陳紫英 黃楚容 張 宏 岳修杰

（珠海市香洲區(qū)人民醫(yī)院，廣東 珠海 519000）

呼吸道感染是兒童住院的首位原因，也是嬰幼兒感染性疾病發(fā)病和死亡的一個重要原因，在全球范圍內(nèi)引起的疾病及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)十分嚴(yán)峻[1-2]。急性呼吸道感染病因復(fù)雜，包括細(xì)菌、病毒及非典型病原體等，幾種病原微生物可合并感染。明確感染病原有助藥物的合理使用，及早發(fā)現(xiàn)呼吸道傳染性疾病并采取措施。因此，快速準(zhǔn)確的病原體學(xué)診斷對于呼吸道感染性疾病的臨床診療及防控具有重要意義。核酸檢測方法因在不同的疾病期均具有較高的靈敏度和特異性，成為檢測呼吸道病原的主要技術(shù)方法[3]。本研究通過PCR-流式熒光雜交技術(shù)檢測病原體核酸，對615例呼吸道感染的患兒進(jìn)行病原學(xué)檢測，以了解本地區(qū)兒童常見呼吸道感染病原體的特點及流行趨勢，提高藥物的合理使用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 分析2022年1月至2022年12月期間在本院住院治療的呼吸道感染兒童呼吸道病原核酸檢測結(jié)果。所有納入研究的患兒疾病診斷均符合《實用兒科學(xué)》中ARI的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；年齡1月齡～13歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①院內(nèi)獲得性感染。②合并先天性心肺畸形及其他基礎(chǔ)疾?。庖吖δ艿拖隆⑵渌尾扛腥镜龋?。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有患兒在入院當(dāng)天采集咽拭子，標(biāo)本采用尼龍材質(zhì)植絨拭子采集，采集后置于含培養(yǎng)基采樣管中，24 h內(nèi)送檢。

1.2.2 檢測方法 用核酸提取試劑提取樣本DNA或RNA，提取完成后，使用PCR技術(shù)和多重微珠雜交技術(shù)，將待檢核酸與15項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒（RNA/DNA）混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物與微球雜交，加入顯色劑，上機(jī)檢測。

進(jìn)行RNA檢測的病原體為：流感病毒A（INF），流感病毒B（INF-B），副流感病毒（PIV），人偏肺病毒（hMPV）、鼻病毒（HRV）、呼吸道合胞病毒（RSV）。進(jìn)行 DNA 檢測的病原體為：博卡病毒（hBoV）、腺病毒（AdV）、肺炎支原體（MP）、卡他莫拉菌（MC）、流感嗜血桿菌（Hi）、肺炎鏈球菌（SP）、百日咳桿菌（BP）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）。

1.3 結(jié)局指標(biāo) 統(tǒng)計15種呼吸道病原體檢出率，分析不同年齡組、季節(jié)及疾病病原體分布情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般檢測情況 研究對象615例患兒中，男性344例，女性271例，年齡中位數(shù)4.2歲，最小年齡1月齡，最大年齡13歲?？傮w樣本中429例檢出陽性病原，陽性率69.8%，其中檢出單一病原體陽性患兒255例，占59.4%，檢出兩種以上病原體占40.6%，有1例患兒檢出5種病原體，分別是CMV、HRV、Hi、SP、MC 。15 種呼吸道病原體檢出中，檢出率排名前3位的病原體為EBV、CMV、HRV，檢出率最低的為hMPV、BP[5]。見表1。

2.2 主要病原體不同季節(jié)感染情況 春冬兩季仍是兒童呼吸道感染高發(fā)時期，其中INF具有明顯季節(jié)流行性，主要集中在春季，Hi及SP感染檢出率冬春較夏秋兩季高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而MP在夏秋兩季表現(xiàn)出一定的流行性，而檢出率較高的EBV、CMV、HRV四季度均無明顯差異。見表2。

表2 主要病原體不同季節(jié)感染情況[n（%）]

2.3 主要病原體年齡分布特點 不同年齡組的CMV、HRV、MP陽性檢出率差異顯著（P＜0.01）。EBV＜1歲年齡組陽性率最低，較其他組有顯著差異，其陽性率隨年齡升高而降低。而CMV、HRV則呈現(xiàn)與之相反的流行趨勢，隨年齡增長陽性率下降。RSV感染主要集中在學(xué)齡前兒童，而MP感染學(xué)齡期兒童陽性率最高。見表3。

表3 主要病原體年齡分布特點[n（%）]

3 討論

呼吸道感染是兒童最常見的疾病之一，呼吸道疾病更容易向肺部侵襲，引起多種并發(fā)癥的發(fā)生，正確識別呼吸道病原體對于診斷和治療十分重要。本研究采用PCR一流式熒光雜交技術(shù)，將PCR技術(shù)、多重微珠雜交技術(shù)及熒光檢測技術(shù)結(jié)合起來，具有高通量、高速度、低成本、靈敏度高等特點，已廣泛應(yīng)用于呼吸道病原體的檢測[6-7]。15項呼吸道病原體核酸檢測是針對呼吸道病原體設(shè)計PCR引物和雜交探針，特異性探針與微球進(jìn)行共價交聯(lián)，標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與微球雜交，可同時檢測多種病原體。

