黎 俏, 余建華, 薛永杰, 陳海霞, 賴放穎,全 燕, 何韶堅(jiān), 翁光明, 高天旸

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院, 廣東 廣州, 510515; 東莞康華醫(yī)院, 2. 生殖醫(yī)學(xué)科, 3. 血液中心實(shí)驗(yàn)室,4. 病理科, 廣東 東莞, 523080; 5. 廣東省第二人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心, 廣東 廣州, 510310)

在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)周期中,胚胎著床率約30%[1]。反復(fù)著床失敗(RIF)的發(fā)生率可達(dá)5%～10%[2]。近年來關(guān)于慢性子宮內(nèi)膜炎(CE)或免疫因素密切影響RIF預(yù)后的相關(guān)研究越來越多[3]。CD138檢測(cè)的CE患病率在RIF患者中為7.7%～44.0%[4]。CE持續(xù)炎癥將影響患者子宮內(nèi)膜容受性,從而造成RIF、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RM)等不良妊娠結(jié)局[5-6]。有研究[7]推測(cè)CE引起RIF的機(jī)制之一是病原微生物的入侵可能影響宮腔定植微生物,使子宮自然殺傷(uNK)細(xì)胞激活及T細(xì)胞亞群分化異常等,影響子宮的免疫環(huán)境,使子宮內(nèi)膜容受性下降,導(dǎo)致胚胎植入失敗、胎盤形成不良。

人類子宮在生理狀態(tài)下含有大量的免疫細(xì)胞,特別是自然殺傷(NK)細(xì)胞[8]。uNK細(xì)胞與外周血自然殺傷(PbNK)細(xì)胞在活性、表型、功能和形態(tài)方面完全不同[9-10]。相較于PbNK細(xì)胞, uNK細(xì)胞是一種具有高度免疫調(diào)節(jié)性的NK細(xì)胞,可分泌細(xì)胞因子以促進(jìn)血管新生和組織重構(gòu)[11]。目前,大多數(shù)研究都采用CD56+CD16-uNK分型來鑒定uNK細(xì)胞,較少提及CD56+CD16+uNK細(xì)胞的功能。本研究分析了東莞康華醫(yī)院生殖中心RIF患者資料,探索RIF合并CE與uNK細(xì)胞的關(guān)系,評(píng)估合并CE的RIF患者外周血和子宮內(nèi)膜的免疫狀態(tài),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月—2023年2月就診于生殖醫(yī)學(xué)中心的年齡<40歲的82例患者為RIF組,均接受過IVF-ET移植3次及以上或移植高評(píng)分卵裂期胚胎數(shù)4～6個(gè)或高評(píng)分囊胚數(shù)3個(gè)及以上,但均未獲得臨床妊娠者[2]。另選擇同期在本中心行IVF-ET助孕的年齡<40歲的有IVF助孕妊娠活產(chǎn)史且擬再次助孕的82例患者為對(duì)照組。

納入標(biāo)準(zhǔn): ① 年齡<40歲者; ② 因盆腔輸卵管因素行IVF助孕治療者; ③月經(jīng)周期正常且規(guī)律者(26～31 d); ④ 夫妻雙方染色體正常者; ⑤ 生殖解剖結(jié)構(gòu)正常者; ⑥ 內(nèi)分泌正常者; ⑦ 無自身免疫性疾病者; ⑧ 無高凝血傾向者; ⑨ 無全身感染癥狀者; ⑩ 男方精液檢查正常者。

