李麗 許翀 柴若楠

(1.中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院過敏反應科,遼寧 沈陽 110016;2.錦州醫(yī)科大學過敏反應科,遼寧 錦州 121001)

過敏性鼻炎-哮喘綜合征( Combined allergic rhinitis and asthma syndrome,CARAS) 是一種變態(tài)反應性疾病,近年來發(fā)病率逐年增加[1]。磷酸酰肌醇-3激酶(P13K)被證實參與CARAS的產(chǎn)生及發(fā)展[2],因此抑制PI3K對CARAS大鼠的治療至關重要。瞬時感受器電位離子通道蛋白1(Transient Receptor Potential Vanilloid type 1,TRPV1)主要定位在神經(jīng)纖維中,可受多種因素激活,其中神經(jīng)炎性介質(zhì)也可直接或者間接激活TRPV1。目前證實TRPV1參與咳嗽、疼痛、炎癥、腫瘤等的產(chǎn)生及發(fā)展[3-6]。目前已有多項研究證實TRPV1在過敏性鼻炎中為高表達[7-8],但具體作用機制暫未完全掌握。另外在CARAS中炎性反應被認為是其產(chǎn)生及發(fā)展的重要因素之一。胸腺基質(zhì)淋巴生成素(Thymicstromal lympho poietin,TSLP)是炎性反應的啟動因素。相關炎性因子刺激上皮細胞分泌TSLP,通過促進樹突細胞成熟誘導炎性因子的釋放,最終導致淋巴細胞受到炎性因子浸潤,加重哮喘炎性反應[9]。氧化應激是CARAS的病理機制之一,會造成DNA損傷,可激活核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)等,活化炎性因子,加重氣道炎性反應[10]。但目前關于TRPV1、TSLP在CARAS中作用的相關研究鮮少,具體機制尚不明確。因此,本文旨在研究PI3K抑制劑LY294002對過敏性鼻炎-哮喘綜合征大鼠氧自由基、TRPV1神經(jīng)元敏感性及TSLP表達的影響,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD健康大鼠40只,購自蘇州市顧秀實驗動物設備公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)-2019-0124],體質(zhì)量在200～300 g之間,鼠齡在6-8周,適應飼養(yǎng)1周后進行實驗。本次實驗已通過我院動物倫理委員會審批(批號:20190204)。

1.2 主要實驗試劑與儀器 BCA試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司),TSLP試劑盒(廈門侖昌碩生物科技有限公司),TSLP、NF-кB、IкB、TRPV1一抗(南京森貝伽生物公司),蘇木精染色液(廈門海標科技有限公司),辣根過氧化物酶二抗(上海李記生物科技有限公司),SOD、MDA試劑盒(上海銘博生物科技有限公司),枸櫞酸鹽緩沖液(北京諾博萊德科技公司),凝膠成像儀(上海賀琛能源科技有限公司,型號:GelSMART),酶標儀(青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司,型號:JC-1087A)。

1.3 LY294002混懸液配置 取2 mg LY294002粉末溶解于200 μL的二甲基亞礬(DMSO)中,0.9% NaCl溶液定容至6 mL,震蕩混勻。

1.4 模型建立 根據(jù)文獻[11]運用卵蛋白致敏和鼻部滴注攻擊法建立過敏性鼻炎-哮喘大鼠模型:將卵白蛋白于大鼠腹腔注射2周后在連續(xù)鼻部滴注1周,建模。從初次致敏第7 d開始運用卵白蛋白滴鼻,10 μL/1次/d,共7 d。后隔日給予1 g/L卵白蛋白滴鼻,持續(xù)對鼻粘膜進行刺激。每隔7 d觀察一次鼻部滴蛋白液30 min內(nèi)搔鼻次數(shù)和噴嚏次數(shù)。記錄大鼠鼻分泌物量、噴嚏次數(shù)及鼻癢程度。方法如下:①鼻涕流至前鼻孔為1分;超過前鼻孔為2分;涕流滿面為3分。②噴嚏4個以內(nèi)為1分;5～10個為2分;10個以上為3分。③鼻癢輕度抓鼻為1分;頻繁抓為2分;不停抓為3分。總分超過5分為動物造模成功。30只大鼠全部建模成功,均未發(fā)生死亡。

