李 輝

(衡水學(xué)院濕地保護(hù)與研究中心，河北 衡水 053000)

衡水湖坐落于河北省衡水地區(qū)境內(nèi)，位于京津冀的生態(tài)敏感地帶，在防澇防旱、調(diào)節(jié)氣候、維護(hù)環(huán)境生態(tài)安全和保護(hù)生物多樣性等方面發(fā)揮著重要的作用[1]。同時(shí)，衡水湖是華北內(nèi)陸地區(qū)唯一保持水域、沼澤、灘涂、草甸和林地等完整的內(nèi)陸濕地生態(tài)系統(tǒng)，現(xiàn)有湖泊面積75km2，蓄水能力達(dá)到1.88億m3[2]。衡水湖是聯(lián)結(jié)印度洋、南亞大陸、東亞和西伯利亞生物多樣性的中心點(diǎn)，是北溫帶野生動(dòng)物的聚集地，其獨(dú)特的水文、土壤和氣候孕育了復(fù)雜且完善的動(dòng)植物群落，衡水湖位于“東亞-澳大利西亞”遷徙路線的中心部位，是數(shù)百萬只候鳥重要的停歇地、中轉(zhuǎn)站和密集交匯區(qū)[3]。衡水湖蘊(yùn)藏著巨大的生態(tài)效益、社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益[4]。

微生物參與濕地生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，是濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分[5]。微生物的代謝不僅改變濕地土壤的理化性質(zhì)，而且能夠在降解有機(jī)質(zhì)，產(chǎn)生和傳遞能量，促進(jìn)地球元素循環(huán)等方面起著非常重要的作用[6]。濕地微生物多樣性的高低直接決定著濕地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[7]。近年來，國內(nèi)對(duì)天然濕地土壤微生物的研究較多，而對(duì)人工濕地，尤其是針對(duì)衡水湖國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)有關(guān)微生物多樣性的研究幾乎沒有。本文選取衡水湖濕地國家自然保護(hù)區(qū)中荷花公園區(qū)域的土壤為研究對(duì)象，采集不同位點(diǎn)的土樣，采用高通量測(cè)序的研究方法，通過對(duì)濕地土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析，旨在揭示衡水湖濕地荷花公園區(qū)域土壤細(xì)菌群落的多樣性，為今后衡水湖濕地土壤微生物的合理開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2020年10月圍繞衡水湖濕地荷花公園選取5個(gè)采樣點(diǎn)，在各個(gè)采樣點(diǎn)分別采集表層0～5cm和5～10cm的土樣，每個(gè)采樣點(diǎn)取4個(gè)平行樣并混合均勻，將混合均勻的樣品裝入滅過菌的自封袋內(nèi)并盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱保存。

1.2 衡水湖濕地荷花公園土壤微生物組成多樣性測(cè)序

采用FastDNA? Spin Kit for Soil(MP Biomedicals 美國)總DNA提取試劑盒，對(duì)采集的樣品進(jìn)行總DNA提取。利用PCR擴(kuò)增細(xì)菌古菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)域，擴(kuò)增引物 338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)；PCR擴(kuò)增體系95℃ 3min；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 45s，30次循環(huán)；72℃ 10min。高通量測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在Miseq PE300/NovaSeq PE 250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序完成。所得的測(cè)序數(shù)據(jù)通過Excel和R語言以及美吉云平臺(tái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 衡水湖濕地荷花公園5個(gè)土壤樣品的物種分類學(xué)分析

本研究共5個(gè)樣品，對(duì)其細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序共獲得226103對(duì)reads，對(duì)所得序列進(jìn)行OTU劃分，共得出4359個(gè)OTU，再對(duì)97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，5個(gè)樣品中共得出2個(gè)Domain，2個(gè)Kingdom，60個(gè)Phylum，166個(gè)Class，371個(gè)Order，623個(gè)Family，1105個(gè)Genus，1886個(gè)Species。由表1可知，5個(gè)樣品中發(fā)現(xiàn)的OUT數(shù)分別為1683個(gè)、3132個(gè)、2171個(gè)、2765個(gè)和1297個(gè)。5個(gè)樣品中a2和a5發(fā)現(xiàn)的物種數(shù)較多，分別為1325個(gè)和1316個(gè)，a3和a1物種數(shù)相對(duì)少些，分別為1093個(gè)和1001個(gè)，a7樣本中的物種數(shù)最少，為866個(gè)。由此可見，5個(gè)樣品土壤中物種分類學(xué)上存在明顯差異，這說明衡水湖荷花公園土壤的微生物多樣性比較高。

