薛陽(yáng)陽(yáng) 秦窈窈 高建輝 岳鸞依 張瑋瑋 余淑珍

1.山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001；3.山西醫(yī)科大學(xué)附屬省人民醫(yī)院麻醉科，山西太原 030012

心力衰竭死亡率快速上升，已成為嚴(yán)重威脅公眾生命的重大問(wèn)題[1]。我國(guó)心力衰竭發(fā)病率逐年上升，臨床規(guī)范治療下5 年病死率達(dá)半數(shù)以上[2-3]。壓力超負(fù)荷致病理性心肌重構(gòu)是心力衰竭獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）是壓力超負(fù)荷致心肌重構(gòu)的主要機(jī)制之一[5]。鹽皮質(zhì)激素受體（mineralocorticoid receptors，MR）拮抗劑雖然可以特異性拮抗MR，治療心肌重構(gòu)、緩解心力衰竭[6]，但有高鉀血癥、血肌酐升高、頭暈、疲乏、腹瀉等副作用[7]。因此，如何進(jìn)一步針對(duì)性治療仍然面臨重要挑戰(zhàn)。依達(dá)拉奉具有抗凋亡、抗壞死、抗炎細(xì)胞因子和清除自由基的作用[8]。近年來(lái)研究表明，除神經(jīng)系統(tǒng)外依達(dá)拉奉對(duì)心臟和血管同樣具有保護(hù)作用[9-11]。前期研究顯示依達(dá)拉奉治療大鼠心肌重構(gòu)與調(diào)控血管緊張素Ⅱ1 型受體（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R）/絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路有關(guān)[12-14]。類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）是AT1R 發(fā)揮作用的中間蛋白，其易化膽固醇穿過(guò)線粒體外膜最終合成醛固酮從而激活MR。本研究旨在探究依達(dá)拉奉治療小鼠壓力超負(fù)荷致心肌重構(gòu)形成是否與抑制AT1R/StAR/MR 激活有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本研究符合山西省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)要求（2020 省醫(yī)科倫審字第140 號(hào)）。18 只4 周齡SPF 級(jí)C57 小鼠，體重22～24 g，購(gòu)自山西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（晉）2019-0001，使用許可證號(hào)：SYXK（晉）2019-0003。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)環(huán)境4 周，期間自由攝食、飲水。將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組：對(duì)照組、血管緊張素Ⅱ組、依達(dá)拉奉組，每組6 只。

1.2 心臟壓力超負(fù)荷模型的建立

腹腔注射氯胺酮200 mg/kg 麻醉后，俯臥位置于操作臺(tái)上。參照文獻(xiàn)[15-16]，在肩胛間區(qū)下緣備皮消毒，2 cm 橫切口，用止血鉗皮下鈍性分離形成囊袋，血管緊張素Ⅱ組、依達(dá)拉奉組小鼠埋置預(yù)先充填血管緊張素Ⅱ的滲透泵，對(duì)照組小鼠埋置預(yù)先充填0.9%氯化鈉的滲透泵，然后用手術(shù)絲線縫合切口。

1.3 給藥方法

埋置滲透泵后，依達(dá)拉奉組給予依達(dá)拉奉腹腔注射（批號(hào)：2019031，吉林博大制藥有限公司）10 mg/（kg·d），連續(xù)28 d[13，15，17]。

1.4 稱重及取材

造模成功后，小鼠稱重并記錄。于異氟烷麻醉后，眼球采血后處死小鼠，剪下心臟，生理鹽水灌洗心腔，沖洗心腔內(nèi)殘余血液后稱重并記錄，計(jì)算心重/體重（heart weight/body weight，HW/BW）比值。之后將其石蠟包埋。

1.5 心肌細(xì)胞橫截面積的測(cè)定

蘇木精-伊紅染色步驟：石蠟切片脫蠟，蘇木精染色，伊紅染色與脫水，乙醇和二甲苯透明，滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片。每張切片由2 名工作人員隨機(jī)選取10 個(gè)有明顯細(xì)胞核和完整細(xì)胞膜的心肌細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，Image J 軟件測(cè)量心肌細(xì)胞橫截面積（cross sectional area of myocardial cells，MSA）。

1.6 Masson’s 染色法測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，依次在蘇木精染色液、麗春紅品紅染色液、磷鉬酸液、苯胺藍(lán)液、弱酸溶液沖洗后乙醇脫水、中性樹膠封固。每張切片由2 名工作人員隨機(jī)選取高倍鏡下的3 個(gè)視野，膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）＝藍(lán)色面積/總面積×100%。

1.7 免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定心肌組織AT1R、StAR、轉(zhuǎn)化因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）、MR表達(dá)

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)后，室溫孵育10 min，PBS 沖洗后，滴加一抗。AT1R 抗體（批號(hào)：BA0582，索萊寶生物科技有限公司，中國(guó)，1∶200）；StAR 抗體（批號(hào)：A16432，索萊寶生物科技有限公司，中國(guó)，1∶200），TGF-β1抗體（批號(hào)：BM3901，索萊寶生物科技有限公司，中國(guó)，1∶100）；α-SMA 抗體（批號(hào)：BM3902，索萊寶生物科技有限公司，中國(guó)，1∶50）；MR 抗體（批號(hào)：A3308，索萊寶生物科技有限公司，中國(guó)，1∶100），4℃過(guò)夜，次日PBS 沖洗，滴加二抗羊抗鼠抗體（批號(hào)：PV-9001，中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）孵育30 min，PBS 沖洗，DBA 染色，蘇木精復(fù)染、封片。陽(yáng)性染色為黃色或深褐色，每張切片2 名工作人員隨機(jī)選取高倍鏡下的3 個(gè)視野，切片掃描儀掃描后，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)定累計(jì)光密度值和區(qū)域面積，計(jì)算平均光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠HW/BW 比值、MSA 和CVF 比較

