通路上Daf-2(CF1041)、Daf-16(CF1038)突變體進行研究,結果表明,梓醇并未延長突變體Daf-2、Daf-16的壽命,以上結果表明,梓醇可能是通過胰島素信號通路來延長線蟲的壽命。

綜上,梓醇延緩秀麗隱桿線蟲正常狀態(tài)和氧化應激狀態(tài)下的壽命,并不影響其生殖能力,同時改善了應激狀態(tài)下線蟲運動能力,其作用機制可能是通過胰島素/IGF-1信號通路,促進Daf-16下游相關抗氧化基因表達,提高線蟲抗氧化應激能力,從而延長線蟲壽命。本研究為梓醇的研究提供了新思路,但是壽命調(diào)控機制眾多,還需要進一步探索。