王斌功 許海濤 葛鳳梅 馮曉曦 郭海斌 張軍剛

（1.上蔡縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 河南上蔡 463800；2.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/河南省玉米產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系駐馬店綜合試驗(yàn)站 河南駐馬店 463000）

玉米（Zea maysL.）屬一年生禾本科大型草本植物，雌雄同株異花授粉，是利用雜種優(yōu)勢(shì)的典型作物，是我國(guó)重要的谷物農(nóng)作物之一[1-2]。花粉為玉米自交系雄穗的配子體，決定親本遺傳信息的傳遞。花粉具有萌發(fā)、存活與發(fā)育的能力，是花絲能否正常授粉受精與結(jié)實(shí)的重要因子，受外界環(huán)境因素及自身遺傳性能的影響[3]?；ǚ垲w粒干燥、表面光滑、體輕細(xì)小，數(shù)量極多，易于吹飄到特定高度和一定距離，適宜依靠自然風(fēng)媒進(jìn)行傳播。玉米自交系花粉飄落至花絲使其接受花粉并且完成受精過(guò)程，其本質(zhì)也是遺傳物質(zhì)再重組的過(guò)程，同時(shí)通過(guò)有性生殖保存了玉米自交系的稀有資源并進(jìn)一步創(chuàng)新利用[4]。研究表明，轉(zhuǎn)基因玉米可通過(guò)花粉把其外源基因輸送到非轉(zhuǎn)基因玉米以及野生近緣種內(nèi)，玉米自交系花粉活性與離體后存活能力的高低決定了其外源基因的漂移距離[5]。

多數(shù)研究者通常認(rèn)為，溫度和空氣相對(duì)濕度顯著影響花粉活性，溫度高于32～35℃時(shí)，花粉活性急劇喪失，超過(guò)38℃抑制玉米花粉萌發(fā)，花粉粒變形皺縮，花藥壁增厚，開(kāi)裂困難，散粉量嚴(yán)重減少，活性顯著降低[6-7]。田間平均氣溫20～26℃、相對(duì)濕度66%～86%時(shí)花粉6 h內(nèi)可維持較強(qiáng)活性[8]。宋方威等[9]報(bào)道高溫使自交系花粉生活力顯著下降，35℃保存6 h、40℃保存4 h之后，其生活力完全喪失。降志兵等[10]通過(guò)溫度、保存時(shí)間及其互作效應(yīng)研究了玉米花粉活力的變化，影響達(dá)極顯著水平，38℃保存1 h花粉生活力則顯著下降。玉米自交系雄穗小花受精率與結(jié)實(shí)率隨氣溫增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，極端高溫對(duì)花粉活性危害極大。低溫可延長(zhǎng)玉米自交系離體花粉活性，但適宜貯存溫度有特定的范圍，不是溫度越低活性越高。任轉(zhuǎn)灘等[11]研究認(rèn)為，0～5℃環(huán)境下持續(xù)10 h花粉仍具有授粉受精能力，超過(guò)24 h不能完成正常受精作用，田間結(jié)實(shí)為0，5～10℃環(huán)境下花粉生活力可持續(xù)5 d。張紅梅等[4]研究表明，低溫儲(chǔ)存能夠顯著延長(zhǎng)離體花粉生活力，4℃儲(chǔ)存32 h、24℃儲(chǔ)存8 h、-20℃儲(chǔ)存56 h，離體花粉生活力可達(dá)90%以上。也有文獻(xiàn)報(bào)道[12]，溫度-10℃、相對(duì)濕度80%條件下貯藏，花粉水分維持在6%～8%，150 d之后，離體花粉仍具有5%～8%的萌發(fā)率。

