劉旭昊， 汪小將， 劉 飛

（洛陽(yáng)師范學(xué)院， 河南洛陽(yáng) 471934）

虹鱒是我國(guó)重要的高端冷水魚之一，廣受大眾歡迎，近年來(lái)一直保持高速增長(zhǎng)，即使2018年遭遇了“改名危機(jī)”，虹鱒產(chǎn)量依然保持了正增長(zhǎng)，與2015年相比，2019年鱒魚產(chǎn)量幾乎翻了一倍，達(dá)39373 t[1]。水產(chǎn)動(dòng)物基本上無(wú)法避開致病菌和寄生蟲，一旦發(fā)病往往會(huì)造成較大損失，所以提高非特異性免疫能力對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的[2]。目前虹鱒對(duì)各種疾病尚無(wú)特效藥物，其抗性主要源于非特異性免疫[3]。而中草藥常被用于提高水產(chǎn)的非特異性免疫能力和抗氧化能力，研究表明多種中草藥可提高虹鱒的抗氧化能力、白細(xì)胞吞噬能力以及其它多種非特異性免疫指標(biāo)[4]。

虹鱒漁場(chǎng)多建于高山峽谷之間，生長(zhǎng)階段、飼料的時(shí)空分布、暫養(yǎng)、轉(zhuǎn)場(chǎng)乃至后勤保障等種種原因?qū)е潞琪V短期饑餓脅迫很難避免，所以提高虹鱒的饑餓耐受性及其非特異性免疫能力、減少因而造成的損失是虹鱒養(yǎng)殖面臨的新課題。虹鱒是冷水魚研究模式魚種，故了解中草藥在虹鱒面臨饑餓脅迫下對(duì)免疫相關(guān)指標(biāo)的影響就顯得尤為必要，可為以虹鱒為代表的冷水魚在饑餓脅迫下采取何種預(yù)防性對(duì)策提供理論依據(jù)。

紅棗是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用食物，具有抗衰老、補(bǔ)血、抗氧化、抗腫瘤、保肝、調(diào)節(jié)免疫力等作用，其活性成分被不同機(jī)構(gòu)進(jìn)行了深入細(xì)致的研究[5,6]。另有研究表明，適量添加紅棗提取物可以促進(jìn)虹鱒抗氧化能力，提高虹鱒的非特異性免疫能力[7]。故本文深入研究短期饑餓脅迫對(duì)攝入紅棗提取物后虹鱒幼魚非特異性免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響，以評(píng)價(jià)紅棗提取物攝入對(duì)虹鱒非特異性免疫能力促進(jìn)的持續(xù)性和耐饑餓脅迫能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)用虹鱒幼魚自四川省眉山市東坡區(qū)天貴養(yǎng)殖場(chǎng)采購(gòu)，于本院冷水魚養(yǎng)殖工程研究中心循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)缸（1 m×1m）暫養(yǎng)馴化14 d后，選取體型大小一致（7.2～8.4 cm）、游動(dòng)迅捷靈活、無(wú)病無(wú)傷的虹鱒幼魚備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)用飼料

紅棗提取物（20:1）購(gòu)自陜西森弗天然制品有限公司。以豆粕、魚粉為N源，豆油加魚油為脂肪源配制基礎(chǔ)飼料，配方見表1；飼料原料購(gòu)自中糧飼料（新沂）有限公司。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，分別添加質(zhì)量百分比為0%、0.25%、0.5%的紅棗提取物，配制成等氮等脂試驗(yàn)用飼料（粗蛋白46.2%；粗脂肪13.7%）并制粒，粒徑1.5～2.5 mm，陰干后于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，用前自然升溫至室溫?/p>

表1 虹鱒基礎(chǔ)飼料配方（%）

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3 虹鱒養(yǎng)殖

1.3.1 紅棗提取物攝入試驗(yàn)處理

取備用虹鱒幼魚，隨機(jī)分為三組，每組3個(gè)平行缸，每缸30尾；分別投喂紅棗提取物添加比為0%、0.25%、0.50%的試驗(yàn)用飼料，連續(xù)飼養(yǎng)8周，期間24h充氣泵運(yùn)行，每日適度換水，水體循環(huán)過(guò)濾，并保持水溫在13±2℃、pH7.2±0.2，DO＞8 mg/L。每日早中晚三次定點(diǎn)定時(shí)投喂（投喂量：2-5%體重飽食），投喂后及時(shí)清理殘餌和糞便。

