張曦月 張玉國 羅嫚

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種危及生命的疾病，臨床表現(xiàn)以彌漫性肺部炎癥、肺水腫、肺功能減退、呼吸衰竭為主要特征[1]。目前ALI 的治療方式主要包括機械通氣及藥物干預，但由于這些治療的創(chuàng)傷性及局限性，患者死亡率仍維持在40%左右[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)多種具有抗炎活性及肺保護作用的天然產(chǎn)物對ALI 具有很大的治療潛力[3]。赤蘚糖醇（erythritol，Ery）是一種能夠產(chǎn)生抗氧化應激[4]、調(diào)節(jié)免疫、抗炎[5]等藥理作用的多元醇甜味劑，廣泛存在于食物中，具有來源廣、成本低、易于獲取、不良反應相對較小等優(yōu)勢。研究顯示，Ery 參與人體的代謝過程，可以通過激活核因子E2 相關(guān)因子2 抗氧化能力改善非酒精性脂肪肝[4]，也可以通過調(diào)節(jié)人體固有免疫功能，減輕代謝紊亂，改善高脂飲食引起的小腸炎癥[5]，因此，具有緩解ALI 的潛力。但Ery 是否對ALI 有緩解作用目前尚未見報道。因此，本研究通過構(gòu)建動物模型，探究Ery 對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠ALI 的保護作用及相關(guān)機制，為Ery 用于ALI 的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 6～8 周齡SPF 級BALB/C 雄性小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2019-0008。所有操作均經(jīng)吉林大學實驗動物福利倫理委員會審查通過（批準文號：SY202204101）。小鼠飼養(yǎng)條件：溫度為20～25 ℃，濕度為50%～55%，光照12 h/d，實驗動物自由飲水采食。

1.2 主要試劑 Ery 粉末（批號：Z07J7H17429，規(guī)格：20 mg，純度為HPLC≥98%）購自中國上海源葉生物技術(shù)有限公司；IL-6 ELISA 試劑盒（批號：B360840）購自美國Biolegend 公司；RIPA 裂解液（批號：S04FD081）購自中國北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；p65（批號：7）、磷酸化p65（p-p65）（批號：19）抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公 司；LPS 粉 末（批 號：0000110640，規(guī)格：100 mg）購自美國Sigma 公司；山羊抗兔IgG 抗體（批號：20000758）、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（批號：20031437）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；多功能酶標儀（型號：iMark）購自美國Bio-Rad有限公司。

1.3 ALI 模型的構(gòu)建 采用隨機抽簽法將40 只小鼠分為空白對照組（NT 組）、藥物對照組（Ery 組）、模型組（LPS 組）、治療組（LPS+Ery 組），每組10 只。Ery 組及LPS+Ery 組小鼠胃部灌注Ery（100 mg/kg Ery 粉末溶于100 μL 0.9%氯化鈉注射液），1 次/d，共6 d；NT 組及LPS 組小鼠胃部灌注100 μL 0.9%氯化鈉注射液。6 d后，LPS 組及LPS+Ery 組小鼠鼻內(nèi)滴注LPS（1.25 mg/kg LPS 粉末溶于20 μL PBS）的方法建立小鼠ALI 模型；NT 組及Ery 組小鼠鼻內(nèi)滴注20 μL PBS。12 h 后，每組隨機選取5 只小鼠，頸椎脫臼法處死，獲取新鮮肺組織；將每組剩余5 只小鼠麻醉，打開胸腔充分暴露氣管，氣管切開后后用1 mL 0.9%氯化鈉溶液進行肺泡灌洗并回收灌洗液，重復3 次，收集灌洗液后處死小鼠。

1.4 肺組織濕重/干重（濕/干）比值檢測 取新鮮的小鼠肺組織（左肺）稱重，為濕重。將肺組織放置在80 ℃電熱烘干箱內(nèi)48 h，再次稱重，為干重。計算濕/干比值以評價肺水腫的嚴重程度。

1.5 肺組織損傷評分 將小鼠肺組織（右前葉）固定于4%多聚甲醛中，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，HE 染色。由3 位經(jīng)驗豐富的病理閱片人員根據(jù)肺泡腔內(nèi)中性粒細胞的浸潤程度、肺泡的萎縮程度、肺泡腔之間的基質(zhì)厚度情況等進行肺組織損傷評分。根據(jù)損傷的嚴重程度劃分5 個等級，評分為0～4 分（0 分代表無損傷，4 分代表極度損傷）。

1.6 炎癥因子檢測

1.6.1 肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6 水平檢測 采用ELISA 法檢測肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6 水平。

