于杰 ，鄭淑媚，張文海，周瑞剛，趙鋼，李金貴*

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷第一人民醫(yī)院，江蘇 宿遷 223800

3.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009

金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus是一種常見的可引起人和動(dòng)物廣泛感染的革蘭陽性化膿性細(xì)菌，入侵機(jī)體后，輕則引起輕微的皮膚感染，如毛囊炎、壓瘡等，重則深入深層的組織，危及生命，引起敗血癥、菌血癥、心內(nèi)膜炎和肺炎等[1]。老年壓瘡患者創(chuàng)面多重耐藥菌感染的病原菌中以超廣譜β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細(xì)菌為首，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）檢出率位居第2 位，為了減少壓瘡的發(fā)生率，應(yīng)對(duì)金黃色葡萄球菌及其耐藥菌株給予重點(diǎn)關(guān)注[3]。近年來，金黃色葡萄球菌多藥耐藥菌株不斷出現(xiàn)，其中MRSA 更是具有發(fā)病率高、致死率高及治療棘手的特點(diǎn)[4]，致使臨床中對(duì)感染性疾病的治療更加復(fù)雜。因此，尋找有效防治MRSA引起皮膚感染的新方案至關(guān)重要。

金黃色葡萄球菌存在諸多逃避宿主的機(jī)制，細(xì)胞膜是細(xì)菌保衛(wèi)自身功能的第一道屏障，可以維持菌體形態(tài)、傳遞信息以及物質(zhì)交換[5]。金黃色葡萄球菌的生物被膜（BF）可以保護(hù)其逃避宿主細(xì)胞的免疫識(shí)別，誘導(dǎo)其發(fā)生耐藥或者增強(qiáng)其耐藥性。細(xì)菌通過不斷重復(fù)黏附、聚集、繁殖、成熟、擴(kuò)散這一BF 形成過程，致使機(jī)體持續(xù)感染[6]。其中，金黃色葡萄球菌毒力因子的廣泛表達(dá)對(duì)BF 的定植、形成、擴(kuò)散及感染具有重要作用。金黃色葡萄球菌BF的形成和擴(kuò)散由多個(gè)基因編碼及參與，其中包括纖維連接蛋白原結(jié)合蛋白基因（fnbA和fnbB）、細(xì)胞間黏附基因（icaA）、凝聚因子基因（clfA和clfB）等基因參與形成，而agr基因和葡萄球菌附屬調(diào)節(jié)劑基因（sarA）的表達(dá)也可以促進(jìn)BF 的形成和擴(kuò)散[7]。因此，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜、BF 生成的抑制及促進(jìn)成熟BF 的降解是控制金黃色葡萄球菌感染的重要研究方向。