1.5 分組及干預 40只大鼠隨機分為健康組、模型組、治療組、對照組,每組各10只。除正常組大鼠外,其余大鼠建立過敏性鼻炎-哮喘綜合征模型。治療組:大鼠靜脈注射LY294002(0.5 mg/kg),1次/周,共8周。對照組:大鼠給予布地奈德氣霧劑(魯南貝特制藥有限公司)經(jīng)鼻吸入治療,2次/d,1～2吸/次,共8周。實驗期間動物自由進食、飲水,模型組與正常組注射等量生理鹽水。

1.6 檢測指標

1.6.1 ELISA檢測TSLP表達 治療8周后,取5 mg左右肺組織,離心5 min,1500 r/min,取上清。運用ELISA檢測TSLP表達,實驗步驟按照試劑盒說明進行。

1.6.2 免疫組織化學法檢測TSLP在肺組織中蛋白含量 治療8周后,取各組大鼠5 mg肺組織石蠟切片,脫蠟、脫水后PBS清洗,將肺組織切片浸染于3%過氧化氫溶液,約10 min;0.01 mol/L PBS沖洗3次,加熱至沸騰后自然冷卻,PBS沖洗,封閉0.5 h,一抗滴加TSLP抗體(1∶100稀釋),4 ℃孵育過夜;PBS(0.01 mol/L)沖洗3次,1次/5 min,在室溫下滴加稀釋度為1∶200的生物素化山羊抗兔IgG,孵育0.5 h,PBS(0.01 mol/L)沖洗3次,1次/5 min,室溫SABC試劑浸染1 h;PBS(0.01 mol/L)沖洗2次,1次/5 min,DAB顯色,蒸餾水終止,乙醇脫水,二甲苯浸染10 min(2次),中性樹膠封片,顯微鏡下觀察,用Image Pro Plus 6.0軟件進行圖片分析。

1.6.3 檢測各組大鼠氧自由基相關指標表達 治療8周后,取各組大鼠5 mg肺組織剪碎,裂解液裂解,勻漿機勻漿制成10%懸液,離心5 min,1250 r/min,后取血清。格按照說明書進行,黃嘌呤氧化酶法檢測SOD,TBA法檢測MDA。

1.6.4 HE 染色觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學變化 治療8周后,取各組大鼠10 mg肺組織,4%多聚甲醛溶液中固定,-70 ℃冰箱中凍存。將石蠟切片置于60 ℃的保溫箱中1 h,經(jīng)二甲苯及70%～100%等濃度的酒精反復脫蠟5次至水,蒸餾水清洗,蘇木素染色10 min,蒸餾水沖洗,待切片褪色適中后,蒸餾水漂洗1 h,伊紅復染后用90%和100%乙醇脫水2次,1 min/次,將切片徹底脫水,再侵入二甲苯溶液中10 min進行透明,把樹膠滴在肺組織切片上,蓋玻片封固,200 倍光學顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。

1.6.5 免疫熒光檢測TRPV1表達 治療8周后,取各組大鼠10 mg肺組織石賭切片脫蠟,乙醇脫水后PBS沖洗,封閉1 h,PBS(0.01 mol/L)沖洗2次,1次/5 min,然后按照1∶100稀釋比例加入TRPV1一抗抗體,4 ℃孵育過夜,倒去TRPV1抗體,0.01 mol/L PBS沖洗2次,1次/5 min,加入熒光標記二抗,室溫孵育1h,PBS蟲死,DAPI染色,室溫孵育染色5 min,PBS沖洗,加入抗熒光泮滅封片液,蓋玻片封片后共聚焦顯微鏡下觀察。TRPV1綠色熒光,細胞核DAPI為藍色熒光;用Image Pro Plus 6.0軟件進行圖片分析。

