胡金龍 秦晗 張勇 鄧晴

(南京醫(yī)科大學連云港臨床醫(yī)學院口腔科,江蘇 連云港 222002)

口腔鱗狀細胞癌約占全身惡性腫瘤的3%[1],而牙齦是口腔鱗狀細胞癌的最常發(fā)生部位之一,占口腔鱗狀細胞癌的10%～25%[2]。目前,基因治療是廣為研究的癌癥治療新方向,其能夠在分子水平改變細胞的基因表達,從而使細胞獲得新的遺傳表型,實現(xiàn)精準、個性化的癌癥治療[3]。成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)是轉(zhuǎn)錄因子Runx家族中的一員,Runx轉(zhuǎn)錄因子家族在不同的組織和細胞譜系中發(fā)揮著重要作用,其中Runx2是胚胎期間骨骼發(fā)育和其他器官如乳腺和前列腺形態(tài)發(fā)生過程中的必需轉(zhuǎn)錄因子[4]。相關研究表明Runx2在Ⅱ型糖尿病腎病、骨質(zhì)疏松等疾病中起重要的調(diào)控作用[5-6]。Runx2同樣參與惡性腫瘤的生物學行為,與乳腺癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等多種惡性腫瘤的進展聯(lián)系緊密[7-8]。然而Runx2在牙齦癌中的作用鮮有報道,在牙齦癌中的不同時空表達水平及調(diào)控機制仍未明確。本實驗利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染GNM細胞,獲得穩(wěn)定沉默Runx2基因的GNM細胞,為進一步探討其在牙齦癌中的作用及其分子機制提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 胎牛血清(澳洲Ausbian公司),基礎培養(yǎng)基和DPBS(美國Corning公司),兔抗人Runx2抗體、兔抗及鼠抗IgG抗體(美國CST公司),鼠抗人β-actin抗體(美國SANTA CRUZ公司),胰酶(美國GIBCO公司),Trizol(上海普飛生物技術有限公司),M-MLV(美國promega公司),oligo dT(上海生工生物工程技術服務有限公司),BCA Protein Assay Kit(上海碧云天生物技術有限公司),RIPA 裂解液(上海鼎國生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染目的細胞 人上頜牙齦癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細胞系GNM細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供)凍存管從液氮罐中取出,解凍后1300 rpm離心3 min,消毒后移至生物安全柜。取出凍存管吸除凍存液上清,加入1 mL完全培養(yǎng)基進行重懸細胞,細胞懸液接種至含有3 mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,輕晃勻后將其放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每過24 h進行1次培養(yǎng)液更換,細胞匯合度達80%左右再做傳代培養(yǎng)。用含HiTransG P的轉(zhuǎn)染液將完全培養(yǎng)基制成(3～5)×104個mL-1細胞懸液,隨之接種細胞懸液到培養(yǎng)板,直至細胞達到15%～30%鋪板量左右。鋪板后無需培養(yǎng),病毒按MOI=10進行轉(zhuǎn)染。將各孔中轉(zhuǎn)染16 h后的細胞收集起來轉(zhuǎn)移至12孔板中,并補加1 mL完全培養(yǎng)基,輕混勻后放至培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后120 h,細胞繁殖良好未出現(xiàn)大量的細胞死亡現(xiàn)象,NC組和CON組具有相似的細胞狀態(tài),使用熒光顯微鏡觀察標記基因的表達,熒光率即為病毒的陽性轉(zhuǎn)染率。

1.2.2 實時PCR檢測Runx2基因轉(zhuǎn)錄水平 收集轉(zhuǎn)染細胞,2000 r/min離心5 min后吸除其中上清液,向沉淀物中加入1 mL Trizol并充分混勻,室溫下靜置5 min后轉(zhuǎn)移至新EP管;反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(使用M-MLV試劑盒),將2 μL反轉(zhuǎn)錄引物與2.0 μg Total RNA一同混入PCR小管中,再加入RNase-Free H2O至11 μL,混勻后進行離心,70 ℃水浴10 min,立即對其進行冰浴退火。按比例配制反應體系,混勻后進行短暫離心。42 ℃水浴中上述體系反應1 h后,70 ℃水浴10 min令反轉(zhuǎn)錄酶失活,最后得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA將置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?步法實時PCR并制作擴增曲線和熔解曲線,然后進行數(shù)據(jù)分析。所需引物由上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司設計合成,見表1。

