易元慧, 許丁帆, 董洪雨, 劉艷軍

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院, 天津 300384)

甜瓜(CucumismeloL.)為葫蘆科一年生蔓性草本植物,又名哈密瓜、香瓜等。甜瓜可溶性糖含量高,且含有維生素C、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。近年來(lái),中國(guó)的甜瓜國(guó)際貿(mào)易發(fā)展迅速,但市場(chǎng)上抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良品種較少,優(yōu)良種質(zhì)資源的缺乏使得生產(chǎn)成本不斷增加、生產(chǎn)技術(shù)難以支撐,制約了中國(guó)甜瓜產(chǎn)業(yè)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的提升[2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)甜瓜的研究主要是栽培技術(shù)以及選種育種等方面[3-7],有關(guān)甜瓜的愈傷組織研究也較多,但多采用器官誘導(dǎo)不定芽等建立再生體系[8-12],這種再生苗生長(zhǎng)勢(shì)弱,遺傳穩(wěn)定性低,大大制約了種質(zhì)資源創(chuàng)新、誘變育種等技術(shù)的發(fā)展。松散型胚性愈傷組織是具有獨(dú)特性質(zhì)的愈傷組織,主要由彼此聯(lián)系且松散的愈傷組織細(xì)胞構(gòu)成,特點(diǎn)是其具有一定的胚性,即這些細(xì)胞可以在一定條件下經(jīng)過(guò)分化與分裂,逐步發(fā)育成胚狀體,進(jìn)而形成一個(gè)完整植株。形成的再生體系能為植物組織脫毒、轉(zhuǎn)基因育種等研究提供平臺(tái),從而有效解決甜瓜生產(chǎn)中枯萎病、炭疽病等[13-14]病蟲害以及坐果、含糖量等[15-16]問題。

松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是組織培養(yǎng)方法的一大創(chuàng)新,目前未見甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)的相關(guān)報(bào)道。本研究以甜瓜成熟葉片為外植體,誘導(dǎo)甜瓜松散型胚性愈傷組織,建立高效的甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系,為甜瓜種質(zhì)資源創(chuàng)新、植物組織脫毒、人工種子研制及遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)選用天津津潤(rùn)益農(nóng)公司提供的薄皮甜瓜。截取一段已開花結(jié)果的甜瓜葉片作為外植體。

1.2 方 法

1.2.1外植體制備與消毒

用自來(lái)水將甜瓜葉片表面沖洗干凈,剪下備用。在超凈工作臺(tái)中將葉片剪成小塊,用70%乙醇浸泡2 s,再用2%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min,消毒期間不斷搖晃,充分消毒。消毒后用無(wú)菌水將葉片表面沖洗干凈,去除次氯酸鈉殘留。將洗凈的甜瓜葉片用無(wú)菌濾紙吸干表面水分備用。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo)

以MS+7.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基,附加不同質(zhì)量濃度的激素和蔗糖,pH值調(diào)節(jié)到5.8。

將消毒處理后的甜瓜葉片在超凈臺(tái)中剪成大小0.5～1.0 cm的小塊,并將其接種到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。接種的甜瓜葉片背面朝上,保證葉片與培養(yǎng)基緊密接觸。每個(gè)三角瓶中接種5～8塊外植體,每個(gè)處理接種10瓶,重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3松散型愈傷組織的誘導(dǎo)

以MS+30 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基,附加不同質(zhì)量濃度的激素,pH值調(diào)節(jié)到5.8。

將誘導(dǎo)出的甜瓜愈傷組織從葉片外植體上切下,轉(zhuǎn)接到含有不同激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行松散型愈傷組織誘導(dǎo)。每瓶接種5塊,每個(gè)處理接種10瓶,重復(fù)3次。經(jīng)過(guò)3次繼代后,統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.4胚性愈傷組織誘導(dǎo)

以MS+7.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基,附加不同質(zhì)量濃度的激素和蔗糖,pH值調(diào)節(jié)到5.8。