前人多圍繞在中國(guó)大陸生態(tài)區(qū)域進(jìn)行溫度、相對(duì)濕度對(duì)玉米花粉活性的相關(guān)研究[2,5-6,11]，有關(guān)海南熱帶生態(tài)區(qū)玉米自交系離體花粉活性方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。海南南繁加代已成為我國(guó)玉米育種過(guò)程中不可或缺的工作，在海南三亞、陵水、南濱、崖州、梅山、九所、山腳、利國(guó)、樂(lè)羅、黃流等地進(jìn)行玉米自交系繁殖、自交系材料加代、雜交制種、資源保存與創(chuàng)新利用已成常年不變的任務(wù)，玉米自交系花粉活性的高低與玉米南繁任務(wù)的成敗密切相關(guān)，但至今鮮有海南熱帶區(qū)南繁玉米自交系離體花粉活性方面的相關(guān)研究。本研究旨在探索不類型玉米自交系不同溫度保存條件下，離體花粉活性的變化規(guī)律，明確離體花粉活性持續(xù)時(shí)間，研究不同類型玉米自交系間離體花粉活性的差異，以期為海南熱帶生態(tài)區(qū)玉米自交系離體花粉活性研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材供試6個(gè)玉米自交系材料分別為ZM4321、駐136、駐54、ZM3358、H1269、ZM027，分別代表玉米自交系四大類群中的Reid類和Lancaster類，均為駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所選育。其中ZM4321、駐136、ZM027屬于Reid類群，遺傳基礎(chǔ)豐富，抗病抗倒，植株葉片緊湊，果穗長(zhǎng)，穗粗，配合力高；駐54、ZM3358、H1269屬于Lancaster類群，植株較高，抗病性強(qiáng)，籽粒深，適應(yīng)性廣，制種產(chǎn)量高。

1.1.2 供試肥料供試肥料為貴州諾威施生物工程有限公司生產(chǎn)的西洋復(fù)合肥（總養(yǎng)分含量≥48%，N:P2O5:K2O=16:16:16）、河北正元?dú)淠芸萍加邢薰旧a(chǎn)的尿素（N，46%N）。

1.1.3 試驗(yàn)地概況2020年11月至2021年3月、2021年11月至2022年3月兩年試驗(yàn)安排于海南省樂(lè)東黎族自治縣九所鎮(zhèn)南繁基地（北緯18°26′41″，東經(jīng)108°57′ 38″），海拔高度為36 m。試驗(yàn)區(qū)地處海南島西南地帶，熱帶型季風(fēng)性氣候，冬春試驗(yàn)期間常年干旱而且降雨極少，熱量資源豐富，光照充足，供試土壤的質(zhì)地為砂壤，砂質(zhì)含量為68.20%。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)按照當(dāng)?shù)氐姆N植習(xí)慣，采用壟作栽培方式，利于灌水且防風(fēng)蝕，可增加耕作層。機(jī)械旋耕后用牛工作壟，用牛先犁開(kāi)1溝，復(fù)合肥（375 kg/hm2）作為基肥集中撒施溝底，從溝兩邊同溝內(nèi)各翻1犁堆成壟，釘耙平整壟平，壟間距60 cm，壟高20 cm，種子播種于壟面中間。2020年11月12日人工點(diǎn)播，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，行長(zhǎng)6 m，行距60 cm，10行區(qū)，南北行向，小區(qū)面積為36 m2，周圍均設(shè)保護(hù)行。11月14日噴灌水，12月1日定苗，小區(qū)密度7.5×104株/hm2。12月10日追施尿素125 kg/hm2，12月18日追施復(fù)合肥500 kg/hm2。生長(zhǎng)發(fā)育期間以澆水為主，病蟲(chóng)草害防治管理與當(dāng)?shù)厣a(chǎn)一致。2021年3月19日成熟收獲。

2021年11月15日人工點(diǎn)播，11月16日噴灌水，11月28日定苗，小區(qū)密度7.5×104株/hm2。12月4日追施尿素125 kg/hm2，12月11日追施復(fù)合肥500 kg/hm2。生長(zhǎng)發(fā)育期間以澆水為主，病蟲(chóng)草害防治管理與當(dāng)?shù)厣a(chǎn)一致。2022年3月12日成熟收獲。