排除標(biāo)準(zhǔn): ① 體質(zhì)量指數(shù)(BMI)<18 kg/m2或>28 kg/m2者; ② 染色體異常者; ③ 生殖器官畸形者; ④ 輸卵管積液者,子宮內(nèi)膜異位癥或腺肌癥者; ⑤ 內(nèi)分泌指標(biāo)異常者(合并糖尿病或高血壓或代謝性疾病); ⑥ 系統(tǒng)性紅斑狼瘡者(LA抗體陽性); ⑦ 自身抗體陽性者(抗核抗體、甲狀腺抗體、類風(fēng)濕因子等); ⑧ 卵巢儲(chǔ)備功能減退者; ⑨ 子宮內(nèi)膜不典型增生者; ⑩ 丈夫精液異常者。本研究開展前已獲得東莞康華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均已告知實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要儀器: 貝克曼庫爾特Navios型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2.2 標(biāo)本采集: 采用促黃體生成素(LH)測(cè)定試紙,于尿LH峰值出現(xiàn)后,在陰道B超監(jiān)測(cè)排卵后第7～9天,采用子宮內(nèi)膜取樣器吸取2份少量子宮內(nèi)膜組織,一份采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)子宮內(nèi)膜CD56+CD16+uNK細(xì)胞水平; 另一份采用免疫組化方法檢測(cè)CD138。CD138陽性作為診斷CE的依據(jù)。

1.2.3 外周血: 所有受試者近3個(gè)月未服用任何甾體激素類藥物,于月經(jīng)來潮第2～5天空腹采集肘部靜脈血液3～4 mL, 送檢驗(yàn)科檢測(cè)促卵泡激素(FSH)、LH、雌二醇(E2)、孕酮(P)等水平; 超聲監(jiān)測(cè)排卵后第7～9天的黃體中期,采用EDTA-K3采血管采集空腹肘靜脈血液3～4 mL, 并檢測(cè)PbNK細(xì)胞、血常規(guī)。

1.2.4 子宮內(nèi)膜組織: 超聲監(jiān)測(cè)排卵后第7～9天,采用一次性內(nèi)膜取樣器取少量?jī)?nèi)膜,置于添加生理鹽水的無菌容器中保存。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜及外周血CD56+CD16+NK細(xì)胞表型的絕對(duì)計(jì)數(shù)方法: 采取流式細(xì)胞儀結(jié)合血細(xì)胞分析儀雙平臺(tái)絕對(duì)計(jì)數(shù)方法,首先通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光抗體標(biāo)記呈陽性細(xì)胞百分比,然后利用血細(xì)胞分析儀獲得總細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)值,兩者乘積得到所檢測(cè)樣本中熒光標(biāo)記呈陽性細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)值。

1.2.6 免疫組化結(jié)果的判定及CE的診斷: CD138在子宮內(nèi)膜分泌期表達(dá),主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和腔上皮細(xì)胞,呈深棕色染色,腺上皮細(xì)胞比間質(zhì)細(xì)胞和腔上皮染色更強(qiáng),見圖1。CE的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[12]。免疫組化染色后CD138在漿細(xì)胞膜為強(qiáng)陽性,胞質(zhì)為弱陽性。每高倍鏡視野下,子宮內(nèi)膜間質(zhì)中見到5個(gè)或以上典型的漿細(xì)胞,則診斷為CE; 見到5個(gè)以下典型的漿細(xì)胞,診斷為非CE。制片全過程均由有資質(zhì)的技術(shù)員按照操作規(guī)范完成,病理診斷由具有獨(dú)立發(fā)放報(bào)告的診斷醫(yī)生共同完成閱片以及復(fù)核,每張片子均需要2位及以上病理科副主任醫(yī)師復(fù)核。

1.3 CE的治療及妊娠結(jié)局的追蹤

1.3.1 CE的治療及治療后復(fù)查: ① 對(duì)于確診的CE患者,全身性使用抗生素是目前公認(rèn)的治療方法,口服抗生素為主要給藥方式。本研究CE陽性患者采用口服鹽酸多西環(huán)素片(100 mg, 2次/d, 用藥14 d)聯(lián)合甲硝唑片(400 mg, 2次/d, 用藥14 d)治療[13]。② 治療結(jié)束后下次月經(jīng)周期黃體期時(shí),采用子宮內(nèi)膜取樣器吸取少量子宮腔內(nèi)膜組織,采用免疫組化進(jìn)行CE病理診斷。