1.3.2 饑餓試驗(yàn)處理

前處理飼養(yǎng)階段完成后，所有各試驗(yàn)缸留下10尾在饑餓脅迫條件下飼養(yǎng)2周，除禁食外，其它條件不變。

1.4 采樣

饑餓試驗(yàn)后所有各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取虹鱒幼魚各6尾，用70%乙醇脫脂棉球消毒，于冰盤上解剖，分別取頭腎、脾臟于凍存管中暫存，并盡快轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中凍存。

1.5 抗氧化基因表達(dá)情況測(cè)定

從-80℃冰箱中取出備用樣品，進(jìn)行總RNA提?。ㄉ虾ｏw捷總RNA極速提取試劑盒）；然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（東洋紡生物科技有限公司試劑盒）得到cDNA，然后用超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX1）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GSTA）、溶菌酶（LZM）、補(bǔ)體C3（C3）、腫瘤壞死因子（TNF-α）目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物，按照Bestar SybrGreen qPCR mastermix （德國(guó)DBI公司）說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)程序設(shè)置如下：95℃2 min；95℃10 s，55℃30 s，72℃30 s，40 cycles；95℃1 min，55℃1 min，55-98℃（10s/cycle，0.5℃/cycle，共86cycles）。循環(huán)結(jié)束后提取各基因Cq值，用2—ΔΔt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2013進(jìn)行處理，使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)計(jì)算結(jié)果精度；使用SPSS13.0進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan′s法進(jìn)行處理組和對(duì)照組之間的平均數(shù)比較，在α=0.05水平檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗提取物對(duì)饑餓條件下脾臟非特異性免疫基因表達(dá)的影響

不同饑餓試驗(yàn)組虹鱒脾臟非特異性免疫相關(guān)基因（含抗氧化基因和免疫基因）的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果見圖1。從圖中可看出，進(jìn)行14天饑餓后，SOD，GPX1,GSTA,LZM,C3均在0.25%組與對(duì)照組相比表現(xiàn)為表達(dá)量增加，其中除LZM外均在0.50%組轉(zhuǎn)為下降。經(jīng)單因素方差分析結(jié)果表明：GPX1、GSTA和C3基因表達(dá)在0.50%組顯著或極顯著下調(diào)，但LZM基因表達(dá)在0.50%組顯著上調(diào)，C3基因表達(dá)在0.25%組極顯著上調(diào)；其他各紅棗提取物組的這些基因的表達(dá)量均與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化。

圖1 不同饑餓組虹鱒脾臟非特異性免疫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量

2.2 紅棗提取物對(duì)饑餓條件下頭腎非特異性免疫基因表達(dá)的影響

不同饑餓試驗(yàn)組虹鱒頭腎非特異性免疫相關(guān)基因（含抗氧化基因和免疫基因）的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果見圖2。從圖中可看出，相對(duì)于對(duì)照組，兩個(gè)紅棗提取物添加組各基因表現(xiàn)的表達(dá)情況無(wú)統(tǒng)一的趨勢(shì)，但所測(cè)定的三個(gè)免疫直接相關(guān)基因0.25%組表達(dá)量要高于對(duì)照組和0.50%組。經(jīng)單因素方差分析結(jié)果表明：GPX1基因表達(dá)在0.25%組極顯著下調(diào)，在0.50%組顯著上調(diào)；C3基因表達(dá)在0.25%組極顯著上調(diào)；其他各紅棗提取物添加組在這幾個(gè)基因的表達(dá)量上均與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。