在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中，藥用植物及其化合物被廣泛用于治療各種疾病，許多植物化學(xué)物質(zhì)具有抗菌、抗真菌和抗病毒特性[8]。丁香是桃金娘科蒲桃屬植物，丁香酚是丁香油的主要成分，亦是艾條艾煙的主要藥效成分之一[9]，具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒、抗真菌、抗炎和抗氧化等生物學(xué)特性。近年來，丁香酚對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的抑菌機(jī)制研究成為熱點(diǎn)[10]。在心內(nèi)科住院患者壓瘡病原菌分布情況研究分析發(fā)現(xiàn)，壓瘡主要致病菌之一為金黃色葡萄球菌，且其毒力基因tst和pvl均有檢出[11]，金黃色葡萄球菌嚴(yán)重延遲并阻礙創(chuàng)面愈合的進(jìn)程。本項(xiàng)目組前期致力于艾灸促進(jìn)壓瘡組織血管新生及調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)艾灸分別從炎癥期、增生期及重塑期促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，提前炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)高峰，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[12-17]。丁香酚作為艾煙化學(xué)成分的主要藥效成分之一，是否對(duì)壓瘡致病菌中的金黃色葡萄球菌發(fā)揮抗菌、抑制BF 形成的作用？本研究旨在通過最小抑菌實(shí)驗(yàn)、生長(zhǎng)曲線、菌體超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的通透性和完整性、BF 及其相關(guān)毒力因子的檢測(cè)等方面明確丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA 的體外抗菌效果，為丁香酚在防治金黃色葡萄球菌及其耐藥菌株引起的皮膚感染及壓瘡提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株的來源、保存和培養(yǎng) 金黃色葡萄球菌（菌號(hào)ATCC29213）購(gòu)自中國(guó)藥物及生物制品檢定所醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。豬源MRSA 由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供。2 株菌種均長(zhǎng)期凍存于本教研室中-80 ℃超低溫冰箱。實(shí)驗(yàn)階段取出菌株，接種環(huán)挑取菌液后3 區(qū)劃線接種于Luria-Bertani（LB）瓊脂平板上，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)12～16 h。再?gòu)腖B 瓊脂平板上挑取單一菌落于LB 肉湯培養(yǎng)基，180 r/min，37 ℃搖床培養(yǎng)12～16 h 進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)傳代3～4 次后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 丁香酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.5%）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司（貨號(hào)O994145-100mg）；酵母浸粉（貨號(hào)HB8273），胰蛋白胨（貨號(hào)HB8270），可溶性淀粉（貨號(hào)HB8513-1），牛肉浸粉（貨號(hào)HB8272），瓊脂粉（貨號(hào)HB8274-1），酸水解酪蛋白（貨號(hào)HB8291）均購(gòu)自青島高科園海博科技有限公司；氯化鈉（貨號(hào)73522260），十二水磷酸氫二鈉（貨號(hào)20040718），氯化鉀（貨號(hào)H005376HY），磷酸二氫鉀（貨號(hào)10017608）和戊二醛（貨號(hào)30092582），結(jié)晶紫（貨號(hào)71012314）均購(gòu)自南京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RNA-easy isolation Reagent（貨號(hào)R701），購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；Hifair? Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）（貨號(hào)11141ES10）和Hieff? qPCR SYBR? Green Master Mix（No Rox）（貨號(hào)11201ES60）購(gòu)自上海Yeasen Biotechnology 有限公司；碘化丙啶（PI）染液（貨號(hào)P8080）購(gòu)自索萊寶有限公司；N-菲酰-次巰基-L-丙氨酸（NPN）染色（貨號(hào)N14900-25g）購(gòu)自TCI 化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.3 主要溶液的配制 2.5%戊二醛固定液：戊二醛原液（25%）與超純水按照1∶9 的比例進(jìn)行稀釋。結(jié)晶紫溶液：精密稱取0.1 g 結(jié)晶紫粉末，用100 mL超純水進(jìn)行溶解，并使用渦旋儀進(jìn)行震蕩以便于充分溶解。將配好的溶液分裝，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 最低抑菌濃度（MIC）及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)（M100，2019），采用肉湯微量稀釋法測(cè)定丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA 的MIC，以金黃色葡萄球菌為質(zhì)量控制菌株。將MH 肉湯和一定濃度的丁香酚加至無菌96 孔板內(nèi)，使用二倍稀釋法將丁香酚稀釋到相應(yīng)濃度；將對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的菌液用MH 肉湯稀釋至1.0×106cfu/mL，并按照100 μL/孔接種受試菌株的細(xì)菌懸液，各孔終體積達(dá)到200 μL。分別設(shè)置空白對(duì)照組、不同濃度（1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC）丁香酚組，每孔設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)16～18 h 后，以孔內(nèi)完全沒有細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度，即丁香酚對(duì)該菌株的MIC。

用TSB 肉湯培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌和MRSA 稀釋并調(diào)整菌液濃度至1×105cfu/mL，用1%接種量接種于TSB 肉湯培養(yǎng)液中。分別加入1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC 的丁香酚，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，37 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)24 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm 處的吸光度（A）值，并繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.2 丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜滲透性的測(cè)定

（1）堿性磷酸酶（AKP）活性的檢測(cè)：將金黃色葡萄球菌和MRSA 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.01 mol/L PBS（pH 7.2）重懸以獲得1×106cfu/mL 的菌液；然后在細(xì)菌重懸液中加入丁香酚，使其終濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC，并設(shè)置空白對(duì)照組。搖床設(shè)置條件為180 r/min、37 ℃培養(yǎng)，在0、2、4、6、8 h 分別收集菌液，3 500 r/min 離心10 min后收集上清液用于AKP 檢測(cè)（實(shí)驗(yàn)步驟參照AKP試劑盒使用說明書）。