血管緊張素Ⅱ組小鼠HW/BW 比值、MSA 和CVF高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；依達(dá)拉奉組小鼠HW/BW 比值、MSA 和CVF 低于血管緊張素Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠HW/BW 比值、心肌細(xì)胞橫截面積和膠原容積分?jǐn)?shù)比較（±s）

表1 各組小鼠HW/BW 比值、心肌細(xì)胞橫截面積和膠原容積分?jǐn)?shù)比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與血管緊張素Ⅱ組比較，bP＜0.05。HW/BW：心重/體重比值；MSA：心肌細(xì)胞橫截面積；CVF：膠原容積分?jǐn)?shù)。

2.2 各組小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR 和AT1R表達(dá)比較

血管緊張素Ⅱ組小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR、AT1R 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；依達(dá)拉奉組小鼠的TGF-β1、α-SMA、MR、StAR、AT1R 蛋白表達(dá)低于血管緊張素Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR 和AT1R 表達(dá)比較（±s）

表2 各組小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR 和AT1R 表達(dá)比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與血管緊張素Ⅱ組比較，bP＜0.05。TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；α-SMA：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；MR：鹽皮質(zhì)激素受體；StAR：類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白；AT1R：血管緊張素1 型受體。

3 討論

心肌重構(gòu)是心臟應(yīng)對(duì)壓力超負(fù)荷的代償機(jī)制，其特征表現(xiàn)為心臟質(zhì)量增大、細(xì)胞肥大和相關(guān)蛋白增多[18]。長(zhǎng)期壓力超負(fù)荷引起心肌舒張和收縮功能障礙最終導(dǎo)致心力衰竭[19]。目前治療心力衰竭的藥物有β 受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和AT1R 阻滯劑，但心血管疾病病死率仍顯著增加[3]。因此，進(jìn)一步了解心肌重構(gòu)發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制意義重大。本研究采用皮下埋置滲透泵持續(xù)灌注血管緊張素Ⅱ的方法復(fù)制小鼠壓力超負(fù)荷模型[16，20]。研究表明[21-22]，血管緊張素Ⅱ組小鼠HW/BW 比值、MSA、CVF 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示小鼠心肌肥厚、膠原蛋白沉積增加、心臟纖維化形成進(jìn)而心臟衰竭發(fā)生，結(jié)合本研究結(jié)果提示小鼠心肌重構(gòu)模型制備成功。

小鼠埋置滲透泵后，血管緊張素Ⅱ與心肌和血管平滑肌上AT1R 結(jié)合，激活下游StAR 后易化膽固醇從線粒體外膜穿入，在細(xì)胞色素P450 側(cè)鏈裂解酶作用下轉(zhuǎn)化為孕烯酮，接著生成脫氧皮質(zhì)酮最終合成醛固酮，醛固酮與MR 結(jié)合后使其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核發(fā)揮促高血壓、心肌重構(gòu)和炎癥作用[23-25]。血管緊張素Ⅱ和醛固酮又介導(dǎo)炎癥細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在心臟組織內(nèi)增殖，從血管遷移到組織間隙，大量巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β，促使心臟成纖維細(xì)胞分化為生成α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，后者生成細(xì)胞外基質(zhì)如膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ的能力是成纖維細(xì)胞數(shù)倍，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度堆積，心肌重構(gòu)加重[26-27]。

本研究結(jié)果顯示，血管緊張素Ⅱ組小鼠的HW/BW比值、MSA 和CVF 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示依達(dá)拉奉可抑制小鼠壓力超負(fù)荷致心肌重構(gòu)。血管緊張素Ⅱ組小鼠心肌細(xì)胞的AT1R、StAR和MR 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；依達(dá)拉奉組小鼠心肌細(xì)胞的AT1R、StAR 和MR 蛋白表達(dá)低于血管緊張素Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示依達(dá)拉奉治療小鼠壓力超負(fù)荷致心肌重構(gòu)與抑制AT1R/StAR/MR 有關(guān)。李開智等[28]研究表明，依達(dá)拉奉通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路改善大鼠心臟功能，與本研究結(jié)果一致，但目前缺乏依達(dá)拉奉抑制AT1R/StAR/MR 信號(hào)通路的相關(guān)報(bào)道，這是此研究的創(chuàng)新點(diǎn)。

鑒于治療心力衰竭沒有確切的有效方法，本研究有望為該藥的臨床推廣提供重要理論依據(jù)，可以與β 受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或AT1R 阻滯劑聯(lián)合用于心力衰竭患者的治療，以防止心功能障礙的進(jìn)展。目前缺乏依達(dá)拉奉治療心肌重構(gòu)的最佳劑量數(shù)據(jù)，此外其潛在機(jī)制有待完全闡明，這是未來(lái)探索的方向。

綜上所述，依達(dá)拉奉可抑制小鼠壓力超負(fù)荷致心肌重構(gòu)形成，其機(jī)制與抑制AT1R/StAR/MR 信號(hào)通路激活有關(guān)。