1.2.2 離體花粉活性測(cè)定各處理吐絲前用羊皮紙袋全部套取雌穗，散粉旺盛期不同自交系于9:00—10:00用羊皮紙袋采集花粉。每袋花粉量確保3株雌穗花絲飽和授粉，每處理花粉各收集16袋，分別放置于室內(nèi)自然氣候（室內(nèi)溫度）、海爾BCD-206STPQ冰箱冷藏室（4℃）及軟冷凍室（-7℃）儲(chǔ)存，第1天儲(chǔ)存每隔1 h各取1袋，對(duì)生育進(jìn)程基本一致，吐絲3～4 d活力正值旺盛時(shí)期的雌穗進(jìn)行田間飽和授粉，每袋花粉授粉3株，授粉后立即套取羊皮紙袋，防止田間花粉飄落花絲上，大頭針固定防止紙袋脫落，吊牌標(biāo)注授粉時(shí)間，直至12 h結(jié)束；第2天累計(jì)貯存24和30 h、第3天累計(jì)貯存48和54 h時(shí)各處理分別進(jìn)行田間飽和授粉，操作同第1天，即采新鮮花粉作為對(duì)照花粉，采集花粉后立即田間飽和授粉3株作為對(duì)照雌穗。成熟收獲后調(diào)查各處理穗粒數(shù)。通常用試驗(yàn)田間的結(jié)實(shí)率來(lái)反映離體花粉活性的高低[4]。

結(jié)實(shí)率=（平均穗粒數(shù)/對(duì)照平均穗粒數(shù)）×100%

采用王艷哲等[13]TTC染色法測(cè)定離體花粉?；钚裕刻幚砣?.2 g花粉放于潔凈干燥的載玻片表面，滴加0.5%TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液2滴，置于放有吸水濾紙可保濕的種子萌發(fā)盒內(nèi)，35℃恒溫箱內(nèi)培育15 min，每處理2張載玻片；每片選取視野5個(gè)，統(tǒng)計(jì)染色離體花粉數(shù)，計(jì)算染色率，具有活性的花粉粒染色后呈紅色，淡紅色活性較弱，失去活性的花粉粒染色后呈現(xiàn)無(wú)色，因此染色率可反映離體花粉的活性。

花粉生活力（TTC染色率）=染色花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)×100%

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析采用Sigmaplot 14對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4℃儲(chǔ)存條件下玉米自交系離體花粉活性變化

由圖1可知，不同基因型玉米自交系4℃貯存8 h內(nèi)結(jié)實(shí)籽粒數(shù)較多，結(jié)實(shí)率10 h后明顯下降，24 h后結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率顯著降低。ZM4321、H1269離體花粉高活性持續(xù)期最長(zhǎng)，24 h結(jié)實(shí)籽粒數(shù)維持在200粒左右，結(jié)實(shí)率50%以上，54 h結(jié)實(shí)率10%以上，離體花粉活性遠(yuǎn)大于駐136、駐54、ZM3358。駐136結(jié)實(shí)籽粒數(shù)主要集中在10 h內(nèi)，10 h后結(jié)實(shí)籽粒數(shù)急劇降低，結(jié)實(shí)率基本5%以下，48～54 h結(jié)實(shí)籽粒趨為0，離體花粉活性喪失。駐54、ZM3358離體花粉活性基本相同，結(jié)實(shí)籽粒數(shù)主要集中在8 h內(nèi)，駐54結(jié)實(shí)率在35%以上，ZM3358結(jié)實(shí)率最低，均在35%以下，24 h后二者結(jié)實(shí)籽粒數(shù)在10粒以下，結(jié)實(shí)率4%以下，離體花粉活性喪失殆盡。ZM027離體花粉活性維持時(shí)間略低于ZM4321、H1269，12 h內(nèi)結(jié)實(shí)籽粒數(shù)保持在100粒以上，48 h仍有將近20%的結(jié)實(shí)率，54 h結(jié)實(shí)率仍在10%以上。表明不同Reid類和Lancaster類自交系間的離體花粉活性變化規(guī)律存在一定差異，但總體變化趨勢(shì)基本一致，即在4℃貯存條件下結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明離體花粉活力隨著4℃貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

