張曦月 張玉國 羅嫚
急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是一種危及生命的疾病,臨床表現(xiàn)以彌漫性肺部炎癥、肺水腫、肺功能減退、呼吸衰竭為主要特征[1]。目前ALI 的治療方式主要包括機械通氣及藥物干預,但由于這些治療的創(chuàng)傷性及局限性,患者死亡率仍維持在40%左右[2]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)多種具有抗炎活性及肺保護作用的天然產(chǎn)物對ALI 具有很大的治療潛力[3]。赤蘚糖醇(erythritol,Ery)是一種能夠產(chǎn)生抗氧化應激[4]、調(diào)節(jié)免疫、抗炎[5]等藥理作用的多元醇甜味劑,廣泛存在于食物中,具有來源廣、成本低、易于獲取、不良反應相對較小等優(yōu)勢。研究顯示,Ery 參與人體的代謝過程,可以通過激活核因子E2 相關(guān)因子2 抗氧化能力改善非酒精性脂肪肝[4],也可以通過調(diào)節(jié)人體固有免疫功能,減輕代謝紊亂,改善高脂飲食引起的小腸炎癥[5],因此,具有緩解ALI 的潛力。但Ery 是否對ALI 有緩解作用目前尚未見報道。因此,本研究通過構(gòu)建動物模型,探究Ery 對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的小鼠ALI 的保護作用及相關(guān)機制,為Ery 用于ALI 的防治提供理論依據(jù)。
1.1 實驗動物 6~8 周齡SPF 級BALB/C 雄性小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2019-0008。所有操作均經(jīng)吉林大學實驗動物福利倫理委員會審查通過(批準文號:SY202204101)。小鼠飼養(yǎng)條件:溫度為20~25 ℃,濕度為50%~55%,光照12 h/d,實驗動物自由飲水采食。
1.2 主要試劑 Ery 粉末(批號:Z07J7H17429,規(guī)格:20 mg,純度為HPLC≥98%)購自中國上海源葉生物技術(shù)有限公司;IL-6 ELISA 試劑盒(批號:B360840)購自美國Biolegend 公司;RIPA 裂解液(批號:S04FD081)購自中國北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司;p65(批號:7)、磷酸化p65(p-p65)(批號:19)抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公 司;LPS 粉 末(批 號:0000110640,規(guī)格:100 mg)購自美國Sigma 公司;山羊抗兔IgG 抗體(批號:20000758)、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒(批號:20031437)均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;多功能酶標儀(型號:iMark)購自美國Bio-Rad有限公司。
1.3 ALI 模型的構(gòu)建 采用隨機抽簽法將40 只小鼠分為空白對照組(NT 組)、藥物對照組(Ery 組)、模型組(LPS 組)、治療組(LPS+Ery 組),每組10 只。Ery 組及LPS+Ery 組小鼠胃部灌注Ery(100 mg/kg Ery 粉末溶于100 μL 0.9%氯化鈉注射液),1 次/d,共6 d;NT 組及LPS 組小鼠胃部灌注100 μL 0.9%氯化鈉注射液。6 d后,LPS 組及LPS+Ery 組小鼠鼻內(nèi)滴注LPS(1.25 mg/kg LPS 粉末溶于20 μL PBS)的方法建立小鼠ALI 模型;NT 組及Ery 組小鼠鼻內(nèi)滴注20 μL PBS。12 h 后,每組隨機選取5 只小鼠,頸椎脫臼法處死,獲取新鮮肺組織;將每組剩余5 只小鼠麻醉,打開胸腔充分暴露氣管,氣管切開后后用1 mL 0.9%氯化鈉溶液進行肺泡灌洗并回收灌洗液,重復3 次,收集灌洗液后處死小鼠。
1.4 肺組織濕重/干重(濕/干)比值檢測 取新鮮的小鼠肺組織(左肺)稱重,為濕重。將肺組織放置在80 ℃電熱烘干箱內(nèi)48 h,再次稱重,為干重。計算濕/干比值以評價肺水腫的嚴重程度。
1.5 肺組織損傷評分 將小鼠肺組織(右前葉)固定于4%多聚甲醛中,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,HE 染色。由3 位經(jīng)驗豐富的病理閱片人員根據(jù)肺泡腔內(nèi)中性粒細胞的浸潤程度、肺泡的萎縮程度、肺泡腔之間的基質(zhì)厚度情況等進行肺組織損傷評分。根據(jù)損傷的嚴重程度劃分5 個等級,評分為0~4 分(0 分代表無損傷,4 分代表極度損傷)。
1.6 炎癥因子檢測
1.6.1 肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6 水平檢測 采用ELISA 法檢測肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6 水平。
