汪洋，張輝，伍冬冬，王靜，吳秋歌

鄭州大學第一附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科，河南 鄭州 450052

急性肺損傷是由諸多致病因素導致肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷進而引發(fā)的急性低氧性呼吸功能不全，致病因素包括感染、膠原血管病、藥物作用、誤吸、休克、急性嗜酸性粒細胞性肺炎、免疫介導的肺出血和血管炎以及放射性肺炎等[1]。早期臨床表現為急性進行性加重的呼吸困難、呼吸窘迫、難治性低氧血癥和非心源性肺水腫，進一步發(fā)展至嚴重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征，可導致呼吸衰竭和死亡。急性肺損傷的發(fā)病機制復雜，比較公認的是肺內炎癥因子大量釋放與激活使肺內炎癥反應失控[2]。目前臨床上尚無急性肺損傷的特效治療手段，常規(guī)治療主要是通過肺保護性通氣策略、氣道壓力釋放通氣（APRV）、高頻振蕩通氣（HFOV）、體外膜肺氧合（ECMO）和藥物干預如糖皮質激素激素、β2受體激動劑、他汀類藥物、骨髓間充質干細胞等限制其發(fā)展，減少肺內皮和上皮屏障的炎癥[3-4]。另外，一些中藥和天然活性成分通過抗炎和抗氧化應激作用在防治急性肺損傷中療效顯著[5-8]，且因天然活性成分藥效明確、不良反應低，具有較好的臨床應用前景。知母皂苷元是從中藥知母中分離得到的有效成分，研究表明知母皂苷元具有抗腫瘤、抗阿爾茨海默病、抗凝血、降血糖、調血脂、抗炎等多種藥理活性[9]。鐘艷梅等[10]發(fā)現知母皂苷元可通過下調核因子-κB（NF-κB）-誘導型一氧化氮合酶（iNOS）-一氧化氮（NO）通路抑制脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7 細胞中炎癥因子的釋放發(fā)揮保護作用。鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激因子（STING）信號通路的激活在免疫炎癥應答中的作用受到廣泛關注。

本研究基于cGAS-STING 通路探討知母皂苷元對脂多糖（LPS）誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用，為防治急性肺損傷藥物的研究提供新的靶點和思路。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級昆明小鼠60 只（雌性，6 周齡，體質量18～22 g，西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心），許可證號SCXK（陜）2020-001。分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，適應性喂養(yǎng)1 周后開展實驗，動物實驗經鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（批準號2020-KY-125）。

1.2 材料與儀器

1.2.1 藥物與試劑 知母皂苷元（質量分數＞98%，成都普瑞法公司，批號BP1257）；LPS（美國Sigma公司，批號JP0284）；地塞米松磷酸鈉注射液（辰欣藥業(yè)公司，規(guī)格1 mL∶5 mg，批號1112136114）；小鼠白細胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（批號EEL-M0044）、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號E-EL-M0049）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號E-BC-K318-M）、SDS-PAGE 凝膠試劑盒（批號E-IR-R305）均購于武漢伊萊瑞特生物公司；兔抗小鼠cGAS 抗體（批號ab252416）、兔抗小鼠STING 抗體（批號ab189430）均購于美國Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（批號A21020）購于武漢亞科因公司。

1.2.2 儀器 ME54E 型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；DHG-9146A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏公司）；BX 53 OLYMPUS 顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；MY-10 電動組織研磨器（上海凈信公司）；M1324R 臺式高速冷凍離心機（深圳市瑞沃德公司）；Infinite200 多功能酶標儀（瑞士帝肯公司）；通用型電泳儀（美國伯樂公司）；Amersham Imager 600 凝膠成像分析儀（美國通用電氣公司）。

2 方法

2.1 動物分組、給藥與造模

60 只昆明小鼠隨機分為對照組、模型組、地塞米松組及知母皂苷元50、100、200 mg/kg 組。知母皂苷元50、100、200 mg/kg 組小鼠ig 給予相應劑量的知母皂苷元溶液，地塞米松組小鼠ip 地塞米松磷酸鈉注射液0.5 mg/kg，對照組和模型組ig 等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)7 d。末次給藥1 h 后，其余各組小鼠除對照組外均ip 10 mg/kg LPS 溶液復制小鼠急性肺損傷模型[11]。