1.3.2 CE患者的移植周期及內(nèi)膜準(zhǔn)備方法: CE患者完成1個(gè)療程抗炎治療且再次復(fù)查后,于月經(jīng)第2～3天B超及性激素[LH、E2、P、人絨毛膜促性腺激素(HCG)]結(jié)果達(dá)基礎(chǔ)狀態(tài)后,采用激素替代治療(HRT)方案。口服戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂, 1 mg/片, 拜耳醫(yī)藥制藥)12 d(4～6 mg/d)后,超聲監(jiān)測(cè)內(nèi)膜厚度和雌二醇、LH、P水平,若內(nèi)膜≥8 mm時(shí),給予黃體酮(黃體酮注射液, 20 mg/支,浙江仙琚制藥)60 mg/d肌內(nèi)注射及地屈孕酮片(達(dá)芙通, 10 mg/片,荷蘭蘇威制藥)40 mg/d口服; 于黃體支持轉(zhuǎn)化內(nèi)膜后行D3或D5胚胎移植,移植后繼續(xù)給予黃體支持: 黃體酮陰道緩釋凝膠(雪諾酮, 90 mg/支,默克雪諾蘭制藥)90 mg/d陰道給藥及地屈孕酮片(達(dá)芙通, 10 mg/片,荷蘭蘇威制藥)40 mg/d口服。

1.3.3 妊娠標(biāo)準(zhǔn)與觀察指標(biāo): 胚胎移植后10 d檢測(cè)血HCG水平,陽性者2周后超聲檢查見孕囊確診為臨床妊娠。觀察不同分組患者的臨床妊娠結(jié)局。臨床妊娠率=臨床妊娠周期/總移植周期×100%; 著床率=胚胎著床數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%; 早期流產(chǎn)率=孕12周內(nèi)自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

A: 放大400倍表現(xiàn); B: 放大200倍表現(xiàn); C: 放大100倍表現(xiàn)。深棕色染色為陽性反應(yīng)。圖1 顯微鏡下不同放大倍數(shù)免疫組化檢測(cè)CD138的表達(dá)與定位(SP法)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)描述為均值±標(biāo)準(zhǔn)差, RIF組和對(duì)照組的參數(shù)數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)。RIF組合并CE、RIF組無合并CE、對(duì)照組合并CE、對(duì)照組無合并CE的黃體中期內(nèi)CD56+CD16+uNK、CD56+CD16+PbNK細(xì)胞水平比例的分析采用卡方檢驗(yàn),組間CE治療后臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率的分析采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson相關(guān)系數(shù)確定uNK與PbNK的相關(guān)程度,采用簡(jiǎn)單線性回歸進(jìn)行線性擬合。

2 結(jié) 果

2.1 RIF組與對(duì)照組的一般資料比較

2組年齡、不孕年限、基礎(chǔ)卵泡數(shù)、基礎(chǔ)性激素水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見表1。

表1 2組患者一般資料比較

2.2 2組NK細(xì)胞水平的比較

RIF組CD56+CD16+uNK細(xì)胞水平為(34.23±17.01)%, 低于對(duì)照組的(45.41±20.90)%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); RIF組黃體中期外周血中CD56+CD16+PbNK細(xì)胞水平為(14.38±5.36)%, 與對(duì)照組的(13.58±4.34)%比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); RIF組與對(duì)照組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。子宮內(nèi)膜CD56+CD16+uNK細(xì)胞水平與外周血CD56+CD16+PbNK細(xì)胞水平無相關(guān)性(r=0.06), 見圖2。

表2 2組免疫細(xì)胞水平及外周血血常規(guī)指標(biāo)比較

圖2 子宮內(nèi)膜uNK細(xì)胞與外周血PbNK細(xì)胞水平的相關(guān)性分析(相關(guān)系數(shù)r=0.06)

2.3 2組合并CE時(shí)CD56+CD16+uNK細(xì)胞比較

RIF組合并CE與無合并CE、對(duì)照組合并CE與無合并CE的黃體中期內(nèi)膜中CD56+CD16+uNK細(xì)胞、外周血中CD56+CD16+PbNK細(xì)胞水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 RIF組及對(duì)照組組內(nèi)合并與無合并CE時(shí)免疫細(xì)胞水平比較