（2）NPN 染色：將金黃色葡萄球菌和MRSA 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用MH 肉湯培養(yǎng)液稀釋為1×106cfu/mL的菌液；然后在細(xì)菌重懸液中加入丁香酚使其終濃度為1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，并設(shè)置空白對(duì)照，搖床設(shè)置條件為180 r/min、37 ℃培養(yǎng)4 h 后，1 000 r/min 離心10 min，收集菌體。無菌PBS 清洗3 次后重懸，再加入NPN 染液5 μL，37 ℃避光孵育1 h 后，再用無菌PBS 清洗3 次并重懸。吸取重懸菌液于載玻片上并均勻涂布，酒精燈烘烤固定，滴加3 μL 抗熒光淬滅劑后封片，避光4 ℃保存。通過激光共聚焦顯微鏡（TCS SP8 STED）進(jìn)行觀察NPN 熒光強(qiáng)度，用于評(píng)價(jià)丁香酚對(duì)細(xì)菌外膜滲透性的作用，激發(fā)光波長(zhǎng)為350 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為420 nm。

（3）PI 染色：細(xì)菌與藥物處理同1.2.2（2），向PBS 清洗并重懸的菌液內(nèi)加入PI 染液（1 μmol/L），37 ℃避光孵育10 min 后，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察NPN 熒光強(qiáng)度，用于評(píng)價(jià)丁香酚對(duì)細(xì)菌內(nèi)膜滲透性的作用，激發(fā)光波長(zhǎng)為535 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為617 nm。最后采用Image J 軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度的分析。

1.2.3 丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌胞內(nèi)核酸和蛋白表達(dá)的影響 將金黃色葡萄球菌和MRSA 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.01 mol/L PBS（pH 7.2）重懸以獲得1×106cfu/mL 的菌液；然后在細(xì)菌重懸液中加入丁香酚使其終濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC，并設(shè)置空白對(duì)照組。搖床設(shè)置條件為180 r/min、37 ℃培養(yǎng)4 h 后，將細(xì)菌懸液3 500 r/min，離心10 min，收集上清，使用酶標(biāo)儀測(cè)定260、280 nm 處的吸光度（A）值，來確定胞內(nèi)核酸和蛋白的泄露水平。

1.2.4 丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌表面超微結(jié)構(gòu)的影響

（1）細(xì)菌處理：將金黃色葡萄球菌和MRSA 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用MH 肉湯培養(yǎng)基調(diào)整濃度至1×106cfu/mL，并加入丁香酚使其終濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC 和MIC。180 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)4 h，再用無菌PBS 清洗3 次，3 500 r/min 離心5 min 后，將細(xì)菌重懸于PBS 中。

（2）掃描電鏡處理：將上述菌液滴在無菌爬片上，加入2.5%戊二醛，4 ℃固定12 h 后進(jìn)行梯度脫水處理。PBS 洗玻片3 次，30%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇依次梯度脫水，各梯度15 min；然后在干燥器中干燥、噴金；最后，通過Geminisem 300 蔡司場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行觀察和拍照。

（3）透射電鏡處理：取上述PBS 重懸菌液直接滴于帶有支持膜的載網(wǎng)上，靜置10 min。用濾紙條從液滴邊緣吸去多余液體，稍做干燥，載網(wǎng)置于5%磷鎢酸負(fù)染色液上漂染1 min。除去多余染色液，紅外燈烘烤30 min，使用Tecnai 12 透射電鏡觀察并成像。

1.2.5 丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌毒力因子基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響

（1）細(xì)菌制備與處理：用LB 肉湯培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌和MRSA 濃度調(diào)整至1×106cfu/mL，分別加入1/8 MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC 的丁香酚，180 r/min、37 ℃培養(yǎng)4 h 后，用無菌PBS 洗3 次，3 500 r/min 離心10 min 后收集細(xì)菌團(tuán)塊。

（2）細(xì)菌總RNA 提?。涸谏鲜黾?xì)菌團(tuán)塊中，加入1 mL 的Trizol 并均勻吹打混勻菌體后，靜置10 min。4 ℃下13 201×g離心10 min，小心吸取上清于新的離心管，加入200 μL 氯仿進(jìn)行抽提，充分震蕩后靜置10 min。4 ℃下13 201×g離心10 min，小心吸取上水相于新的1.5 mL 離心管，重復(fù)此過程2 次。隨后加入等體積異丙醇顛倒混勻，靜置10 min，4 ℃下13 201×g離心10 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇輕柔震蕩洗滌產(chǎn)物，4 ℃下13 201×g離心10 min，重復(fù)2 次；棄去上清，晾置離心管直至乙醇完全揮發(fā)；加入30 μL DEPC 水溶解總RNA，并將其置于-80 ℃冰箱保存，或直接檢測(cè)濃度進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