1.6.2 肺組織中髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性檢測 取新鮮的小鼠肺組織（右中葉）放置在2 mL 組織研磨管中，每100 mg 肺組織加入400 μL 4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液，研磨，12 000 r/min 離心10 min后，棄掉上清液，在沉淀中加入等體積的十六烷基三甲基氯化銨溶液，研磨、離心后取上清液。將上清液和工作液依次加入96 孔板中，孵育20 min 后加入終止液，用酶標儀測定450 nm 處吸光度（optical density，OD）值。

1.7 肺組織中炎癥相關(guān)蛋白p65、p-p65 蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。取新鮮的小鼠肺組織（右后葉）加入RIPA 裂解液，研磨離心后，取上清液進行BCA 定量，每15 μL 樣品含蛋白質(zhì)40 μg。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳后，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉1.5 h，加入待測蛋白抗體（1∶1 000）在4 ℃下孵育過夜。次日，Tris-HCl 緩沖液和TBST 緩沖液清洗后加入二抗（山羊抗兔IgG 抗體1∶2 000）孵育1 h，TBST 緩沖液清洗后進行顯色、曝光、成像，應用Image J 計算條帶灰度值。

1.8 分子對接 p65 蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。Ery 信息從PubChem 數(shù)據(jù)庫中獲取，并以SDF格式下載。利用AutoDock 工具模擬計算p65 和Ery 之間存在氫鍵的氨基酸殘基，最后使用PyMOL 軟件對結(jié)果進行可視化。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件。計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組小鼠肺組織病理損傷情況比較 與NT 組比較，Ery 組小鼠肺組織沒有破壞；LPS 組小鼠肺組織肺泡間隙增大，可見炎細胞浸潤，肺泡塌陷；與LPS 組比較，LPS+Ery 組小鼠肺損傷程度明顯減輕，見圖1A。與NT 組比較，LPS 組小鼠肺組織損傷評分升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+Ery 組小鼠肺組織損傷評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1B。

圖1 4 組小鼠肺組織病理損傷情況比較（A：4 組小鼠肺組織病理切片所見，HE 染色，×200；B：4 組小鼠肺組織損傷評分比較；與NT 組比較，aP＜0.05；與LPS 組比較，bP＜0.05）

2.2 4 組小鼠肺組織濕/干比值比較 與NT 組比較，LPS 組小鼠肺組織濕/干比值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+Ery 組小鼠肺組織濕/干比值降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 4 組小鼠肺組織濕/干比值比較

2.3 4 組小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平和肺組織中MPO 活性比較 與NT 組比較，LPS 組小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平及肺組織中MPO 活性均增高，LPS+Ery 組小鼠肺組織中MPO 活性增高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與LPS 組比較，LPS+Ery 組小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平及肺組織中MPO 活性均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 4 組小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平和肺組織中MPO 活性比較（A：4 組小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平比較；B：4 組小鼠肺組織中MPO 活性比較）

2.4 4 組小鼠肺組織中p-p65 蛋白表達水平比較 與NT 組比較，LPS 組小鼠肺組織中p-p65 蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+Ery 組小鼠肺組織中p-p65 蛋白表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 4 組小鼠肺組織中p-p65 蛋白表達水平比較（A：蛋白表達的電泳圖；B：蛋白表達水平比較）

2.5 Ery 與p65 蛋白的分子對接模擬 應用生物信息學技術(shù)將Ery 分子與NF-κB p65 蛋白進行對接模擬，結(jié)果顯示Ery 和p65 蛋白的結(jié)合能為-2.18 kcal/mol，結(jié)合能＜0，差異有統(tǒng)計學意義，且Ery 與p65 蛋白的氨基酸殘基ARG-246、GLN-247 具有氫鍵相互作用，見圖5（插頁）。

圖5 Ery 與p65 蛋白的分子對接模擬

3 討論

ALI 是一種危重的臨床綜合征，臨床表現(xiàn)為重度呼吸困難、呼吸急促、氧療難治性發(fā)紺、肺順應性降低及胸部X 線表現(xiàn)為彌漫性肺泡浸潤[6]。導致ALI 的因素有很多，可由肺炎、誤吸等肺內(nèi)因素，也可由膿毒癥、創(chuàng)傷等肺外因素引起，而肺炎是其最常見最直接的致病因素[2]。研究表明，革蘭陰性菌感染是ALI 最重要的原因之一，LPS 是革蘭陰性菌外膜的主要成分，可導致肺損傷和炎癥反應[7]。鼻內(nèi)滴注LPS 常用于構(gòu)建ALI 模型，可有效誘導中性粒細胞炎癥反應，加重肺組織損傷。因此本研究采用該造模方法，成功構(gòu)建了ALI 模型。