圖1 玉米自交系離體花粉4℃貯存活性變化

2.2 -7℃儲(chǔ)存條件下玉米自交系離體花粉活性變化

由圖2可知，ZM3358離體花粉對(duì)-7℃冷凍貯存條件極度敏感，花粉耐受性極低，離體花粉高活性維持時(shí)間最短，貯存1 h結(jié)實(shí)籽粒數(shù)超過(guò)240粒、結(jié)實(shí)率超過(guò)85%；2 h開(kāi)始結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率急劇下降，籽粒數(shù)不超過(guò)5粒，幾乎絕收，結(jié)實(shí)率在3%以下，離體花粉活性持續(xù)時(shí)間顯著低于ZM4321、駐136、駐54、H1269、ZM027。-7℃貯存條件下，ZM4321、駐136、駐54、H1269、ZM027離體花粉活性變化總體趨勢(shì)基本一致。ZM4321、H1269、ZM027離體花粉高活性維持時(shí)間最長(zhǎng)，明顯高于駐136、駐54。12 h內(nèi)ZM4321、H1269、ZM027結(jié)實(shí)籽粒率在130粒以上，ZM4321、H1269結(jié)實(shí)率在55%以上，ZM027結(jié)實(shí)率在40%以上；24～30 h內(nèi)結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率急劇降低，48～54 h內(nèi)ZM4321、H1269、ZM027結(jié)實(shí)籽粒數(shù)下降到4粒以下，結(jié)實(shí)率不超2%。駐136、駐54離體花粉高活性維持時(shí)間分別為10 h、8 h，駐136在12～24 h結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率顯著降低，30 h仍有6%左右結(jié)實(shí)率，48～54 h內(nèi)結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率幾乎為0。說(shuō)明在-7℃貯存條件下，自交系的結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率隨貯存時(shí)間的增加呈降低趨勢(shì)，但Reid類和Lancaster類自交系間的籽粒結(jié)實(shí)時(shí)間差異達(dá)到極顯著水平。

圖2 玉米自交系離體花粉-7℃貯存活性變化

2.3 室溫儲(chǔ)存條件下玉米自交系離體花粉活性變化

離體花粉室溫貯存是玉米雜交制種因父本散粉早，母本吐絲晚造成花期不遇，需要采取人工輔助授粉時(shí)，提前收取花粉保存并延長(zhǎng)離體花粉活性最直接有效的方法。由圖3可知，室溫貯存條件下，ZM4321、H1269的離體花粉高活性維持時(shí)間最長(zhǎng)，為30 h，遠(yuǎn)大于駐136、駐54、ZM3358、ZM027，30 h內(nèi)ZM4321、H1269結(jié)實(shí)籽粒數(shù)在100粒以上，結(jié)實(shí)率在30%以上，48 h后結(jié)實(shí)籽粒數(shù)急劇降至10粒以下，結(jié)實(shí)率降至3%以下。ZM3358、ZM027的離體花粉高活性維持時(shí)間為10～11 h，11 h后ZM027結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率下降幅度遠(yuǎn)大于ZM3358，48 h后二者結(jié)實(shí)籽粒數(shù)維持在10粒左右，54 h時(shí)ZM027完全喪失活性，結(jié)實(shí)率為0。駐54的離體花粉高活性維持時(shí)間最短為3 h，結(jié)實(shí)籽粒數(shù)超過(guò)100粒，而駐136則維持在8 h內(nèi)，駐54于4 h后結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率急劇下降后平緩降至30 h，48～54 h接近完全喪失活性，而駐136于12 h后活性幾乎喪失殆盡。說(shuō)明室溫貯存條件下，自交系離體花粉高活性隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，且Reid類和Lancaster類自交系間的離體花粉高活性維持時(shí)間存在一定差異。