（3）合成cDNA：測(cè)定總RNA 的濃度并用DEPC水調(diào)至75 ng/μL，采用兩步法反應(yīng)體系制備cDNA。首先取75 ng/μL 的RNA 12 μL，加入3 μL 5×gDNA digester Mix，42 ℃金屬浴中反應(yīng)2 min，充分去除殘留的基因組DNA；然后加入5 μL 4×Hifair?qRT SuperMix，混勻后置于PCR 儀中，25 ℃反應(yīng)5 min，55 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 min，所獲得產(chǎn)物可以立即用于PCR 反應(yīng)，也可以在-20 ℃短期保存。

（4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）：將cDNA稀釋5 倍，并把引物稀釋為0.2 μmol/L。按說明書預(yù)混20 μL RT-qPCR 反應(yīng)體系：10 μL Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix，2 μL 正向引物，2 μL 反向引物，6 μL 稀釋的cDNA。反應(yīng)體系如下：95 ℃反應(yīng)5 min，95 ℃反應(yīng)10 s，60 ℃反應(yīng)30 s，循環(huán)40次。以16S RNA 為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法對(duì)Ct 值進(jìn)行相對(duì)定量分析。目的基因引物序列見表1。

表1 金黃色葡萄球菌的基因引物序列Table 1 Primers to target genes of Staphylococcus aureus

1.2.6 丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌成熟BF 的清除能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌和MRSA 用無菌的TSB 培養(yǎng)基調(diào)整濃度至1×106cfu/mL，然后接種至96 孔板中37 ℃靜置培養(yǎng)2 d，每天更換無菌的TSB 培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后，用無菌PBS 清洗兩次以清除培養(yǎng)基和游離的細(xì)菌，再向每孔中分別加入1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC 和MIC 的丁香酚稀釋液（TSB 培養(yǎng)基倍比稀釋，具體濃度可依據(jù)MIC 為0.25 mg/mL 換算），并設(shè)立空白對(duì)照組（不含丁香酚），37 ℃培養(yǎng)8 h。

結(jié)晶紫染色：棄去96 孔板內(nèi)上清液，PBS 清洗3 次后，各孔加入500 μL 甲醇進(jìn)行固定；15 min 后棄去固定液，加結(jié)晶紫稀釋液200 μL/孔染色8 min，PBS 清洗后室溫干燥，再加入200 μL/孔的丙酮-乙醇（20∶80）溶液進(jìn)行細(xì)菌重懸，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 處的吸光度值（A570）。

1.2.7 丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌BF 形成抑制能力將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌和MRSA 用無菌的TSB 培養(yǎng)基調(diào)整濃度至1×106cfu/mL，然后接種至96 孔板中，再向每孔中分別加入1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC 和MIC 的丁香酚稀釋液，并設(shè)立空白對(duì)照組（不含丁香酚），37 ℃培養(yǎng)8 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用無菌PBS 清洗2 次以清除培養(yǎng)基和游離的細(xì)菌。

結(jié)晶紫染色：棄去96 孔板內(nèi)上清液，PBS 清洗3 次后，各孔加入500 μL 甲醇進(jìn)行固定；15 min 后棄去固定液，加結(jié)晶紫稀釋液200 μL/孔染色8 min，PBS清洗后室溫干燥，再加入200 μL/孔的丙酮-乙醇（20∶80）溶液進(jìn)行細(xì)菌重懸，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定A570。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，通過單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較檢驗(yàn)來對(duì)比不同組別間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，數(shù)據(jù)用表示。GraphPad Prism 8.0 軟件用于繪制直方圖和折線圖。