將誘導(dǎo)的甜瓜松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有不同激素的MS培養(yǎng)基上,進(jìn)行松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)。每瓶接種5塊,每個(gè)處理接種10瓶,重復(fù)3次。15 d后,結(jié)合壓片觀察選擇結(jié)構(gòu)松散且細(xì)胞個(gè)體小,細(xì)胞質(zhì)濃度高,外形為球狀的愈傷組織團(tuán)進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)接。5次繼代培養(yǎng)后,統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.3 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)過(guò)程中培養(yǎng)基均采用100 mL廣口三角瓶為容器,每個(gè)三角瓶加入約30 mL的培養(yǎng)基,pH值調(diào)至5.8～6.0,121 ℃、0.1 MPa下滅菌30 min。培養(yǎng)條件均為24 h光照,光照強(qiáng)度為2 000 lx,培養(yǎng)溫度為(23±2)℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel2013軟件統(tǒng)計(jì)分析。

愈傷組織誘導(dǎo)率/%=(形成愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù))×100%;

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率/%=(核占比大于30%的細(xì)胞數(shù)/總的細(xì)胞數(shù))×100%。

用測(cè)微尺分別測(cè)量被觀測(cè)細(xì)胞核與細(xì)胞的直徑,再計(jì)算比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)情況

接種甜瓜葉片后,大約培養(yǎng)10 d,在葉片傷口部位有明顯愈傷組織。從表1可知,在不添加任何激素處理下,外植體出愈率為12.25%,顯著低于其他處理,隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng),葉片變黃,傷口褐變。在添加2,4-D的培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出愈傷組織,且2,4-D濃度為2.0 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)速度較快,在接種5 d后葉片體積膨大,15 d左右有明顯愈傷組織形成。降低蔗糖含量至20 g/L能有效地提高葉片誘導(dǎo)愈傷速度,培養(yǎng)10 d后有大量愈傷組織形成。在2,4-D的作用下誘導(dǎo)出的白色且結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較軟的松軟型愈傷組織,后期多數(shù)會(huì)褐變死亡。加入一定量的分裂素能有效控制褐變情況,當(dāng)6-BA濃度為0.1 mg/L時(shí)(圖1),愈傷組織呈黃綠色且結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬,具有多種應(yīng)用方向,可以持續(xù)誘導(dǎo),產(chǎn)生不同類型的愈傷組織。但從愈傷組織生長(zhǎng)速度和形態(tài)來(lái)看,蔗糖用量與分裂素配合使用都會(huì)對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。因此,理想的甜瓜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.1 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D+20 g/L蔗糖。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)甜瓜葉片外植體愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果Table 1 Callus induction results of Cucumis melo L. leaf explants in different media

2.2 松散型愈傷組織誘導(dǎo)情況

從表2可以看出,在原培養(yǎng)基上持續(xù)誘導(dǎo),會(huì)使得愈傷組織質(zhì)地變軟,隨著分裂素的增加,愈傷組織質(zhì)地越來(lái)越硬,過(guò)高濃度的分裂素使得生長(zhǎng)速度變慢,且結(jié)構(gòu)變得緊密。與6-BA相比分裂素KT與2,4-D組合誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)速度慢且結(jié)構(gòu)更加緊密,質(zhì)地硬,顏色呈黃色(圖2A1),細(xì)胞組織化嚴(yán)重(圖2A2),達(dá)不到理想的松散狀態(tài)。而0.5 mg/L的6-BA與2.0 mg/L 2,4-D結(jié)合處理下可以誘導(dǎo)出松散型的愈傷組織,但高濃度的2,4-D會(huì)使得愈傷組織快速生長(zhǎng),細(xì)胞分裂減少,體積膨大,形成細(xì)胞核較小的大細(xì)胞(圖2B1),導(dǎo)致愈傷組織稀軟(圖2B2),不利于后期愈傷組織的胚性化。當(dāng)降低2,4-D濃度至1 mg/L時(shí),結(jié)合0.1 mg/L低濃度的6-BA愈傷組織(圖2C1)呈現(xiàn)出結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地軟的狀態(tài)且顏色為黃白色,而壓片觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積大都呈長(zhǎng)條形,核占比小(圖2C2)。當(dāng)2,4-D濃度為1 mg/L時(shí),提高分裂素6-BA能改變愈傷組織質(zhì)地,當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí),愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬,且生長(zhǎng)速度較快,呈黃綠色(圖2D1),顯微鏡下細(xì)胞近似圓形,體積適中,數(shù)目較多(圖2D2)是松散型愈傷組織的最佳狀態(tài)。綜上所述,理想的甜瓜松散型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖。

圖1 0.1 mg/L BA+2.0 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的松軟型愈傷組織 Fig.1 Soft callus induced under 0.1 mg/L BA+2.0 mg/L 2,4-D

注:A1為外源激素KT作用下愈傷組織;A2為A1對(duì)應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);B1為高濃度(2.0 mg/L)2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織;B2為B1對(duì)應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);C1為0.1 mg/L BA+1.0 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織;C2為C1對(duì)應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);D1為理想的甜瓜松散型愈傷組織;D2為D1對(duì)應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm)。圖2 不同外源激素下誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)以及細(xì)胞學(xué)鑒定Fig.2 Callus state induced by different exogenous hormones and cytological identification

表2 不同激素配比對(duì)甜瓜松散型愈傷組織的影響Table 2 Effects of different hormone ratios on loose callus of Cucumis melo L.