2.4 不同基因型玉米自交系離體花粉活性變化

由圖4可知，2020年ZM4321離體花粉活性4℃貯存>室溫貯存>-7℃貯存，4℃貯存24 h結(jié)實(shí)率為58.84%，30 h后結(jié)實(shí)率下降，至54 h結(jié)實(shí)率仍有20.47%-7℃、室溫貯存12 h結(jié)實(shí)率分別為63.72%、56.89%，但48 h后二者急劇降低，54 h離體花粉活性接近于0。駐136離體花粉活性與ZM4321結(jié)果相反，其離體花粉活性-7℃貯存>室溫貯存>4℃貯存，花粉高結(jié)實(shí)率集中時(shí)間較ZM4321大幅縮短，-7℃貯存30 h、室溫貯存12 h、4℃貯存11 h之后其離體花粉活性幾乎完全喪失，結(jié)實(shí)率趨近于0。駐54的離體花粉活性-7℃貯存>4℃貯存＞室溫貯存，花粉高結(jié)實(shí)率分別集中7、6、3 h內(nèi)，30 h后活力基本消失。ZM3358在3種溫度貯存條件下離體花粉活性達(dá)極顯著水平，室溫貯存>4℃貯存>-7℃貯存，-7℃貯存1 h結(jié)實(shí)率最高，2 h始結(jié)實(shí)率幾乎斷崖式下降，離體花粉失去活性，室溫貯存結(jié)實(shí)率遠(yuǎn)大于4℃貯存。H1269、ZM027在3種溫度貯存條件下離體花粉活性差異不大，H1269分別在-7℃、室溫、4℃貯存12 h、ZM027分別在-7℃、室溫、4℃貯存10 h結(jié)實(shí)率較高，離體花粉活性持續(xù)時(shí)間均表現(xiàn)出4℃貯存最長(zhǎng)。

圖4 2020年不同類型玉米自交系離體花粉活性變化

由圖5可知，2021年ZM4321離體花粉活性4℃貯存＞室溫貯存＞-7℃貯存，4℃貯存24 h結(jié)實(shí)率為57.91%，30 h后結(jié)實(shí)率下降，至54 h結(jié)實(shí)率仍有24.10%，-7℃、室溫貯存12 h結(jié)實(shí)率分別為70.25%、64.37%，但48 h后二者急劇降低，54 h離體花粉活性接近于0。駐136離體花粉活性-7℃貯存＞室溫貯存＞4℃貯存，花粉高結(jié)實(shí)率集中時(shí)間較ZM4321大幅縮短，-7℃貯存24 h、室溫貯存11 h、4℃貯存10 h之后其離體花粉活性幾乎完全喪失，結(jié)實(shí)率趨近于0。駐54的離體花粉活性-7℃貯存>4℃貯存＞室溫貯存，花粉高結(jié)實(shí)率分別集中8、9、3 h內(nèi)，30 h后活力基本消失。ZM3358在3種溫度貯存條件下離體花粉活性達(dá)極顯著水平，室溫貯存＞4℃貯存＞-7℃貯存，-7℃貯存1 h結(jié)實(shí)率最高，2 h始結(jié)實(shí)率幾乎斷崖式下降，離體花粉失去活性，室溫貯存結(jié)實(shí)率遠(yuǎn)大于4℃貯存。H1269、ZM027在 3種溫度貯存條件下離體花粉活性差異不大，H1269分別在室溫、4℃貯存30 h、-7℃貯存24 h，ZM027分別在4℃貯存48 h、-7℃、室溫貯存24 h結(jié)實(shí)率較高，離體花粉活性持續(xù)時(shí)間均表現(xiàn)出4℃貯存最長(zhǎng)。

圖5 2021年不同類型玉米自交系離體花粉活性變化

兩年數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)一致，均表明3種溫度貯存條件下Reid類和Lancaster類自交系離體花粉活性變化規(guī)律不同，但均隨貯存時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)，而不同貯存時(shí)間之間存在顯著差異（表1）。也就是說(shuō)，離體花粉活性既受貯存溫度高低影響，又受貯存時(shí)間長(zhǎng)短影響。

表1 結(jié)實(shí)率主體間的效應(yīng)檢驗(yàn)