1.6.2 肺組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性檢測 取新鮮的小鼠肺組織(右中葉)放置在2 mL 組織研磨管中,每100 mg 肺組織加入400 μL 4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液,研磨,12 000 r/min 離心10 min后,棄掉上清液,在沉淀中加入等體積的十六烷基三甲基氯化銨溶液,研磨、離心后取上清液。將上清液和工作液依次加入96 孔板中,孵育20 min 后加入終止液,用酶標儀測定450 nm 處吸光度(optical density,OD)值。
1.7 肺組織中炎癥相關(guān)蛋白p65、p-p65 蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。取新鮮的小鼠肺組織(右后葉)加入RIPA 裂解液,研磨離心后,取上清液進行BCA 定量,每15 μL 樣品含蛋白質(zhì)40 μg。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳后,轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜,室溫封閉1.5 h,加入待測蛋白抗體(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。次日,Tris-HCl 緩沖液和TBST 緩沖液清洗后加入二抗(山羊抗兔IgG 抗體1∶2 000)孵育1 h,TBST 緩沖液清洗后進行顯色、曝光、成像,應用Image J 計算條帶灰度值。
1.8 分子對接 p65 蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。Ery 信息從PubChem 數(shù)據(jù)庫中獲取,并以SDF格式下載。利用AutoDock 工具模擬計算p65 和Ery 之間存在氫鍵的氨基酸殘基,最后使用PyMOL 軟件對結(jié)果進行可視化。
1.9 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件。計量資料組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 4 組小鼠肺組織病理損傷情況比較 與NT 組比較,Ery 組小鼠肺組織沒有破壞;LPS 組小鼠肺組織肺泡間隙增大,可見炎細胞浸潤,肺泡塌陷;與LPS 組比較,LPS+Ery 組小鼠肺損傷程度明顯減輕,見圖1A。與NT 組比較,LPS 組小鼠肺組織損傷評分升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與LPS 組比較,LPS+Ery 組小鼠肺組織損傷評分降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1B。
圖1 4 組小鼠肺組織病理損傷情況比較(A:4 組小鼠肺組織病理切片所見,HE 染色,×200;B:4 組小鼠肺組織損傷評分比較;與NT 組比較,aP<0.05;與LPS 組比較,bP<0.05)
2.2 4 組小鼠肺組織濕/干比值比較 與NT 組比較,LPS 組小鼠肺組織濕/干比值升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與LPS 組比較,LPS+Ery 組小鼠肺組織濕/干比值降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2。
圖2 4 組小鼠肺組織濕/干比值比較
2.3 4 組小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平和肺組織中MPO 活性比較 與NT 組比較,LPS 組小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平及肺組織中MPO 活性均增高,LPS+Ery 組小鼠肺組織中MPO 活性增高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與LPS 組比較,LPS+Ery 組小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平及肺組織中MPO 活性均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見圖3。
圖3 4 組小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平和肺組織中MPO 活性比較(A:4 組小鼠肺泡灌洗液中IL-6 水平比較;B:4 組小鼠肺組織中MPO 活性比較)
2.4 4 組小鼠肺組織中p-p65 蛋白表達水平比較 與NT 組比較,LPS 組小鼠肺組織中p-p65 蛋白表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與LPS 組比較,LPS+Ery 組小鼠肺組織中p-p65 蛋白表達水平下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4。
圖4 4 組小鼠肺組織中p-p65 蛋白表達水平比較(A:蛋白表達的電泳圖;B:蛋白表達水平比較)
2.5 Ery 與p65 蛋白的分子對接模擬 應用生物信息學技術(shù)將Ery 分子與NF-κB p65 蛋白進行對接模擬,結(jié)果顯示Ery 和p65 蛋白的結(jié)合能為-2.18 kcal/mol,結(jié)合能<0,差異有統(tǒng)計學意義,且Ery 與p65 蛋白的氨基酸殘基ARG-246、GLN-247 具有氫鍵相互作用,見圖5(插頁)。