2.4 2組CE治療后妊娠結(jié)局比較

在RIF組合并CE、對(duì)照組合并CE患者中,治療后CE轉(zhuǎn)陰與CE仍為陽性者的年齡、移植日內(nèi)膜厚度、平均移植胚胎數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 在RIF組合并CE及對(duì)照組合并CE患者中,治療后CE轉(zhuǎn)陰者較CE仍為陽性者的臨床妊娠率、著床率均升高,早期流產(chǎn)率降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組CE治療后妊娠結(jié)局比較

3 討 論

胚胎因素、子宮因素、母體免疫異常等原因均可導(dǎo)致胚胎著床失敗。本研究結(jié)果顯示,伴有CE時(shí), RIF組及對(duì)照組臨床妊娠率、著床率均下降,在經(jīng)CE治療轉(zhuǎn)陰后,臨床妊娠率、著床率均顯著升高,早期流產(chǎn)率顯著降低(P<0.05)。CE持續(xù)炎癥的環(huán)境影響子宮內(nèi)膜的容受性,相關(guān)機(jī)制可能與CE引起的內(nèi)膜免疫異常、容受分子表達(dá)異常、蛻膜化異常和內(nèi)膜蠕動(dòng)異常等有關(guān),也與CE患者存在病原菌感染或合并黏膜下肌瘤、息肉、子宮內(nèi)膜異位癥等有關(guān)[14]。因此, CE對(duì)胚胎著床的影響極大, CE的確診和治療應(yīng)作為反復(fù)著床失敗評(píng)估的重要因素。當(dāng)RIF合并CE時(shí),應(yīng)合理治療CE,而不是單純采用免疫療法治療免疫細(xì)胞紊亂。

研究[15]表明uNK細(xì)胞數(shù)量在植入前和妊娠孕早期急劇上升,可達(dá)到蛻膜淋巴細(xì)胞的3/4,隨著滋養(yǎng)細(xì)胞侵入結(jié)束及胚胎逐步形成, uNK細(xì)胞慢慢發(fā)生凋亡,數(shù)目逐漸減少、消失。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), RIF組黃體中期CD56+CD16+uNK細(xì)胞水平顯著低于對(duì)照組,提示CD56+CD16+uNK細(xì)胞可能影響了RIF的過程。uNK細(xì)胞保護(hù)妊娠的機(jī)制可能是在胚胎植入后, uNK細(xì)胞通過表型轉(zhuǎn)變和受體及細(xì)胞因子譜的改變、增強(qiáng)對(duì)微生物感染的抵抗、子宮螺旋動(dòng)脈的重構(gòu)、加強(qiáng)免疫耐受等途徑來促進(jìn)成功妊娠[16]。在種植窗時(shí)期, uNK和其他免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、T-reg細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等通過分泌正常妊娠需要的細(xì)胞因子和血管形成因子,控制螺旋動(dòng)脈原位細(xì)胞的遷移,使滋養(yǎng)細(xì)胞向內(nèi)膜適度遷移[17-18]。若滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足,則發(fā)生免疫功能失衡,這種免疫失衡會(huì)導(dǎo)致外周和子宮蛻膜的慢性炎癥反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致妊娠丟失等相關(guān)病理狀況[19-20]。

本研究結(jié)果還顯示, RIF組與對(duì)照組黃體中期外周血中CD56+CD16+PbNK細(xì)胞水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PbNK細(xì)胞是一種循環(huán)在外周血中的自然殺傷淋巴細(xì)胞,既往研究[21-22]多提示RIF患者PbNK細(xì)胞水平比正常生育史人群升高,其原因可能是血液檢測(cè)的PbNK結(jié)果受患者外周血狀態(tài)的變化影響[23], 從而產(chǎn)生偏倚。本研究檢測(cè)PbNK時(shí)同時(shí)檢測(cè)患者血常規(guī)狀態(tài),發(fā)現(xiàn)RIF組與對(duì)照組血常規(guī)中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比及中性粒細(xì)胞百分比均無顯著差異。此外,每個(gè)生殖機(jī)構(gòu)對(duì)人體內(nèi)正常的PbNK細(xì)胞水平并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),因此PbNK細(xì)胞正常范圍可能非常寬泛,在該范圍內(nèi)對(duì)個(gè)人的妊娠狀態(tài)或許沒有明顯的影響[24]。