2.5 玉米自交系離體花粉貯存溫度和時(shí)間與其活性相關(guān)性分析

對(duì)6個(gè)玉米自交系離體花粉不同溫度條件下貯存時(shí)間與其授粉后平均結(jié)實(shí)率模型擬合分析（圖6），6個(gè)自交系4℃貯存條件下貯存時(shí)間與結(jié)實(shí)率擬合方程2020年y=0.010 1x2-1.538 3x+60.905 0，R2=0.983 8；2021年y=0.015 3x2-1.788 1x+60.984 4，決定系數(shù)R2=0.982 7，回歸系數(shù)b均小于0，呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。-7℃貯存條件下貯存時(shí)間與結(jié)實(shí)率擬合方程為2020年y=0.023 3x2-2.386 7x+61.342 2，R2=0.955 7；2021年y= 0.024 6x2-2.403 7x+59.001 7，決定系數(shù)R2=0.949 2，回歸系數(shù)b均小于0，呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。室溫貯存條件下貯存時(shí)間與結(jié)實(shí)率擬合方程2020年y=0.021 2x2-2.365 6x+66.416 4，R2=0.955 7；2021年y=0.023 9x2-2.504 1x+6.536 8，決定系數(shù)R2=0.976 3，回歸系數(shù)b均小于0，呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。兩年試驗(yàn)數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)一致，結(jié)果表明，4、-7℃、室溫貯存條件下，Reid類和Lancaster類自交系離體花粉活性與貯存時(shí)間呈二項(xiàng)式方程關(guān)系。

圖6 玉米自交系離體花粉貯存溫度和時(shí)間與結(jié)實(shí)率相關(guān)性分析

2.6 玉米自交系離體花粉TTC染色率變化

TTC染色率也可表示玉米自交系離體花粉的活性[10]。由圖7可知，2020年ZM4321離體花粉4℃貯存、-7℃、室溫貯存12 h內(nèi)TTC染色率均超過(guò)60%，12 h后TTC染色率4℃>室溫＞-7℃貯存，貯存30 h時(shí)，4℃離體花粉TTC染色率仍有51.39%，室溫貯存TTC染色率降至33.90%，-7℃貯存TTC染色率降至10.09%；54 h時(shí)，-7℃貯存、室溫貯存TTC染色率不足2%。駐136離體花粉貯存3 h時(shí)，其離體花粉TTC染色率4℃貯存、-7℃貯存明顯大于室溫貯存，10 h后離體花粉TTC染色率均顯著降低，TTC高染色率集中時(shí)間較ZM4321大幅縮短。駐54離體花粉TTC染色率-7℃貯存＞4℃貯存＞室溫貯存，離體花粉TTC高染色率分別集中在7、8、3 h內(nèi)，24 h后TTC染色率明顯降低。ZM3358離體花粉對(duì)低溫極其敏感，離體花粉TTC染色率室溫貯存>4℃貯存＞-7℃貯存，-7℃貯存1 h TTC染色率最高為89.66%，2 h始TTC染色率呈斷崖式降低至5%以下，24 h即降為0；4℃貯存TTC染色率均低于40%，顯著低于室溫貯存，室溫貯存11 h TTC染色率仍在50%以上。H1269、ZM027在3種溫度貯存條件下離體花粉TTC染色率差異不大，H1269分別在-7℃、室溫、4℃貯存12 h，ZM027分別在-7℃、室溫、4℃貯存10 h TTC染色率較高，離體花粉活性持續(xù)時(shí)間均表現(xiàn)出4℃貯存最長(zhǎng)。