本研究檢測結(jié)果顯示，615例呼吸道標(biāo)本，陽性檢出率69.8%，具有較高的陽性檢測率，且多種病原體檢出率達(dá)10.4%，提示兒童呼吸道感染可存在多重感染的情況。上下呼吸道病原檢出情況也不盡相同，流感病毒住院表現(xiàn)為上呼吸道感染，而MP、MC下呼吸道檢出率明顯升高，主要表現(xiàn)為肺部感染。本研究發(fā)現(xiàn)引起呼吸道感染的常見細(xì)菌SP、MC也呈一定的季節(jié)流行性，春夏兩季檢出率高，MP的流行病學(xué)特征與其他報告一致[8]。

檢出病毒陽性率前3位依次為EBV、CMV、HRV。EBV在小于1歲年齡組檢出率較其他組明顯偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而CMV、HRV小于1歲年齡檢出率最高，后隨年齡增長陽性率下降。陽性率最高的EBV為19.2%，＜1歲年齡組陽性率最低，3～5歲年齡組陽性率最高[9]。EBV病毒是皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞病毒成員中的一員，DNA為其基因組，具有傳染性，且其主要宿主為人類，唾液為主要傳播途徑，主要傳播人群為幼兒，年齡段大約為3～5歲，具有較高的患病率，經(jīng)過統(tǒng)計顯示，大約有90%以上的幼兒曾感染過EB病毒。學(xué)齡前組EBV陽性檢出率高，可能由于該年齡組幼兒免疫系統(tǒng)相對不成熟、常處于幼托機(jī)構(gòu)等人員密集場所而交叉感染有關(guān)，免疫力隨著年齡的增長而提高，大于6歲的學(xué)齡期組的陽性率有所下降。EBV是一種廣泛傳播的皰疹病毒，90%～95%的成人為EBV血清陽性[10]，主要通過密切接觸傳播，大多數(shù)原發(fā)性EBV感染大多起源于口咽，早期的EBV感染主要表現(xiàn)為鼻塞、流涕、咽痛、發(fā)熱、全身無力、食欲減退等上呼吸道感染或消化道的癥狀，年齡越小癥狀越不典型，可引起包括中耳炎、腹瀉、上呼吸道感染和傳染性單核細(xì)胞增多癥等。但大部分小嬰兒和兒童中初次EBV感染常見且通常無癥狀，表現(xiàn)為亞臨床、隱性感染。健康人群的口咽部也攜帶有EBV，咽拭子檢測會造成檢測準(zhǔn)確性障礙，因而臨床一般不采用此方法，常用血清學(xué)檢測方法，故EBV是定值還是引起疾病的病原，需進(jìn)一分析。CMV是巨細(xì)胞病毒病，因細(xì)胞在收到該病毒感染后可呈巨細(xì)胞化，胞質(zhì)、胞核內(nèi)可充分顯示包涵體，該細(xì)胞在臨床中又被成為巨細(xì)胞包涵體病，該病毒上甚至可引發(fā)全身性感染的發(fā)生，該病毒屬于皰疹病毒科β亞科中的一員，是人皰疹病毒科最大、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的病毒，在免疫功能正常的宿主很少引起呼吸道感染[11]，陽性檢出患兒主要考慮定值，與既往報道CMV特異性抗體的流行率隨年齡增加而不同[12]。一方面此次研究對象年齡偏小、樣本量少，不能代表整個人群的流行趨勢，而CMV感染在人群中很常見，全球育齡女性中CMV血清陽性率為86%[13]，新生兒可通過分娩或母乳感染病毒后定值，隨著免疫功能完善而有一定的免疫清除，但伴隨年齡的增長，社會面的接觸越廣，獲得隱性感染的概率增加，具體意義及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。輪狀病毒（HRV）是引起嬰幼兒腹瀉的主要病毒之一，是一種雙鏈核糖核酸病毒，屬于呼吸腸孤病毒科，統(tǒng)計顯示，幾乎所有嬰兒在出生1年后均會經(jīng)歷至少1次的HRV感染，每感染一次，患者機(jī)體的免疫力就會相應(yīng)增強(qiáng)一次，后續(xù)的感染力則會逐漸降低，HRV在＜1歲年齡組陽性率達(dá)23.8%，較其他年齡組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，是該年齡組重要的病原體。HRV的主要傳播途徑為糞口傳播，主要感染部位為小腸連結(jié)的腸黏膜細(xì)胞，可導(dǎo)致患兒出現(xiàn)胃腸炎、嚴(yán)重的腹瀉，若患兒未獲得及時有效的治療干預(yù)，則可能會因脫水而導(dǎo)致死亡[14]，部分HRV感染后主要表現(xiàn)為普通感冒癥狀，可引起喘息和哮喘急性加重[15]，引起嬰幼兒的支氣管炎和毛細(xì)支氣管炎。百日咳桿菌（BP）是患兒單種病毒患病率最低的病毒，屬鮑特氏菌屬，具有傳染性，飛沫傳播為主要傳播途徑，雖然患兒患病率相對較低，但仍然不可忽視，1歲以下兒童感染若未得到有效治療干預(yù)，仍然具有較強(qiáng)的病死率。

綜上所述，15項呼吸道病原體核酸檢測技術(shù)可同時檢測多種病原體，操作簡便、敏感性高，可用于輔助兒童呼吸道感染的病原學(xué)診斷，但對于部分陽性結(jié)果的解讀，需要根據(jù)臨床特點及流行特征來判斷是否屬于感染病原，然后對于感染病原體采取合理的用藥治療。