ALI 的發(fā)病機制復雜[1]，治療手段有限。目前臨床上治療主要以機械通氣為主，但不恰當?shù)臋C械通氣也可加速急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)展和惡化。因此，尋找有效治療ALI 的藥物至關(guān)重要。天然產(chǎn)物由于其易獲得、不良反應小且具有廣泛的藥理活性等優(yōu)點，近年來備受關(guān)注。Ery 是一種具有多種生物功能的多元醇甜味劑，天然存在于水果（如葡萄）、蔬菜（如蘑菇）及發(fā)酵食品（如醬油）等食物中[8]，目前，Ery 已由FDA批準作為甜味劑使用[9]。研究顯示，Ery 參與人體的代謝過程[4]，也可以通過調(diào)節(jié)固有免疫，降低代謝紊亂，改善高脂飲食引起的小腸炎癥[5]。但目前為止，Ery 是否對ALI 有緩解作用尚未見報道。

當ALI 發(fā)生時，可導致肺組織的間質(zhì)水腫、中性粒細胞的聚集及肺泡上皮損傷，破壞正常的生理結(jié)構(gòu)，從而影響其生物學功能。本研究通過肺組織病理切片評估肺損傷的嚴重程度，通過濕/干比值評估肺水腫的情況，結(jié)果顯示，Ery 可以有效緩解LPS 誘導的小鼠ALI 肺組織的損傷程度，顯著抑制肺水腫程度。以上結(jié)果表明，在ALI 中，Ery 可以通過減輕肺組織水腫程度發(fā)揮保護作用。

研究表明，當出現(xiàn)炎癥反應或創(chuàng)傷應激時，炎癥通路被激活，炎癥反應可以清除病原體，但過度的炎癥反應會導致肺泡損傷，炎癥介質(zhì)是炎癥的主要效應物，炎癥因子將大量炎癥細胞募集到受損組織中，大量中性粒細胞聚集，釋放活性氧，造成肺間質(zhì)和肺實質(zhì)損傷，最終導致呼吸衰竭，甚至全身性炎癥反應[10]。MPO 是中性粒細胞聚集的主要標志，可用于評估中性粒細胞在組織中的浸潤程度，抑制MPO 活性可有效減輕炎癥反應。本研究結(jié)果顯示Ery 預處理后，MPO 活性顯著降低，緩解了ALI 小鼠肺組織中性粒細胞的浸潤程度。當炎癥反應發(fā)生時，炎癥信號通路被激活，IL-6 的表達增高[10]。本研究通過測定小鼠肺泡灌洗液中IL-6 的表達情況評估肺損傷炎癥反應的嚴重程度，結(jié)果顯示，Ery 顯著抑制了IL-6 的表達，減輕了ALI 小鼠炎癥反應的嚴重程度。因此，在LPS 誘導的ALI 小鼠模型中，Ery 可能通過抑制炎癥反應發(fā)揮保護作用。

本研究進一步探討了Ery 對ALI 的潛在機制。NF-κB 是經(jīng)典的炎癥信號通路，參與ALI 的形成，p65是該信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點信號。在正常生理狀態(tài)下p65 蛋白與IκB 蛋白處于集合狀態(tài)；當炎癥發(fā)生時，p65 蛋白轉(zhuǎn)位進入細胞核并結(jié)合在促炎癥基因表達的啟動子上促進炎癥因子釋放，加劇炎癥反應，進而參與ALI 的形成。有研究指出p65 蛋白的磷酸化加劇了ALI 的嚴重程度，而有效抑制p65 蛋白的磷酸化則緩解了炎癥介質(zhì)的釋放進而從減輕炎癥的角度緩解了ALI的發(fā)生、發(fā)展[11]。結(jié)合以上研究思路，本研究探究了Ery 是否可以通過抑制NF-κB-p65 蛋白的磷酸化，實驗結(jié)果表明，LPS 刺激顯著增加了p65 的磷酸化水平，Ery 可以逆轉(zhuǎn)LPS 誘導的p65 的磷酸化，從而發(fā)揮抗炎作用。同時，為了解Ery 與NF-κB 作用的潛在對接位點，本研究應用AutoDock 工具及PyMOL 軟件進行分子對接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ery 和p65 蛋白的結(jié)合能為-2.18 kcal/mol，并且Ery 與p65 蛋白的氨基酸殘基ARG-246、GLN-247 具有氫鍵相互作用，上述結(jié)果表明Ery 與p65具有較強的結(jié)合作用，進一步驗證了Ery 和p65 信號的抑制作用。說明Ery 抑制了NF-κB 相關(guān)信號通路，這揭示其可能與p65 蛋白存在相關(guān)作用，并抑制NF-κB信號通路。

綜上所述，Ery 對LPS 誘導的小鼠ALI 具有保護作用，其潛在機制是Ery 通過抑制p65 信號的激活進而抑制炎癥反應，從緩解炎癥損傷和水腫的角度發(fā)揮了對ALI 的保護作用。Ery 可能成為治療ALI 的潛在藥物，但其在治療過程中發(fā)揮作用的代謝產(chǎn)物及機制有待深入的研究。