圖7 2020年不同類型玉米自交系離體花粉TTC染色率變化

由圖8可知，2021年ZM4321離體花粉4℃貯存、-7℃、室溫貯存12 h內(nèi)TTC染色率均超過(guò)50%，12 h后離體花粉TTC染色率4℃貯存＞室溫貯存＞-7℃貯存；30 h時(shí)，4℃貯存離體花粉TTC染色率仍有30.07%，室溫貯存TTC染色率降至35.29%，-7℃貯存TTC染色率降至12.89%，54 h時(shí)，-7℃貯存、室溫貯存TTC染色率不足3%。駐136離體花粉貯存3 h時(shí)，其離體花粉TTC染色率4℃貯存、-7℃貯存明顯大于室溫貯存，10 h后4℃貯存、-7℃貯存離體花粉TTC染色率顯著降低，室溫貯存5 h后TTC染色率明顯下降，高染色率集中時(shí)間較ZM4321大幅縮短。駐54離體花粉TTC染色率-7℃貯存>4℃貯存>室溫貯存，離體花粉TTC高染色率分別集中在8、9、3 h內(nèi)，24 h后TTC染色率明顯降低。ZM3358離體花粉對(duì)低溫極其敏感，離體花粉TTC染色率室溫貯存＞4℃貯存>-7℃貯存，-7℃貯存1 hTTC染色率最高，為85.91%，2 h始TTC染色率呈斷崖式降低至3%以下，24 h后即降為0，4℃貯存TTC染色率均低于40%，顯著低于室溫貯存。H1269、ZM027在3種溫度貯存條件下離體花粉TTC染色率差異不大，H1269分別在-7℃、室溫、4℃貯存12 h、ZM027分別在-7℃、室溫、4℃貯存10 h TTC染色率較高，離體花粉活性持續(xù)時(shí)間均表現(xiàn)出4℃貯存最長(zhǎng)。

圖8 2021年不同類型玉米自交系離體花粉TTC染色率變化

兩年數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)基本一致，均表明 3種溫度貯存條件下Reid類和Lancaster類自交系離體花粉TTC染色率變化規(guī)律不同，但均隨貯存時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)，而不同貯存時(shí)間之間存在顯著差異（表2）。也就是說(shuō)，離體花粉TTC染色率既受貯存溫度高低的影響，又受貯存時(shí)間長(zhǎng)短的影響。

表2 TTC染色率主體間的效應(yīng)檢驗(yàn)

3 討論與結(jié)論

前人發(fā)現(xiàn)，玉米雄穗耐熱性與散粉特性不同基因型間存在差異[14]，自交系間花粉活性差異明顯。侯有良等[15]指出，常溫短時(shí)保存的自交系花粉其活性差異未達(dá)顯著水平，而保存4～6 h花粉授粉受精后自交系3259、W314結(jié)實(shí)率顯著低于Q318，花粉活性衰退自交系間存在差異，這與本研究所用6個(gè)自交系因不同基因來(lái)源導(dǎo)致其受熱性差異顯著的結(jié)果一致。也有學(xué)者[4]認(rèn)為，溫度是離體花粉活性維持時(shí)間長(zhǎng)短的決定因素。

張紅梅等[4]報(bào)道離體花粉4℃（冰箱冷藏）其生活力可保持4 d；王霞等[2]研究表明，在4℃貯存5d結(jié)實(shí)率平均近30%，這與本研究結(jié)論不同。這可能是供試材料及所處環(huán)境不同所致。本試驗(yàn)4℃貯存8 h內(nèi)結(jié)實(shí)籽粒數(shù)較多，結(jié)實(shí)率10 h后明顯降低，24 h后結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率顯著降低，不同自交系間差異顯著；ZM4321、H1269離體花粉高活性持續(xù)期最長(zhǎng)，24 h結(jié)實(shí)籽粒數(shù)維持200粒左右，結(jié)實(shí)率50%以上，55 h仍維持50粒以上，結(jié)實(shí)率15%以上；駐136結(jié)實(shí)籽粒數(shù)主要集中在10 h內(nèi)，10 h后結(jié)實(shí)籽粒數(shù)急劇降低，48～54 h結(jié)實(shí)籽粒基本為0；駐54、ZM3358離體花粉活性基本相同，結(jié)實(shí)籽粒數(shù)主要集中在8 h內(nèi)；ZM027 12 h內(nèi)結(jié)實(shí)籽粒數(shù)保持100粒以上，48 h仍有20%左右結(jié)實(shí)率，54 h結(jié)實(shí)率在5%左右。