2 結(jié)果

2.1 丁香酚的抑菌活性以及對(duì)菌體細(xì)胞膜完整性的影響

首先以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為質(zhì)控菌株，通過肉湯微量稀釋法測(cè)定丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA 的MIC 分別為0.25、0.125 mg/mL。由于金黃色葡萄球菌的MIC 為0.25 mg/mL，故1/4 MIC、1/2 MIC、MIC 和2 MIC 分別為0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0 mg/mL。MRSA 的MIC 為0.125 0 mg/mL，故1/4 MIC、1/2 MIC、MIC 和2 MIC 分別為0.031 25、0.062 5、0.125 0 和0.250 0 mg/mL。如圖1、2 所示，空白對(duì)照組均在2 h 后快速增殖并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨后在10 h 后達(dá)到平臺(tái)期，1/4 MIC 和1/2 MIC 的丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA 的生長(zhǎng)具有抑制作用，而MIC 和2 MIC 丁香酚處理后在8 h 后不再增長(zhǎng)，說明丁香酚對(duì)2 菌株有殺菌作用。

圖1 丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞膜完整性的影響Fig.1 Growth curve and cell membrane integrity of S. aureus treated with eugenol

圖2 丁香酚對(duì)MRSA 生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞膜完整性的影響Fig.2 Growth curve and cell membrane integrity of MRSA treated with eugenol

如圖1、2 所示，培養(yǎng)液上清液中泄漏核酸的量與丁香酚的質(zhì)量濃度及處理時(shí)間呈正相關(guān)；同核酸含量的變化趨勢(shì)一致，當(dāng)用MIC 和2 MIC 處理細(xì)菌后，上清液中蛋白的含量以及AKP 的活性顯著增加。由此可見，丁香酚可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，引起菌體內(nèi)容物外漏。

2.2 丁香酚破壞金黃色葡萄球菌和MRSA 細(xì)胞內(nèi)、外膜的完整性

如圖3A、3B 所示，1/2 MIC 和MIC 丁香酚處理后，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的PI 和NPN 熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，特別是高濃度處理組，說明丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA 的內(nèi)、外膜均造成了損害，且具有濃度相關(guān)性。

圖3 丁香酚處理后金黃色葡萄球菌和MRSA 對(duì)PI（A）和NPN（B）攝取（×1 000）Fig.3 PI (A) and NPN (B) uptake of S. aureus and MRSA after treated with eugenol (×1 000)

2.3 丁香酚破壞金黃色葡萄球菌和MRSA 的菌體細(xì)胞形態(tài)

如圖4A、5A 所示，空白對(duì)照組的金黃色葡萄球菌和MRSA 表面相對(duì)光滑，形態(tài)飽滿，呈葡萄狀，經(jīng)1/4 MIC 丁香酚處理后，金黃色葡萄球菌菌體表面出現(xiàn)輕微皺縮，邊界模糊；經(jīng)1/2 MIC 和MIC 丁香酚處理后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜出現(xiàn)了明顯的凹陷、崩解；相同濃度處理的MRSA 菌體表現(xiàn)為嚴(yán)重破裂。與掃描電鏡趨勢(shì)一致，透射電鏡下亦發(fā)現(xiàn)MIC 丁香酚作用菌體后可引起金黃色葡萄球菌菌體膜結(jié)構(gòu)破裂，MRSA 則見有更明顯內(nèi)容物外漏（圖4B、5B）。由此說明，丁香酚能夠引起菌體形態(tài)發(fā)生顯著變化，且其變化情況與丁香酚的濃度呈正相關(guān)。

圖4 掃描電鏡（A）和透射電鏡（B）觀察丁香酚處理對(duì)金黃色葡萄球菌超微結(jié)構(gòu)的破壞Fig.4 Damage to ultrastructure of S. aureus treated with eugenol by SEM (A) and TEM (B)

圖5 掃描電鏡（A）和透射電鏡（B）觀察丁香酚處理對(duì)MRSA 超微結(jié)構(gòu)的破壞Fig.5 Damage to ultrastructure of MRSA treated with eugenol by SEM (A) and TEM (B)

2.4 丁香酚可抑制菌體生物被膜的生成并促進(jìn)成熟生物膜的清除

如圖6A、6C 所示，丁香酚對(duì)2 種菌株BF 形成的抑制作用隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。與空白對(duì)照組相比，1/8 MIC 丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA 生物膜形成產(chǎn)生抑制作用（P＜0.05、0.01），而1/2 MIC 和MIC 丁香酚則可以顯著抑制BF 的形成（P＜0.001）。如圖6B、6D 所示，丁香酚對(duì)成熟BF 的清除作用與其對(duì)BF 形成的抑制作用一致，且具有濃度相關(guān)性?？梢?，丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA 生物膜的形成抑制作用和促進(jìn)成熟生物膜的清除作用均具有顯著效果。