1.6.6 免疫印跡檢測NF-кB、IкB蛋白表達 10 mg肺組織剪碎后研磨,裂解液裂解后勻漿機勻漿,離心5 min,1500 r/min,取上清。BCA法測定總蛋白,調(diào)整蛋白濃度后電泳儀電泳,后將蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上,脫脂奶粉封閉1 h,加入NF-кB、IкB一抗4 ℃孵育過夜, PBS清洗后,加入羊抗兔二抗室溫孵育 2 h,PBS清洗,ECL法顯色,凝膠成像儀觀察,以 Image J 分析各組蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清及肺組織中TSLP表達 與健康組相比,模型組大鼠血清中TSLP及肺組織蛋白含量的表達升高(P<0.05),與模型組相比,治療組與對照組大鼠血清中TSLP及肺組織蛋白含量的表達降低(P<0.05),治療組與對照組大鼠血清及肺組織中TSLP表達對比無差異(P>0.05),見表1、圖1。

圖1 免疫組織化學法檢測各組中TSLP蛋白含量(200×)

2.2 各組大鼠氧自由基相關指標表達 與健康組相比,模型組大鼠肺組織中氧自由基相關指標SOD表達降低、MSA表達升高(P<0.05);與模型組相比,治療組與對照組SOD表達升高、MDA表達降低(P<0.05);SOD、MDA在治療組與對照組中的表達無差異(P>0.05),見表2、圖2。

表2 各組大鼠SOD、MDA表達對比

圖2 各組大鼠SOD、MDA表達對比

2.3 各組大鼠肺組織病理形態(tài) 與健康組相比,模型組大鼠肺組織中支氣管及管壁產(chǎn)生大量炎性細胞,支氣管黏膜水腫、增厚,管腔狹窄,黏液分泌增多;與模型組比較,治療組與對照組肺組織病理明顯有所改善,見圖3。

圖3 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)(200×)

2.4 各組大鼠肺組織TRPV1表達 與健康組相比,模型組大鼠肺組織中TRPV1蛋白含量明顯增加(P<0.05),與模型組相比,治療組與對照組TRPV1蛋白含量明顯降低(P<0.05),見圖4A、B。

圖4 各組大鼠肺組織TRPV1表達

2.5 各組大鼠肺組織NF-кB、IкB蛋白表達 與健康組相比,模型組大鼠肺組織中NF-кB蛋白表達升高、IкB蛋白表達降低(P<0.05);與模型組相比,治療組與對照組NF-кB表達降低、IкB表達升高(P<0.05);NF-кB、IкB在治療組與對照組中的表達無差異(P>0.05),見表3、圖5。

表3 各組大鼠NF-кB、IкB蛋白表達對比

圖5 免疫印跡檢測各組大鼠NF-кB、IкB蛋白表達對比

3 討論

CARAS會使氣道通氣阻力增加,其在發(fā)病過程中會釋放大量炎性介質(zhì),此時機體會產(chǎn)生大量的氧自由基。氧自由基會造成機體細胞及組織等損傷,增加自由基的產(chǎn)生,從而導致SOD等拮抗物消耗增加,引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應使得MDA增加,形成惡性循環(huán)損傷氣道,從而加重炎性反應,致使氣道炎癥發(fā)生[12]。因此,清除過多的氧自由基和氧化反應產(chǎn)物對CARAS的治療至關重要。研究發(fā)現(xiàn),活性氧能夠激活PI3K/AKT信號通路,促進轉(zhuǎn)錄因子,如NF-кB的激活[13]。NF-кB激活后誘導白介素-4等促炎細胞因子的表達,導致氣道纖維化,平滑肌細胞增殖等進一步加重哮喘。本實驗結(jié)果顯示,與健康大鼠相比,模型大鼠體內(nèi)SOD表達降低、MDA升高,在經(jīng)過PI3K抑制劑LY294002干預后SOD表達升高、MDA降低,且為了驗證實驗的準確性,本文運用治療過敏性鼻炎-哮喘綜合征較為成熟的藥物布地奈德進行對比,發(fā)現(xiàn)治療組與對照組SOD、MDA表達對比無意義,提示LY294002具有維持氧自由基生成與清除的動態(tài)平衡,可能是治療CARAS的作用機制。