圖5 Ery 與p65 蛋白的分子對接模擬
ALI 是一種危重的臨床綜合征,臨床表現(xiàn)為重度呼吸困難、呼吸急促、氧療難治性發(fā)紺、肺順應性降低及胸部X 線表現(xiàn)為彌漫性肺泡浸潤[6]。導致ALI 的因素有很多,可由肺炎、誤吸等肺內(nèi)因素,也可由膿毒癥、創(chuàng)傷等肺外因素引起,而肺炎是其最常見最直接的致病因素[2]。研究表明,革蘭陰性菌感染是ALI 最重要的原因之一,LPS 是革蘭陰性菌外膜的主要成分,可導致肺損傷和炎癥反應[7]。鼻內(nèi)滴注LPS 常用于構(gòu)建ALI 模型,可有效誘導中性粒細胞炎癥反應,加重肺組織損傷。因此本研究采用該造模方法,成功構(gòu)建了ALI 模型。
ALI 的發(fā)病機制復雜[1],治療手段有限。目前臨床上治療主要以機械通氣為主,但不恰當?shù)臋C械通氣也可加速急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)展和惡化。因此,尋找有效治療ALI 的藥物至關(guān)重要。天然產(chǎn)物由于其易獲得、不良反應小且具有廣泛的藥理活性等優(yōu)點,近年來備受關(guān)注。Ery 是一種具有多種生物功能的多元醇甜味劑,天然存在于水果(如葡萄)、蔬菜(如蘑菇)及發(fā)酵食品(如醬油)等食物中[8],目前,Ery 已由FDA批準作為甜味劑使用[9]。研究顯示,Ery 參與人體的代謝過程[4],也可以通過調(diào)節(jié)固有免疫,降低代謝紊亂,改善高脂飲食引起的小腸炎癥[5]。但目前為止,Ery 是否對ALI 有緩解作用尚未見報道。
當ALI 發(fā)生時,可導致肺組織的間質(zhì)水腫、中性粒細胞的聚集及肺泡上皮損傷,破壞正常的生理結(jié)構(gòu),從而影響其生物學功能。本研究通過肺組織病理切片評估肺損傷的嚴重程度,通過濕/干比值評估肺水腫的情況,結(jié)果顯示,Ery 可以有效緩解LPS 誘導的小鼠ALI 肺組織的損傷程度,顯著抑制肺水腫程度。以上結(jié)果表明,在ALI 中,Ery 可以通過減輕肺組織水腫程度發(fā)揮保護作用。
研究表明,當出現(xiàn)炎癥反應或創(chuàng)傷應激時,炎癥通路被激活,炎癥反應可以清除病原體,但過度的炎癥反應會導致肺泡損傷,炎癥介質(zhì)是炎癥的主要效應物,炎癥因子將大量炎癥細胞募集到受損組織中,大量中性粒細胞聚集,釋放活性氧,造成肺間質(zhì)和肺實質(zhì)損傷,最終導致呼吸衰竭,甚至全身性炎癥反應[10]。MPO 是中性粒細胞聚集的主要標志,可用于評估中性粒細胞在組織中的浸潤程度,抑制MPO 活性可有效減輕炎癥反應。本研究結(jié)果顯示Ery 預處理后,MPO 活性顯著降低,緩解了ALI 小鼠肺組織中性粒細胞的浸潤程度。當炎癥反應發(fā)生時,炎癥信號通路被激活,IL-6 的表達增高[10]。本研究通過測定小鼠肺泡灌洗液中IL-6 的表達情況評估肺損傷炎癥反應的嚴重程度,結(jié)果顯示,Ery 顯著抑制了IL-6 的表達,減輕了ALI 小鼠炎癥反應的嚴重程度。因此,在LPS 誘導的ALI 小鼠模型中,Ery 可能通過抑制炎癥反應發(fā)揮保護作用。
本研究進一步探討了Ery 對ALI 的潛在機制。NF-κB 是經(jīng)典的炎癥信號通路,參與ALI 的形成,p65是該信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點信號。在正常生理狀態(tài)下p65 蛋白與IκB 蛋白處于集合狀態(tài);當炎癥發(fā)生時,p65 蛋白轉(zhuǎn)位進入細胞核并結(jié)合在促炎癥基因表達的啟動子上促進炎癥因子釋放,加劇炎癥反應,進而參與ALI 的形成。有研究指出p65 蛋白的磷酸化加劇了ALI 的嚴重程度,而有效抑制p65 蛋白的磷酸化則緩解了炎癥介質(zhì)的釋放進而從減輕炎癥的角度緩解了ALI的發(fā)生、發(fā)展[11]。結(jié)合以上研究思路,本研究探究了Ery 是否可以通過抑制NF-κB-p65 蛋白的磷酸化,實驗結(jié)果表明,LPS 刺激顯著增加了p65 的磷酸化水平,Ery 可以逆轉(zhuǎn)LPS 誘導的p65 的磷酸化,從而發(fā)揮抗炎作用。同時,為了解Ery 與NF-κB 作用的潛在對接位點,本研究應用AutoDock 工具及PyMOL 軟件進行分子對接,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ery 和p65 蛋白的結(jié)合能為-2.18 kcal/mol,并且Ery 與p65 蛋白的氨基酸殘基ARG-246、GLN-247 具有氫鍵相互作用,上述結(jié)果表明Ery 與p65具有較強的結(jié)合作用,進一步驗證了Ery 和p65 信號的抑制作用。說明Ery 抑制了NF-κB 相關(guān)信號通路,這揭示其可能與p65 蛋白存在相關(guān)作用,并抑制NF-κB信號通路。
綜上所述,Ery 對LPS 誘導的小鼠ALI 具有保護作用,其潛在機制是Ery 通過抑制p65 信號的激活進而抑制炎癥反應,從緩解炎癥損傷和水腫的角度發(fā)揮了對ALI 的保護作用。Ery 可能成為治療ALI 的潛在藥物,但其在治療過程中發(fā)揮作用的代謝產(chǎn)物及機制有待深入的研究。