2.5 丁香酚抑制菌體毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平

如圖7A、7B 所示，空白對(duì)照組金黃色葡萄球菌中存在與BF 形成和擴(kuò)散相關(guān)的sarA、agrA、icaA、cidA、clfA、clfB、fnbA、fnbB基因表達(dá)，丁香酚處理后對(duì)它們具有抑制作用。此外，1/2 MIC 和MIC丁香酚可以顯著抑制金黃色葡萄球菌和MRSA 的sarA、agrA基因表達(dá)（P＜0.001）；受兩者調(diào)控的icaA、cidA操縱子基因的表達(dá)水平也顯著降低（P＜0.001）；1/2 MIC 和MIC 丁香酚顯著抑制了clfA、clfB、fnbA、fnbB基因的表達(dá)（P＜0.01、0.001）。

圖7 丁香酚抑制金黃色葡萄球菌（A）和MRSA（B）毒力因子基因的表達(dá)水平（ ）Fig.7 Inhibition on gene expressions of S. aureus and MRSA virulence factors by eugenol ()

3 討論

3.1 壓瘡與金黃色葡萄球菌之間關(guān)系

金黃色葡萄球菌感染常定植于人和動(dòng)物的皮膚、黏膜（腸道、鼻腔），是造成大多數(shù)皮膚感染的主要原因，包括皮下膿腫、蜂窩組織炎、毛囊炎、感染性擦傷和壓瘡。感染金黃色葡萄球菌通常會(huì)引起2 類疾病：一種是化膿性疾病，包括動(dòng)物的創(chuàng)傷性感染、壓瘡、皮下膿腫、蜂窩織炎、敗血癥、膿毒敗血癥以及奶牛乳房炎；另一種則是毒素性疾病，主要是因食用被金黃色葡萄球菌污染的飼料或食物，而引起家畜或人的中毒性腸炎、腹瀉以及毒素休克綜合征等。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅳ期壓瘡合并感染患者的創(chuàng)面分泌物細(xì)菌培養(yǎng)中以金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌作為主要病原菌存在，且具有較強(qiáng)的耐藥性，因此制定合理、有效的感染預(yù)防及控制方案尤為重要[18]。對(duì)Ⅲ～Ⅳ期壓瘡伴中重度感染患兒創(chuàng)面培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性菌占50.53%，革蘭陽性菌占38.95%，其中病原體構(gòu)成比依次為為大腸埃希菌＞金黃色葡萄球菌＞表皮葡萄球菌[19]。在歐美地區(qū)近年的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌感染人數(shù)占皮膚感染和軟組織感染的76%，導(dǎo)致每年近50 萬人次住院和1 160 萬人次的門診就醫(yī)，成為公共衛(wèi)生安全的重要難題之一[20]。由于抗生素的濫用和細(xì)菌的不斷進(jìn)化，金黃色葡萄球菌的耐藥性逐年增多，尤其是MRSA 會(huì)導(dǎo)致感染程度增加、高發(fā)病率和高死亡率；加之耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，無疑增加了臨床針對(duì)MRSA 抗感染的治療難度。

3.2 丁香酚對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的破壞作用分析

本研究結(jié)果表明，丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性。通過生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)丁香酚可以有效抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，并具有濃度相關(guān)性。隨后觀察丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的完整性和細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的完整性是其存活、繁殖、感染的重要保障，然而，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞壁完整性受到破壞后，會(huì)引起細(xì)胞膜的破裂，胞內(nèi)外物質(zhì)交換發(fā)生障礙，最終導(dǎo)致菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，甚至引起菌體死亡[21]。AKP 是位于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的磷酸酶，細(xì)菌的核酸、蛋白質(zhì)存在于細(xì)菌內(nèi)部，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變，膜通透性變化，就會(huì)引起內(nèi)容物的泄漏[22]。丁香酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)中的羥基、γ 位置的甲基等基團(tuán)均可以改變細(xì)菌膜的通透性以及完整性[23]。本研究結(jié)果可見，1/2 MIC 和MIC 丁香酚處理后，培養(yǎng)液中的核酸（A260）、蛋白（A280）以及AKP 活性顯著增加，對(duì)NPN 和PI 的攝取增加。掃描電鏡和透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)丁香酚處理后金黃色葡萄球菌菌體皺縮、穿洞、破碎，丁香酚能夠引起菌體形態(tài)發(fā)生顯著變化，且其變化情況與丁香酚的濃度呈正相關(guān)。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的破壞和滲透，增加細(xì)胞膜的通透性，損害細(xì)胞壁的完整性，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物泄漏。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，丁香酚對(duì)MRSA 細(xì)胞壁的完整性損傷要強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的損傷。