TRPV1可對多種有害刺激做出反應[14]。TRPV1可增加咳嗽的敏感性,與咳嗽反應強度呈正相關。當呼吸道受到感染后前列腺素E2合成增加并與其受體結(jié)合,通過相關蛋白轉(zhuǎn)導,活化TRPV1通道。氧化應激反應時刺激TRPV1的主要因素。被活性氧消化還原的谷胱甘肽可增加蛋白激酶C的活化,活化的該指標可磷酸化TRPV1,TRPV1活化后導致神經(jīng)末梢釋放神介質(zhì)如SP增加,SP增加會刺激氣道引起咳嗽[15]。丁惠娟等[16]研究提示,在坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎損傷模型中,PI3K/Akt通過上調(diào)TRPV1的表達,參與CCI致神經(jīng)病理性疼痛的形成。Liu等[17]在對腦損傷大鼠的實驗研究中提出,通過刺激通過TRPV1表達后可激活PI3K/Akt信號通路,從而誘導腦損傷,抑制TRPV1表達后,PI3K/Akt激活受到抑制,有助于緩解腦損傷嚴重情況。上述研究均提示,PI3K/Akt通路與TRPV1可相互調(diào)節(jié),具有一定的相關性。本實驗結(jié)果顯示,與健康大鼠相比,模型大鼠TRPVV1表達顯著增加,在經(jīng)過給予PI3K抑制劑LY294002后,TRPV1表達顯著下降,提示LY294002可抑制TRPV1表達,從而降低過敏性鼻炎-哮喘綜合征大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥,最終達到治療該病的效果。

過敏性炎癥中多種因素均可刺激TSLP表達,其中NF-кB通路是調(diào)控TSLP表達的重要機制[18]。研究提示,TNF-α通過刺激NF-кB通路,從而誘導氣道上皮細胞分泌TSLP;IкB升高或NF-кB信號抑制劑干預,則減少上皮細胞表達TSLP[19]。另有研究證實,人基因啟動子位點含有NF-кB的結(jié)合位點是TSLP蛋白表達所必需的[20]。此外,NF-кB通路通過調(diào)控相關促炎因子等的表達促進氣道上皮細胞中TSLP的表達,最終引起呼吸道炎癥產(chǎn)生。在敲除TSLP和過表達TSLP的動物模型上,過表達TSLP肺組織炎性反應增加并伴有氣道高反應產(chǎn)生,而在TSLP敲除小鼠肺組織中沒有產(chǎn)生明顯的過敏性哮喘相關癥狀。以上結(jié)論均提示,NF-кB通路可刺激TSLP表達升高,從而引起肺組織炎癥產(chǎn)生,誘發(fā)氣道高反應性產(chǎn)生。研究還發(fā)現(xiàn),P13K是多種信號通路的關鍵分子,影響炎性細胞的募集、激活及凋亡等[21]。本實驗結(jié)果顯示,與健康大鼠相比,模型組TSLP、NF-кB升高,IкB降低,在經(jīng)過PI3K抑制劑LY294002干預后,TSLP、NF-кB降低,IкB升高。劉雙等[22]研究提示,AKT通過刺激IкB磷酸化,從而激活NF-кB使其磷酸化,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用,從而調(diào)控炎癥因子的合成和釋放。結(jié)合上述結(jié)論,本研究認為,LY294002通過抑制PI3K水平,降低了NF-кB的活性,并抑制IкB的降解,從而抑制了TSLP的表達,防止氣道高反應性的產(chǎn)生,阻滯疾病惡性發(fā)展。

4 結(jié)論

綜上所述,通過抑制TRPV1、TSLP、MDA并促進SOD表達,降低了CARAS大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥、防止氣道高反應性的產(chǎn)生并改善了氧化應激損傷及病理水平,從而發(fā)揮治療作用。