有研究[4]發(fā)現(xiàn)，低溫顯著延長(zhǎng)玉米離體花粉的活性，-20℃貯存3 d的離體花粉可保持90%以上的生活力。也有相關(guān)文獻(xiàn)[2]報(bào)道，-20℃貯存5 d的玉米離體花粉仍有40.71%結(jié)實(shí)率，-20℃貯存1 0d結(jié)實(shí)率還有7.92%。本研究結(jié)果表明，不同類型自交系間集中結(jié)實(shí)時(shí)間差異達(dá)極顯著水平，ZM3358離體花粉對(duì)-7℃冷凍貯存條件極度敏感，花粉耐受性極低，離體花粉高活性維持時(shí)間最短，貯存1 h結(jié)實(shí)籽粒數(shù)超過(guò)240粒、結(jié)實(shí)率超過(guò)85%，2 h開(kāi)始結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率急劇下降，籽粒數(shù)不超過(guò)5粒，幾乎絕收；ZM4321、H1269、ZM027離體花粉高活性維持時(shí)間最長(zhǎng)，12 h內(nèi)ZM4321、H1269、ZM027結(jié)實(shí)籽粒率在130粒以上，24～30 h內(nèi)結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率急劇降低，48～54 h內(nèi)結(jié)實(shí)籽粒數(shù)下降到4粒以下，結(jié)實(shí)率幾乎不到1%。駐136、駐54離體花粉高活性維持時(shí)間分別為10、8 h，駐136在12～24 h結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率顯著降低，30 h仍有6%左右結(jié)實(shí)率，48～54 h內(nèi)結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率幾乎為0。這與幸亨泰[12]在-10℃貯存溫度、80%相對(duì)濕度、6%～8%花粉水分條件下冷凍保存150 d離體花粉萌發(fā)能力仍達(dá)5%～8%的結(jié)果不盡一致。

本研究結(jié)果表明，ZM4321、H1269室溫貯存條件下離體花粉高活性維持時(shí)間最長(zhǎng)，為30 h；ZM3358、ZM027室溫貯存條件下離體花粉高活性維持時(shí)間為10～11 h；駐54室溫貯存條件下離體花粉高活性維持時(shí)間最短，為3 h；駐136則維持在8 h內(nèi)；駐54于4 h后結(jié)實(shí)籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率急劇下降后平緩降至30 h，48～54 h接近完全喪失活性；而駐136于12 h后活性幾乎喪失殆盡。自交系間由于對(duì)溫度的敏感性不同離體花粉活性有所不同，這與前人研究結(jié)果類似。侯有良等[14]研究表明，花粉常溫貯存26 h存活率為1.2%～3.4%；張紅梅等[4]發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)常溫貯存8 h玉米離體花粉活性沒(méi)有出現(xiàn)顯著衰退，24℃室溫貯存活性可維持4 d；任轉(zhuǎn)灘等[11]則認(rèn)為，24℃常溫環(huán)境下離體花粉活性只維持8 h，前人研究材料可能由于熱受性存在差異，導(dǎo)致研究結(jié)果存在差異。

本研究結(jié)果也顯示，4℃貯存更有利于ZM4321離體花粉活性的保持，-7℃貯存更有利于駐136、駐54離體花粉活性的維持，ZM3358只適應(yīng)室溫條件貯存，H1269、ZM027不同溫度貯存條件下離體花粉活性差異不大。這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2,4,15]存在一定差異，與試驗(yàn)所處生態(tài)環(huán)境，供試材料基因型差異所致。本文通過(guò)測(cè)定田間結(jié)實(shí)率評(píng)價(jià)不同溫度貯存條件下離體花粉活性的變化，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)離體花粉活性影響的內(nèi)部機(jī)制進(jìn)行研究。

本研究表明，不同類型玉米自交系離體花粉不同溫度條件下隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)其TTC染色率的變化與田間結(jié)實(shí)率基本一致，均表明3種溫度貯存條件下不同自交系離體花粉TTC染色率變化規(guī)律不同，但均隨貯存時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)，由于基因型差異其持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短有所不同。隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度處理之間離體花粉TTC染色率差異顯著，TTC染色率降低，離體花粉活性下降，進(jìn)而降低田間結(jié)實(shí)率。