2.3 松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)情況

將甜瓜松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)一段時(shí)間后,愈傷組織質(zhì)地變得較硬,顏色加深,外表光滑,不同培養(yǎng)基下愈傷組織外觀差異不大,但經(jīng)顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn),愈傷組織細(xì)胞的形態(tài)和特性有明顯差異。從表3可知,在原培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,降低2,4-D濃度,愈傷組織生長(zhǎng)速度逐漸減慢,質(zhì)地逐漸變硬,當(dāng)2,4-D濃度為0.25 mg/L時(shí),愈傷組織出現(xiàn)少量胚性細(xì)胞(圖3A1)所示,胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為18.75%,顯著高于原培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率。但愈傷組織質(zhì)地硬,游離細(xì)胞少,多數(shù)組織化,顏色呈發(fā)黃且生長(zhǎng)速度慢,老化快(圖3A2)。單一的降低2,4-D濃度可以誘導(dǎo)產(chǎn)生部分細(xì)胞胚性化,但相對(duì)高濃度的6-BA就會(huì)降低愈傷組織生長(zhǎng)速度,導(dǎo)致愈傷組織質(zhì)地過(guò)硬,出現(xiàn)組織化的現(xiàn)象。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L,2,4-D濃度為0.5 mg/L時(shí)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為15%,顯著高于1,2,3組處理,但愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)與2,4-D濃度為0.25 mg/L時(shí)相同,壓片觀察不同視野下,細(xì)胞總數(shù)少。從而說(shuō)明胚性愈傷組織的誘導(dǎo)不僅需要調(diào)節(jié)6-BA與2,4-D濃度的高低,二者比例大小的調(diào)節(jié)也至關(guān)重要。當(dāng)2,4-D濃度為0.5 mg/L時(shí),隨著6-BA濃度的降低愈傷組織生長(zhǎng)速度逐漸加快,降至0.25 mg/L時(shí),愈傷組織結(jié)構(gòu)松散,質(zhì)地較硬,生長(zhǎng)速度較快呈黃綠色(圖3B2),但胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較低,細(xì)胞多數(shù)進(jìn)行無(wú)絲分裂形成體積較大,核較小的大細(xì)胞(圖3B1)。在0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D上誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)降低6-BA濃度能加快生長(zhǎng)速度,細(xì)胞數(shù)量增多(圖3C1、C2),但胚性愈傷組織誘導(dǎo)率與在0.5 mg/L6-BA+0.25 mg/L 2,4-D上誘導(dǎo)的無(wú)差異。配合蔗糖用量的改變,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓,能有效控制愈傷組織生長(zhǎng)速度以及胚性化程度。提高蔗糖用量,增加培養(yǎng)基滲透壓利于愈傷組織細(xì)胞向著胚性轉(zhuǎn)變。當(dāng)蔗糖提高到40 g/L時(shí),胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著提高,添加濃度為0.25 mg/L 6-BA以及0.5 mg/L 2,4-D時(shí),愈傷組織顏色加深,生長(zhǎng)速度較快,細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞體積小,核占比較大(圖3D1、D2),胚性愈傷誘導(dǎo)率為33.58%,顯著高于同樣激素下30 g/L蔗糖的誘導(dǎo)率。在0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4～5代后可明顯觀察到愈傷組織細(xì)胞變小、細(xì)胞質(zhì)濃度增大和細(xì)胞核加大等胚性細(xì)胞的一些特征(圖3E1、E2),胚性愈傷誘導(dǎo)率顯著高于其他處理,達(dá)69.44%。綜上試驗(yàn)結(jié)果,理想的甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖。