本研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜CD56+CD16+uNK細(xì)胞水平與外周血CD56+CD16+PbNK細(xì)胞水平無相關(guān)性(r=0.06), 提示uNK細(xì)胞和PbNK細(xì)胞具有不同的表型和功能特征。uNK在生殖過程中扮演有益角色,是實(shí)現(xiàn)胚胎植入、維持妊娠的基礎(chǔ)保障。母體淋巴細(xì)胞里的T細(xì)胞和大量獨(dú)特的uNK細(xì)胞可以識(shí)別子宮母胎界面的胎盤細(xì)胞,存在多種避免T細(xì)胞損傷胎兒的保護(hù)機(jī)制,從而猜測(cè)uNK細(xì)胞的激活可能是生理性的[25]。

局部?jī)?nèi)膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)滲出會(huì)改變子宮內(nèi)膜微環(huán)境,影響子宮內(nèi)膜容受性,不利于胚胎著床,最終可能導(dǎo)致RIF[26]。在RIF患者中,不同表型的uNK細(xì)胞計(jì)數(shù)水平也提示不同的致病機(jī)制,而這些改變是內(nèi)源性免疫功能障礙所固有的,還是由外源性因素(如微生物群和病原體的改變)引起的,目前仍有待闡明。有研究[27]顯示在CE狀態(tài)下,子宮內(nèi)膜分泌的細(xì)胞因子等表達(dá)異常,表現(xiàn)為促炎因子分泌增多,抗炎因子分泌降低,影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖與凋亡,導(dǎo)致母-胎界面的免疫平衡被打破,同時(shí)對(duì)胚胎產(chǎn)生細(xì)胞毒作用,影響胚胎植入過程。另有研究[28]分析其機(jī)制為CE可能通過雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)的異常表達(dá)減弱子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞對(duì)孕激素的反應(yīng)性,促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖潛能而抑制其分化潛能,影響蛻膜化的發(fā)生,對(duì)胚胎植入產(chǎn)生不利影響。研究發(fā)現(xiàn),在RM患者中,與非CE組相比,CE對(duì)CD56+uNK細(xì)胞的比例無顯著影響[29]。本研究進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn),在RIF組、對(duì)照組中,合并CE者較無合并CE者的黃體中期內(nèi)膜中CD56+CD16+uNK細(xì)胞、外周血中CD56+CD16+PbNK細(xì)胞水平均無顯著差異(P>0.05), 與前述報(bào)道相符合。黃體時(shí)期孕酮升高,該時(shí)期70%的子宮內(nèi)膜是CD56+NK細(xì)胞,當(dāng)黃體期即將結(jié)束時(shí),孕酮水平下降,uNK細(xì)胞逐漸凋亡。因此,孕酮依賴的蛻膜細(xì)胞和uNK細(xì)胞的合作使基質(zhì)向可接受植入的蛻膜基質(zhì)轉(zhuǎn)化[30]。本研究所有受試者均于B超監(jiān)測(cè)排卵后第7～9天的黃體中期取子宮內(nèi)膜活檢標(biāo)本,精確的同一時(shí)間段進(jìn)行活檢可以減少結(jié)果中的誤差。

綜上所述, CD56+CD16+uNK細(xì)胞低表達(dá)可能導(dǎo)致母胎界面免疫紊亂,從而增加RIF發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn); 外周血CD56+CD16+PbNK細(xì)胞與子宮內(nèi)膜CD56+CD16+uNK細(xì)胞無相關(guān)性; 抗生素治療CE能明顯改善RIF患者的妊娠結(jié)局, CE的確診和治療應(yīng)作為RIF評(píng)估的重要因素。