2.2 肺組織濕/干質量比（W/D）測定

造模后6 h 取各組小鼠左肺組織，除去血漬后濾紙吸干，精密稱量，即為濕質量；恒溫干燥箱中放置24 h（80 ℃），烘干后稱量，即為干質量，計算各組小鼠肺組織W/D。

2.3 蘇木精–伊紅（HE）染色法觀察肺組織病理學

造模后6 h 取各組小鼠的肺組織，4%多聚甲醛固定，脫水、浸蠟、包埋、切片，脫蠟后進行HE 染色，利用光學顯微鏡觀察肺組織病理形態(tài)學變化。

2.4 血清中IL-6、TNF-α 水平測定

造模后6 h 摘小鼠眼球取全血，3 500 r/min 離心10 min（4 ℃），分離上清，嚴格按照試劑盒說明書檢測小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平。

2.5 肺組織中cGAS、STING 的蛋白表達測定

造模后6 h 取各組小鼠的肺組織，加入蛋白裂解液機械研磨，BCA 法進行蛋白定量。樣品置于95 ℃水浴鍋煮沸10 min，12 000 r/min 離心10 min（4 ℃），取上清上樣后依次進行SDS-PAGE 電泳、轉膜、1 脫脂牛奶封閉，再分別加入cGAS、STING、β-actin 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。洗膜后加入二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)中成像，采用Image J 軟件進行灰度分析。以目的蛋白與β-actin 的灰度值表示目的蛋白的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計處理，所有數據結果以表示，采用單因素方差分析進行組間比較，采用LSD 法進行兩兩比較。

3 結果

3.1 知母皂苷元對小鼠肺組織W/D 的影響

與模型組相比，地塞米松組及知母皂苷元200 mg/kg 組小鼠肺組織W/D 顯著降低（P＜0.05）；知母皂苷元50、100 mg/kg 組小鼠肺組織W/D 呈降低趨勢，差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 知母皂苷元對小鼠肺組織W/D 的影響（，n=10）Table 1 Effects of sarsasapogenin on lung W/D in mice(,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group

3.2 知母皂苷元對小鼠肺組織病理學的影響

對照組小鼠肺組織結構清晰完整，肺泡壁無水腫、增厚、液體滲出等炎癥表現，未見炎癥細胞浸潤。模型組小鼠肺泡壁明顯增厚，有水腫、出血及少許液體滲出現象，且有大量炎癥細胞浸潤。地塞米松組和知母皂苷元各劑量組小鼠肺泡水腫、出血、滲出程度較模型組較輕，損傷情況均有所改善，見圖1。

圖1 知母皂苷元對小鼠肺組織病理學的影響（×200）Fig.1 Effects of sarsasapogenin on histopathological changes of lung in mice (× 200)

3.3 知母皂苷元對小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影響

與模型組相比，地塞米松組和知母皂苷元各劑量組小鼠血清中的IL-6 和TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.05），且呈劑量相關性，見表2。

表2 知母皂苷元對小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影響（，n=10）Table 2 Effects of sarsasapogenin on the serum levels of IL-6 and TNF-α in mice (,n=10)

表2 知母皂苷元對小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影響（，n=10）Table 2 Effects of sarsasapogenin on the serum levels of IL-6 and TNF-α in mice (,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group

3.4 知母皂苷元對小鼠肺組織中cGAS、STING 蛋白表達的影響

與模型組相比，地塞米松組小鼠肺組織中cGAS、STING 的蛋白表達均有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義；知母皂苷元各劑量組小鼠肺組織中STING 的蛋白表達均顯著降低，知母皂苷元100、200 mg/kg 組小鼠肺組織中cGAS 的蛋白表達顯著降低（P＜0.05），下降趨勢呈劑量相關性，結果見圖2、表3。

圖2 知母皂苷元對小鼠肺組織中cGAS、STING 蛋白表達的影響Fig.2 Effect of sarsasapogenin on the protein expression of cGAS and STING in the lung tissue of mice

表3 知母皂苷元對小鼠血清中肺組織中cGAS、STING 蛋白表達的影響（，n=10）Table 3 Effects of sarsasapogenin on the protein expression of cGAS and STING in the lung tissue of mice(,n=10)