注:A1為A2對(duì)應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);A2為0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織;B1為B2對(duì)應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);B2為0.25 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織;C1為C2對(duì)應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);C2為0.25 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織;D1為D2對(duì)應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);D2為0.25 mg/L BA+0.5 mg/L2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織(高滲透壓);E1為E2對(duì)應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);E2為0.25 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織(高滲透壓)。圖3 不同激素與滲透壓下誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)以及胚性化程度的細(xì)胞學(xué)鑒定Fig.3 Callus state induced by different hormones and osmotic pressure and cytological identification for degree of embryogenesis

表3 激素與滲透壓對(duì)甜瓜愈傷組織胚性化的影響Table 3 Effects of hormones and osmotic pressure on embryogenesis of Cucumis melo L. callus

3 結(jié)論與討論

誘導(dǎo)胚性愈傷是一個(gè)前后連接的過(guò)程,前期愈傷組織的性質(zhì)會(huì)影響后期愈傷組織的胚性化程度,因此誘導(dǎo)愈傷組織的選材非常關(guān)鍵,不同外植體誘導(dǎo)的愈傷其生理特性也有所不同。在甜瓜愈傷組織誘導(dǎo)的研究進(jìn)程中,大多數(shù)研究者采用無(wú)菌苗的子葉和下胚軸為外植體,魏曉明等[17]、駱開明等[18]利用子葉以及下胚軸研究不同激素對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的影響;陳千紅和管和[19]利用甜瓜下胚軸研究外源激素對(duì)愈傷的組織效應(yīng),王愛玲等[20]、趙燕等[21]利用子葉下胚軸建立再生體系。本研究采用了經(jīng)開花結(jié)果的甜瓜莖段作為外植體,對(duì)于無(wú)菌苗的子葉以及下胚軸來(lái)說(shuō)成熟的莖段生長(zhǎng)能力以及細(xì)胞分裂能力相對(duì)較低,誘導(dǎo)愈傷組織的時(shí)間可能較長(zhǎng)。如武云鵬等[22]、喬永旭[11]研究表明,子葉和下胚軸的誘導(dǎo)愈傷組織的速度明顯高于真葉,且子葉誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)速度最快、品質(zhì)最好、數(shù)量最多。而劉麗鋒等[23]研究發(fā)現(xiàn),田間葉片誘導(dǎo)愈傷組織效率高于無(wú)菌苗葉片。考慮到甜瓜品種以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境的不同從而導(dǎo)致二者的結(jié)論的相悖。在生產(chǎn)上,真葉的誘導(dǎo)實(shí)用性更強(qiáng),取材更加直觀、便捷,節(jié)約生產(chǎn)成本。外植體幼嫩程度也可能會(huì)在誘導(dǎo)出的松散型胚性愈傷形成胚狀體過(guò)程中有一定影響,本次試驗(yàn)誘導(dǎo)出了松散型胚性愈傷還有待進(jìn)一步研究體胚的誘導(dǎo)。

碳源在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中是必不可少的,尤其在誘導(dǎo)胚性愈傷過(guò)程中[25]。植物愈傷組織誘導(dǎo)中蔗糖在眾多碳源中被普遍運(yùn)用,本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)升高蔗糖的濃度到40 g/L更加利于甜瓜胚性愈傷的誘導(dǎo)。這一現(xiàn)象在洋蔥以及珍珠黃楊等胚性愈傷誘導(dǎo)上同樣適用。代月等[25]研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)增加蔗糖濃度有利于洋蔥胚性愈傷的誘導(dǎo)。李華[26]研究得出胚性愈傷組織狀態(tài)調(diào)整中,最適蔗糖濃度為45～55 g/L。提高蔗糖濃度一方面增加了營(yíng)養(yǎng)的供給,另一方面也適當(dāng)增加了培養(yǎng)基滲透壓。高滲透壓下更有利于細(xì)胞體積變小,液泡濃縮,細(xì)胞核增大。研究表明,胚胎發(fā)生細(xì)胞的共同特征包括小尺寸,致密的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物,大核,突出的增大的核,小液泡[25],根據(jù)愈傷組織狀態(tài)提高蔗糖濃度能達(dá)到此種狀態(tài)特征,從而高效的誘導(dǎo)胚性愈傷。

本試驗(yàn)以成熟葉片為外植體誘導(dǎo)甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo),以MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖為最佳培養(yǎng)樣基,為甜瓜快速繁殖、大規(guī)模量產(chǎn)、體細(xì)胞離體誘變育種及植物組培脫毒等研究提供參考。有關(guān)甜瓜胚性愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生還在進(jìn)一步研究中。