表1 目的基因與內(nèi)參基因引物

1.2.3 Western Blot檢測Runx2蛋白表達水平 收集轉(zhuǎn)染細胞,使用PBS洗滌兩次后加入RIPA,在冰上進行裂解10 min,刮下細胞轉(zhuǎn)移到新EP管中,超聲使細胞破碎,4 ℃、12000 rpm離心15 min,利用BCA法測定離心后上清液蛋白的濃度。加入新裂解液使每個樣品蛋白濃度調(diào)至2 μg/μL-1,加入1/5體積的6X lodding buffer并混勻,100 ℃浴煮 10min,短暫離心后保存在-80 ℃?zhèn)溆?。SDS-PAGE電泳,使用濕轉(zhuǎn)法免疫印跡。室溫下對PVDF膜封閉1 h,加入稀釋后一抗Runx2(1∶1000)、β-actin(1∶2000)4 ℃孵育過夜,TBST溶液洗膜,加入稀釋后二抗(1∶5000)室溫下孵育1.5 h,TBST溶液洗膜,X光顯影。利用Image J軟件分析圖像中蛋白OD比值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析,實驗組和對照組數(shù)據(jù)進行t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染效率 病毒轉(zhuǎn)染120 h后,各組細胞狀態(tài)相當,細胞未出現(xiàn)大量死亡;熒光顯微鏡觀察標記基因表達,熒光率即為陽性轉(zhuǎn)染率。NC組熒光表達未見;KD1組熒光表達較高;KD2組熒光表達最高;KD3組熒光表達較低,見圖1。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染GNM細胞結(jié)果

2.2 GNM細胞Runx2 基因轉(zhuǎn)錄水平 實時PCR擴增曲線中各管曲線的平行性好,提示各管擴增效應相近,熔解曲線中Runx2基因和GAPDH基因均為單一峰型,峰形基底窄而峰高,提示引物設計良好,特異性強,見圖2。PCR結(jié)果顯示,相較于NC組,KD2組的GNM細胞Runx2基因敲低效率最高,約達到64.4%(P<0.05),見圖3。

圖2 擴增曲線和溶解曲線

圖3 各組Runx2 mRNA表達水平分析

2.3 GNM細胞Runx2蛋白表達水平 Western Blot結(jié)果顯示,相較于NC組,KD2組的GNM細胞Runx2蛋白表達下調(diào)最為明顯(P<0.05),見圖4、5。

圖4 Western Blot結(jié)果

圖5 各組Runx2 蛋白表達水平分析

3 討論

RNA干擾技術(RNAi)是應用較廣泛的基因沉默方法,其相較DNA敲除技術操作簡單且沉默效果可靠,現(xiàn)已有多種基于RNAi的癌癥治療制劑投入臨床試驗[9-10]。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科,其可將自身RNA整合到宿主染色體上,慢病毒載體是通過改造慢病毒基因使其失去毒性后形成的一種基因編輯工具,以實現(xiàn)搭載基因在宿主細胞形成穩(wěn)定表達[11]。慢病毒轉(zhuǎn)染是RNAi常用的基因?qū)敕绞?即首先利用質(zhì)粒在輔助細胞內(nèi)包裝獲得慢病毒顆粒,攜帶dsRNA的慢病毒顆粒感染目的細胞,隨之針對靶基因的dsRNA隨病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA并結(jié)合到目的細胞的染色體上,形成穩(wěn)定表達的dsRNA。胞質(zhì)中核酸內(nèi)切酶Dicer將再生成的dsRNA切割成小干擾RNA(siRNA),siRNA在RNA解旋酶作用下形成反義鏈RNA,反義鏈RNA與靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA互補結(jié)合使其切割后降解,同時siRNA反義鏈可激活dsRNA合成形成RNAi循環(huán),從而特異性抑制靶基因表達[12-13]。本實驗即利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術將重組基因整合到GNM細胞的基因組中,隨之細胞內(nèi)觸發(fā)的RNA干擾使Runx2基因達到穩(wěn)定沉默效果。

慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果受多種因素影響,包括培養(yǎng)時間、轉(zhuǎn)染試劑、細胞特性、病毒細胞比例等。實驗前利用預實驗首先確定病毒轉(zhuǎn)染的適宜條件,陰性對照病毒選用CON-313,按轉(zhuǎn)染試劑分為A組:在常規(guī)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染病毒;B組:在添加HitransG A(簡稱A液)的常規(guī)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染病毒;C組:在添加HitransG P(簡稱P液)的常規(guī)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染病毒;Control組:常規(guī)培養(yǎng)基中觀察細胞是否正常生長。而后按照感染復數(shù)分4組進行病毒轉(zhuǎn)染:MOI=1; MOI=10; MOI=50; MOI=100,預實驗結(jié)果顯示對GNM細胞而言,在含P液的常規(guī)培養(yǎng)基中,病毒按 MOI=10 更易轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染率可達80%且細胞增殖良好。根據(jù)預實驗結(jié)果用慢病毒轉(zhuǎn)染GNM細胞,將病毒按序號分為:NC組(CON313)、KD1組LV-Runx2-RNAi(80978-1)、KD2組LV-Runx2-RNAi(80979-1)和KD3組LV-Runx2-RNAi(80980-1)。病毒轉(zhuǎn)染后16 h換液,120 h后熒光顯微鏡觀察到各組細胞狀態(tài)良好,其中NC組熒光表達未見;KD1組熒光表達較高;KD2組熒光表達最高;KD3組熒光表達較低,KD2組相較其他組病毒的轉(zhuǎn)染效率更高。RT-PCR分析顯示KD2組Runx2基因沉默效果最佳,沉默效率可達64.4%。Western Blot結(jié)果顯示KD2組GNM細胞Runx2蛋白表達下調(diào)顯著,較其他實驗組具有明顯差異。實驗篩選出特異性沉默GNM細胞Runx2基因的慢病毒組,并初步確定作用時間及各種實驗參數(shù)適宜值等。

Runx家族都包含一個Runt的DNA結(jié)合域,使Runx蛋白與DNA結(jié)合以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Runx2通常被稱為成骨的主開關,是機體骨代謝過程中的橋梁[14]。Runx2是促進成骨細胞和軟骨細胞成熟的關鍵調(diào)控因子,Runx2基因突變時會導致顱鎖骨發(fā)育不良、顱縫早閉等遺傳性骨病的發(fā)生[15-17]。Runx2主要表達兩種亞型,其中Ⅱ型Runx2主要在骨譜系中表達,而癌細胞中表達的是由近端P2啟動子轉(zhuǎn)錄的Ⅰ型Runx2[18]。Runx2 的異常表達與腫瘤細胞的干細胞潛能相關,Guo等[19]研究發(fā)現(xiàn)Runx2在胃癌的早期階段高表達,Runx2的表達上調(diào)Yes相關蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)激發(fā)胃癌腫瘤細胞的致瘤潛力。此外有研究稱多發(fā)性骨髓瘤中Runx2正向調(diào)節(jié)腫瘤細胞凋亡的抑制基因生存素(survivin)表達,并增強多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖[20]。Runx2的異常表達還會作用于腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程[21-23]。Gowda等[24]發(fā)現(xiàn)miR-302b通過靶向Runx2抑制乳腺癌的腫瘤進展,其與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關。骨轉(zhuǎn)移腫瘤細胞常顯示成骨細胞樣細胞表型,如腫瘤細胞通過Runx2依賴性信號傳導表達甲狀旁腺激素相關蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrp)、NF-κB受體活化因子配體(nuclear factor-κB receptor activating factor ligand,RANKL),激活破骨細胞NF-κB信號通路使腫瘤周圍骨質(zhì)破壞,促進骨轉(zhuǎn)移腫瘤生長[25-26]。同時腫瘤細胞能通過Runx2表達Dickkopf相關蛋白1(DKK1)抑制成骨細胞Wnt通路阻斷腫瘤周圍環(huán)境的骨質(zhì)修復,以促進腫瘤的溶骨性骨轉(zhuǎn)移[27]。以上研究提示Runx2在腫瘤的惡性生物學行為中具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,然而牙齦癌中Runx2的調(diào)控機制尚未明確,因此探討Runx2在牙齦癌中的潛在作用機制具有顯著的臨床意義。

4 結(jié)論

本實驗成功構(gòu)建沉默Runx2基因的GNM細胞慢病毒載體,此慢病毒載體是進一步研究Runx2基因沉默后GNM細胞功能和信號轉(zhuǎn)導改變的重要實驗工具。Runx2在牙齦癌細胞模型和動物模型中的時空表達變化及調(diào)控機制將是課題組接下來深入研究的重點內(nèi)容,借此以期發(fā)掘出牙齦癌發(fā)生發(fā)展中的關鍵機制,從而為牙齦癌的靶向治療提供理論參考。