表1 不同土壤樣品的物種分類學(xué)分析

2.2 衡水湖濕地荷花公園5個(gè)土壤樣品稀釋曲線分析Alpha多樣性分析

利用MiSeq平臺(tái)對(duì)采集的5個(gè)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，5個(gè)樣品的覆蓋率均在97%以上，見表2，且每個(gè)樣品的稀釋曲線基本上接近飽和，見圖1，表明測(cè)序深度基本達(dá)到飽和，說明當(dāng)前測(cè)序量下能夠真實(shí)地反映樣品土壤細(xì)菌古菌的alpha多樣性。由表2可知，a2樣品的sobs指數(shù)、ace指數(shù)、bootstrap指數(shù)和chao指數(shù)均高于其他4個(gè)樣品，這表明a2樣品土壤中細(xì)菌古菌群落豐富；shannon指數(shù)值越大，微生物群落多樣性越高，simpson指數(shù)值越小，微生物群落多樣性越高，a2樣品shannon指數(shù)值最大，simpson指數(shù)值最小，pd指數(shù)最大，表明該樣品土壤中細(xì)菌古菌群落多樣性高于其他4個(gè)樣品；shannoneven指數(shù)和simpsoneven指數(shù)反映微生物群落的均勻度，a2樣品和a5樣品中細(xì)菌古菌群落的均勻度明顯高于其他3個(gè)樣品。

表2 不同土壤樣品Alpha多樣性分析

圖1 不同土壤樣品稀釋曲線分析

2.3 衡水湖濕地荷花公園5個(gè)土壤樣品細(xì)菌古菌群落heatmap圖

將衡水湖濕地荷花公園不同土壤樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對(duì)，并分析不同分類水平上的細(xì)菌古菌群落結(jié)構(gòu)組成。在門水平上，選取總豐度前50的物種繪制heatmap圖，見圖2，由圖2可知，衡水湖濕地荷花公園土壤中細(xì)菌古菌群落結(jié)構(gòu)在門分類水平上具有較高的多樣性，不同樣品之間細(xì)菌古菌組成差異不大，但相對(duì)豐度差異很大。優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(Proteobacteria)18%～35%、放線菌門(Actinobacteriota)6%～21%、擬桿菌門(Bacteroidota)3%～18%、綠彎菌門(Chloroflexi)4%～18%、厚壁菌門(Firmicutes)1%～7%、浮霉菌門(Planctomycetota)1%～13%、酸桿菌門(Acidobacteriota)4%～9%、疣微菌門(Verrucomicrobiota)1%～6%、泉古菌門(Crenarchaeota)2%～5%、脫硫桿菌門(Desulfobacterota)1%～7%等[8，9]。在大多數(shù)的濕地土壤樣品中，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和綠彎菌門等為優(yōu)勢(shì)菌門[10]。有研究表明，變形菌門中含有多種反硝化細(xì)菌，可進(jìn)行自養(yǎng)和異樣；對(duì)土壤中的含氮物質(zhì)的循環(huán)起著主要作用[11，12]。據(jù)報(bào)道，Chloroflexi種類形態(tài)多樣，營養(yǎng)方式和代謝途徑十分豐富，可存活于多種環(huán)境中，并且其多數(shù)種類參與了C、N、S等一系列重要元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程[13]。在a2、a3和a5樣品土壤中，Chloroflexi相對(duì)豐度在11%～19%以上，而在a1和a7樣品土壤中，Chloroflexi相對(duì)豐度在4%～6%，造成這種差距的原因，可能是由于a1和a7采樣點(diǎn)是近水邊裸露的土壤，而a2、a3和a5采樣點(diǎn)是水邊覆蓋著植物殘?jiān)暮谏寥?。由此可見，Chloroflexi的物種豐度可能與衡水湖濕地荷花公園的周邊環(huán)境有關(guān)，從而成為衡水湖濕地荷花公園土壤中的第四大優(yōu)勢(shì)菌門。有報(bào)道稱，酸桿菌門是重要的根際細(xì)菌[14]。在a2、a3和a5樣品土壤中，Acidobacteriota相對(duì)豐度在4%～10%，而在a1和a7樣品土壤中，Acidobacteriota相對(duì)豐度均低于1%，這可能是因?yàn)閍2、a3和a5采樣點(diǎn)均有植被覆蓋。

注：橫坐標(biāo)為樣本名(或分組名)，縱坐標(biāo)為物種名，通過色塊顏色梯度來展示樣本中不同物種的豐度變化情況，圖中右側(cè)為顏色梯度代表的數(shù)值。

3 結(jié)論

本研究共檢測(cè)出60個(gè)門166綱371目623科1105屬1886種，共計(jì)4359個(gè)OUT。由alpha多樣性可知，a2樣品土壤中細(xì)菌古菌群落的豐富度和多樣性高于其它4個(gè)樣品，a2和a5樣品土壤中細(xì)菌古菌群落的均勻度明顯高于其它3個(gè)樣品。衡水湖濕地荷花公園土壤中細(xì)菌古菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上相差不大，但物種相對(duì)豐度差異大。衡水湖濕地荷花公園土壤的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(Proteobacteria)18%～35%、放線菌門(Actinobacteriota)6%～21%、擬桿菌門(Bacteroidota)3%～18%、綠彎菌門(Chloroflexi)4%～18%等。