3.3 丁香酚對(duì)細(xì)菌生物膜的破壞作用分析

BF 的特性為傷口或創(chuàng)面中的致病菌增殖和感染提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，保護(hù)它們免受宿主免疫系統(tǒng)和抗生素的侵害。被生物膜包裹的致病菌對(duì)抗生素的耐受度是浮游菌的10～1 000 倍，所以這些致病菌不僅很難從傷口部位根除，還會(huì)延遲傷口或創(chuàng)面的愈合[24]。傷口愈合的過程可分為4 個(gè)階段：凝血止血、炎癥、增生和重塑，由于免疫細(xì)胞無法在傷口部位積聚以根除BF，所以創(chuàng)口處BF 的形成被認(rèn)為是在炎癥階段[25]。同時(shí)，這種免疫細(xì)胞的積累刺激了傷口部位持續(xù)的炎癥狀態(tài)，延緩了上皮細(xì)胞的形成和閉合。BF 對(duì)慢性傷口的影響為80%，在急性傷口中相對(duì)較低為6%。然而，在急性傷口模型的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，BF 最早可在創(chuàng)傷后3 d 即可形成，這說明BF 可能在急性感染進(jìn)展中也有作用，作為更深層的入侵方式，導(dǎo)致菌血癥和敗血癥[26-28]。因此近年來研究焦點(diǎn)關(guān)注于BF 參與皮膚疾病的發(fā)生與發(fā)展。

抗生素的大規(guī)模使用導(dǎo)致耐藥性菌株廣泛傳播，這已成為較嚴(yán)重的全球問題，而BF 的生成會(huì)增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性，因此亟待尋求有效的治療方案來解決這一難題。研究表明，包括丁香酚在內(nèi)的其他精油成分，如反式肉桂醛、香茅醇和萜品醇等化合物已被證實(shí)能夠有效清除細(xì)菌的BF，通過血小板計(jì)數(shù)、刃天青染料還原實(shí)驗(yàn)、PI 染色并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦激光掃描顯微鏡等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精油成分對(duì)大腸桿菌BF 的清除作用，發(fā)現(xiàn)3 mmol/L丁香酚能夠破壞BF 的形成，導(dǎo)致生物膜內(nèi)包裹的細(xì)菌代謝活性（49%）和增殖能力（84%）顯著降低[29]。金黃色葡萄球菌形成的復(fù)雜細(xì)胞外聚合生物膜結(jié)構(gòu)，為微菌落的形成、繁殖、維持和擴(kuò)散及再定植提供了保障[30]。當(dāng)細(xì)菌感受到外界環(huán)境的壓力后，會(huì)分泌黏性基質(zhì)包裹在細(xì)菌表面，維持細(xì)菌聚合結(jié)構(gòu)，抵抗外界不良因素的攻擊并且提高菌群間的能量轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)菌存活[31]。與許多其它微生物功能一樣，金黃色葡萄球菌生物膜形成和擴(kuò)散與某些BF相關(guān)基因密不可分。細(xì)胞間黏附基因icaABCD可以編碼細(xì)菌細(xì)胞之間的黏附過程，并且可以啟動(dòng)BF 的形成[32]。fnbAB 基因編碼FnbA 和FnbB 蛋白，是金黃色葡萄球菌表面識(shí)別黏附基質(zhì)分子（MSCRAMMS）中的一份子，能夠幫助細(xì)菌附著于宿主細(xì)胞表面以形成BF[31]；ClfA 和ClfB 蛋白由clfA、clfB基因編碼，也是金黃色葡萄球菌表面的MSCRAMMS 蛋白，能夠促進(jìn)金黃色葡萄球菌在宿主的定殖，從而促進(jìn)BF 的形成[33]。