圖2 不同饑餓組虹鱒頭腎非特異性免疫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量

3 討論

從本研究結(jié)果來(lái)看，投喂添加紅棗提取物的虹鱒短期饑餓脅迫后脾臟受到的影響更大，7組非特異性免疫相關(guān)基因表達(dá)中GPX1、GSTA、LZM、C3出現(xiàn)了顯著或極顯著波動(dòng)，而頭腎受到的影響相對(duì)小一些，僅GPX1和C3出現(xiàn)了極顯著波動(dòng)。另外有研究表明虹鱒飼料添加物可以增強(qiáng)頭腎SOD、C3[8]、CAT[7]基因的表達(dá)和脾臟SOD、GPX1、GSTA基因的表達(dá)[7]，本研究中在短期饑餓脅迫后相對(duì)于對(duì)照組虹鱒兩種組織的響應(yīng)能力均出現(xiàn)下降，其中頭腎SOD、CAT基因表達(dá)差異喪失、脾臟SOD基因表達(dá)差異喪失，表明不同非特異性免疫基因在不同組織的作用持續(xù)時(shí)間有一定差異。頭腎是魚類主要的造血和免疫器官，脾臟是虹鱒最主要的免疫器官之一。脾臟和頭腎的結(jié)構(gòu)、功能存在顯著差異，提示其對(duì)紅棗提取物的器官反應(yīng)也可能有所不同，也反映了中草藥在配伍應(yīng)用上應(yīng)當(dāng)注意器官效應(yīng)。

動(dòng)物細(xì)胞的抗氧化酶系主要包括CAT、SOD、GPX、GSTA等，饑餓脅迫下通常會(huì)降低抗氧化基因的表達(dá)或其酶活性。從本研究看，相對(duì)于對(duì)照組，主要受影響的脾臟中GPX1、GSTA基因表達(dá)在低濃度組（0.25%）還均表現(xiàn)為一定程度的上升趨勢(shì)，而高濃度組（0.5%）則均表現(xiàn)為進(jìn)一步的顯著或極顯著下降。已有研究表明一定濃度紅棗提取物添加能提高虹鱒機(jī)體的抗氧化能力，顯著提升虹鱒脾臟GSTA基因表達(dá)[7]。這表明飼料添加一定濃度紅棗提取物對(duì)虹鱒促抗氧化能力持續(xù)效應(yīng)不明顯，而且過(guò)高濃度（0.5%）添加反而在抗饑餓脅迫時(shí)降低機(jī)體抗氧化能力。

魚類的非特異性免疫機(jī)制包括溶菌酶、補(bǔ)體、干擾素、吞噬細(xì)胞等，其中溶菌酶（LZM）在抵抗病原入侵中起重要作用；補(bǔ)體系統(tǒng)介導(dǎo)溶裂反應(yīng)來(lái)促進(jìn)吞噬、溶解靶細(xì)胞，是機(jī)體內(nèi)重要的非特異性免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，因三條激活途徑均包含C3，所以C3是非特異性免疫的重要標(biāo)志。儲(chǔ)辛伊等研究結(jié)果表明饑餓脅迫也會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)體含量下降，同時(shí)認(rèn)為補(bǔ)體C3在饑餓脅迫下活化可以清除機(jī)體中可溶性免疫復(fù)合物，抑制炎癥反應(yīng)[9]。饑餓脅迫可導(dǎo)致魚類各種非特異性免疫指標(biāo)下降[7，10]。本試驗(yàn)中添加紅棗提取物后短期饑餓脅迫下虹鱒脾臟LZM基因表達(dá)呈上升趨勢(shì)，在高濃度（0.5%）下表達(dá)顯著增強(qiáng)；低濃度組（0.25%）C3基因無(wú)論在脾臟還是頭腎均極顯著上調(diào)表達(dá)，但在高濃度組（0.5%）仍然顯著下調(diào)。這表明飼料添加一定濃度紅棗提取物對(duì)虹鱒促免疫能力具有一定的持續(xù)效應(yīng)，也一定程度增強(qiáng)了機(jī)體的抗脅迫能力。

綜上，一定濃度的紅棗提取物攝入后，對(duì)虹鱒非特異性免疫能力促進(jìn)具有一定的持續(xù)性，主要表現(xiàn)在對(duì)脾臟組織和非特性免疫直接相關(guān)基因（如LZM、C3）上，一定程度上也表明其攝入能提升機(jī)體的抗饑餓脅迫能力。同時(shí)結(jié)合上述對(duì)非特異性免疫直接基因表達(dá)及相關(guān)的抗氧化基因的表達(dá)影響結(jié)果的綜合分析來(lái)看，在虹鱒飼料中添加較低濃度（0.25%）紅棗提取物為宜。