表3 知母皂苷元對小鼠血清中肺組織中cGAS、STING 蛋白表達的影響（，n=10）Table 3 Effects of sarsasapogenin on the protein expression of cGAS and STING in the lung tissue of mice(,n=10)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group

4 討論

急性肺損傷是臨床常見的急危重癥，其病因極其復雜，一般分為肺內因素和肺外因素2 類，包括直接和間接導致肺損傷的疾病。急性肺損傷的發(fā)病機制極其復雜，目前認可度較高的發(fā)病機制是過度的炎癥反應，促炎因子TNF-α、白細胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、白細胞介素-8（IL-8）和白細胞介素-18（IL-18）是臨床上可能預測急性肺損傷發(fā)病率和死亡率的生物標志物[1]。其中，IL-6 是IL 家族的核心成員，能夠調節(jié)細胞生長分化、急性期反應、免疫應答和造血功能的作用。促炎因子TNF-α 能直接殺傷腫瘤細胞，也能通過結合多種活性物質對組織造成間接損傷[12]，因此本研究選取IL-6 和TNF-α 作為評估急性肺損傷的檢測指標。

急性肺損傷實驗動物模型多采用LPS 誘導，該模型主要用于模擬臨床中革蘭陰性菌和感染性休克所致的肺損傷[13]。LPS 是革蘭陰性菌細胞外壁的組成成分，注射LPS 會損傷機體毛細血管內皮細胞，造成血管壁通透性增加、細胞間質水腫，引起機體急性肺損傷，從而增加了炎性細胞因子的釋放，誘發(fā)瀑布樣級聯反應，表現為全身炎癥反應綜合征[14]。本研究采用ip LPS 復制急性肺損傷小鼠模型，模型組小鼠注射LPS 后肺組織W/D 顯著升高，TNF-α、IL-6 水平顯著增加，肺組織有明顯病理損傷，表明急性肺損傷小鼠模型建立成功。

cGAS-STING 通路介導細胞凋亡、自噬過程，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，阻斷cGAS-STING 通路可抑制炎癥反應、減輕組織損傷，激活cGAS-STING通路可發(fā)揮促炎、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學效應[15]。本研究發(fā)現急性肺損傷小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平顯著升高，肺組織中cGAS、STING 的蛋白表達顯著升高，提示急性肺損傷小鼠的炎癥反應可能與激活cGAS-STING 通路有關。經知母皂苷元預處理后，急性肺損傷小鼠TNF-α、IL-6 水平均顯著降低，肺組織中cGAS、STING 的蛋白表達亦顯著降低，表明知母皂苷元可通過抑制cGAS 和STING，減少促炎因子的釋放，最終減輕LPS 誘導的急性肺損傷。研究表明，cGAS 通過識別、結合細胞質內的雙鏈DNA 進而激活STING，在高爾基體上招募并激活TANK 結合激酶1（TBK-1），從而直接激活NF-κB 通路，誘導炎癥因子的產生。TBK-1 也可招募并磷酸化下游干擾素調節(jié)因子3（IRF3），促進干擾素相關基因的表達，增加Ⅰ型干擾素的合成，從而增強機體免疫[16]。本研究中知母皂苷元可能通過激活cGAS-STING 通路，進而激活NF-κB 通路，促進TNF-α、IL-6 的產生，也可能通過磷酸化IRF3，促進干擾素的合成。但cGAS-STING 的調控機制較復雜，具體機制還需進一步探討。

一些單味中藥、中藥復方及天然活性成分如酚類、黃酮類、萜類、皂苷類、生物堿類等具有顯著的防治急性肺損傷作用，其作用機制與抑制炎癥反應、減輕氧化應激、調節(jié)機體免疫等相關[17]。研究表明，皂苷類成分如甘草酸[18]、人參皂苷[19]、遠志皂苷元[20]、柴胡皂苷[21]可通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）、NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1（Nrf2/HO-1）、NOD 樣蛋白3（NLRP3）通路發(fā)揮抗炎抗氧化作用從而對LPS 誘導的急性肺損傷發(fā)揮保護作用。本研究建立了LPS 誘導的急性肺損傷小鼠模型，發(fā)現知母皂苷元可通過抑制cGAS-STING 通路，減少TNF-α、IL-6 的釋放，進而改善肺組織病理損傷，對急性肺損傷模型小鼠具有一定保護作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突