本研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚對(duì)BF 形成的抑制作用隨著其濃度的升高而增強(qiáng)，對(duì)成熟BF 的清除作用趨勢(shì)同對(duì)BF 形成的抑制作用保持一致，并且隨丁香酚濃度的增大，其對(duì)成熟BF 的清除能力亦越強(qiáng)。1/2 MIC 和MIC 丁香酚可以抑制BF 的生成，促進(jìn)成熟BF 的清除，同時(shí)可以顯著下調(diào)了BF 相關(guān)的毒力因子sarA、agrA、icaA、cidA、clfA、clfB、fnbA、fnbB基因表達(dá)水平；這表明丁香酚可能通過抑制sarA、agrA 基因的表達(dá)來調(diào)控icaA 操縱子和cidA操縱子。在整個(gè)BF 形成過程中金黃色葡萄球菌黏附因子（clfA、clfB、fnbA、fnbB基因）對(duì)細(xì)菌黏附聚集發(fā)揮重要作用。由此可見，丁香酚可通過抑制BF 形成過程中的相關(guān)毒力因子的表達(dá)，調(diào)控icaA和cidA 操縱子，來抑制細(xì)菌黏附聚集在宿主細(xì)胞表面，進(jìn)而控制BF的成熟。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丁香酚對(duì)MRSA的抑菌效果更甚于標(biāo)準(zhǔn)菌株，對(duì)膜結(jié)構(gòu)的破壞作用更明顯，根據(jù)這一結(jié)果推測(cè)丁香酚不受MRSA 耐藥菌體中與其耐藥有關(guān)的基因或毒力因子的影響，甚至可能因?yàn)槠淠退幒笈c敏感株相比靶點(diǎn)改變的原因，導(dǎo)致丁香酚可以發(fā)揮更大的抑菌作用。本研究結(jié)果顯示丁香酚對(duì)MRSA 的抑菌效果更甚于標(biāo)準(zhǔn)菌株及對(duì)MRSA 細(xì)胞壁的完整性損傷要強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的損傷，綜合分析可能與其交互敏感現(xiàn)象存在密切關(guān)系，有關(guān)耐藥細(xì)菌附帶敏感性或交互敏感性機(jī)制目前尚未明確[34]，以此作為切入點(diǎn)有望成為對(duì)耐藥病原菌感染防治研究的突破口，亦或是艾灸促進(jìn)壓瘡等皮膚損傷創(chuàng)面修復(fù)發(fā)揮療效的潛在因素之一。

3.4 局限性和未來研究方向

丁香酚可以破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性及細(xì)胞膜的通透性，抑制菌活力，發(fā)揮直接抑菌作用；同時(shí)可以抑制BF 的生成及促進(jìn)成熟BF 的清除，抑制細(xì)菌BF 形成和擴(kuò)散相關(guān)毒力因子的表達(dá)，具有較好的抑菌活性，從不同方面限制了金黃色葡萄球菌的致病能力，這可能是艾灸促進(jìn)壓瘡創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制之一。但是在金黃色葡萄球菌感染過程中，丁香酚對(duì)宿主細(xì)胞的保護(hù)作用還需進(jìn)一步研究。本項(xiàng)目組前期致力于艾灸防治壓瘡的效應(yīng)及機(jī)制研究，特別對(duì)于艾灸促進(jìn)壓瘡組織血管新生及調(diào)控巨噬細(xì)胞極化方面取得一定進(jìn)展[12-17]。金黃色葡萄球菌作為壓瘡創(chuàng)面最主要存在病原菌之一，嚴(yán)重阻礙并延遲創(chuàng)面的愈合，丁香酚作為艾灸艾煙化學(xué)成分的主要藥效成分之一，不僅具有顯著的抑菌活性，還可以用作抗生素的增敏劑，本項(xiàng)目組將繼續(xù)以此作為切入點(diǎn)，進(jìn)一步通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來探討丁香酚對(duì)MRSA 及金黃色葡萄球菌生物膜及黏附侵襲的抑制效果以及對(duì)金黃色葡萄球菌引發(fā)炎癥的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，以期為丁香酚在防治金黃色葡萄球菌引起皮膚感染及壓瘡提供理論依據(jù)，更深層次、多維度探討艾灸促進(jìn)壓瘡等皮膚損傷創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制，豐富該類疾病的防治策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突